miR-3187-5p与冠状动脉旁路移植术后心房颤动关系的前瞻性队列研究

　　术后心房颤动（postoperative atrial fibrillation，POAF）指术前无心房颤动（atrial fibrillation，AF）发生，在术后新出现的AF[]。POAF为冠状动脉旁路移植术（coronary artery bypass grafting，CABG）常见的并发症之一，发生率为30%～40%[-]，多发生于术后 2～4 d，且7 d后几乎不发生[]。发生 POAF 的患者卒中和死亡风险分别为未发生 POAF 患者的5倍和2倍[]。目前对于POAF的发生机制尚未完全研究清楚[]，因此目前缺乏有效预防POAF的措施[]。

　　近年来，研究[]发现miRNA可能与POAF的发生有关。miRNA是长度15～23个核苷酸的单链非蛋白编码核糖核酸，能与靶基因的3'端非翻译区域（3'UTR）互补结合，通过抑制信使RNA（message RNA，mRNA）翻译或促进 mRNA 降解来负性调节基因表达。近年来有研究[]发现miRNA可以影响胶原代谢，调控成纤维细胞的增殖分化，进而在心脏结构重构和AF发生中起关键作用。虽然目前已有研究探讨miRNA的表达与POAF的关系，但研究结论并不一致。Feldman等[]发现与未发生POAF相比，POAF组患者血液中miR-1降低，但差异无统计学意义。Tsoporis等[]则发现POAF组患者组织中miR-1显著升高。此外，大多数研究是从血液样本着手，反映的是全身病理生理变化，忽略了手术所致心脏局部环境的改变对POAF发生的影响。既往研究[]及本团队前期研究发现CABG术后心包引流液的改变可能在POAF的发生中起着更为关键的作用。

　　本研究团队前期通过前瞻性队列研究，收集并分析CABG术后发生POAF和未发生POAF患者的心包引流液，进行miRNA测序分析，发现miR-3187-5p的表达水平在POAF组和非POAF（non-POAF）组差异显著（FC=1.35，P=0.0002）。基于此结果，我们认为miR-3187-5p可能与POAF的发生有关。miR-3187-3p被认为参与调控胶原代谢通路TGF-β和Wnt[]，而纤维化所致心房结构重构被认为是POAF发生的易感基质[]。既往研究中，关于miR-3187-5p的报道较少。Gao等[]发现在心血管疾病患者血液中miR-3187-5p下调。关于miR-3187-5p与POAF的关系，既往文献未见报道。因此，基于前期研究结果，本研究拟通过前瞻性队列研究探讨miR-3187-5p与POAF的关系，以期为POAF的发生机制探讨提供新思路，并为临床POAF的精准预测和预防提供研究基础。

　　本研究为前瞻性队列研究。利用方便抽样选取于2022年3—5月在北京朝阳医院心脏中心行CABG手术的冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）患者。冠心病的诊断标准：冠状动脉造影检查发现心外膜下冠状动脉直径狭窄＞50%，并且患者有典型性心绞痛症状或无创性检查显示有心肌缺血证据[]。纳入标准：年龄>18岁；行 CABG 术；无既往AF史，术前心电示波为窦性心律。排除标准：先天性心脏病史，心肌病；术前严重感染、电解质紊乱、严重的肝肾功能不全；术后住院期间死亡；合并有严重影响预后的疾病；标本采集及研究过程中拒绝配合。根据术后是否发生POAF，将患者分为 POAF 组和non-POAF组。

　　仪器和设备包括：PCR扩增仪（日本TakaRa公司），7500 Real-Time PCR System （美国 ABI 公司），超净工作台（中国苏净集团），低温高速离心机（德国 Eppendorf 公司），涡旋振荡器（美国 Scientific Industries 公司），10 μL、200 μL、1 000 μL单道手动移液器（德国 Transferpette 公司），无线心电监护（上海微创公司）。

　　（1）收集及处理血样：当患者从手术室返回ICU即刻，研究者通过患者置入的动脉导管抽取动脉血样。收集方法：用 10 mL 无菌注射器采集动脉血10 mL，置于EDTA抗凝管中。处理方法：在室温下放置30 min后，4℃，3 000 r/min离心15 min，取上清液，在?80℃冰箱中保存。

　　（2）收集及处理引流液样本：当患者从手术室返回ICU即刻，研究者在严格无菌操作下采集心包引流液样本（患者均术中留置心包纵隔引流管，连接引流瓶）。采集方法：用安尔碘消毒引流瓶的瓶口及瓶颈，打开EDTA抗凝管盖，将引流液从瓶口注入抗凝管。处理方法同上。

　　采用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）方法检测外周血和引流液中miR-3187-5p的含量，所用试剂盒为TB Green? Advantage? qPCR Premix（TaKaRa，日本），所用引物（北京诺赛基因组研究中心有限公司）序列（Forward）为5'-CCTGGGCAGCGTGTGGCTGAAGG-3'。

　　患者术后采用24 h动态心电监护仪和无线心电监护进行心电监测。研究人员每日上午10点到心外科ICU查看动态心电图监测中过去24 h的心电图，术后5 d摘取无线心电图监测记录，同时结合护理记录和病历确定是否发生 POAF。有10年以上AF诊断经验的2名医务人员根据24 h心电图记录判定是否发生POAF。如果有分歧，与第3位上级医生联合进行重新评估。

　　为了降低miR-3187-5p靶基因预测结果的假阳性，采用Targetscan（http://www.targetscan.org/）、miRWalk（http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/）和miRDB（http://www.mirdb.org）3个在线软件预测miR-3187-5p的靶基因，用软件Veney（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/Venny/index.html）绘制韦恩图，得到3个数据库预测结果的交集，然后集合miRTarbase数据库（http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/）中经试验验证的靶基因组成下一步分析的基因集合。将预测到的靶基因利用 STRING数据库（https://>string-db.org/）构建miRNA潜在靶点蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络图，采用 Cytoscape 3.9.1 软件进行可视化分析。利用软件 R 4.2.0、KEGG数据库进行预测靶基因的GO功能富集分析和KEGG信号通路富集分析（http://www.genome.jp/KEGG/）。R包：主要为clusterProfiler 包（3.14.3版本，用于分析数据）。

　　采用自行设计的资料收集表收集可能与 POAF 发生相关的资料，包括入组患者的术前、术中及术后3个时间段资料。具体观察内容如下：（1）基本资料：姓名、性别、年龄、身高、体重、体重指数（body mass index，BMI）、吸烟史、本次入院诊断。（2）临床资料：疾病史，包括心脏病史、高血压病史、糖尿病史、高血脂症病史、脑血管病史、慢性阻塞性肺病病史、肾病史；纽约心脏协会（New York Heart Association，NYHA）心功能分级；心脏手术史；用药史；冠状动脉病变情况；超声心动图表现，包括左右心房上下径及左右径、左室舒张末期内径、左室收缩末期内径、左室射血分数、舒张早期与舒张晚期心室充盈速度最大值之比；手术情况，包括手术时间、术式、冠状动脉血管搭桥支数、受体血管、术中出血量、术中输血量、术中除颤情况、主动脉内球囊反搏使用情况；术后情况，包括术后用药、术后机械辅助通气时间。（3）血化验监测结果：白细胞计数、中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、血肌酐、血尿酸、血尿素、肌酸激酶同工酶（creatine kinase-MB，CK-MB）、心肌肌钙蛋白I（cardiac troponin I，CTNI）、脑利钠肽、同型半胱氨酸、超敏C-反应蛋白、糖化血红蛋白。（4）术后0～6 h、6～24 h、24～48 h心包引流量。

　　（1）术后0 h外周血和心包引流液中miR-3187-5p水平：术后0 h定义为患者从手术室返回ICU的即刻。（2）POAF 结局：患者是否发生POAF、POAF 首发时间、终止方式。POAF 的诊断标准为心电图表现为标准 12 导联心电图记录≥30 s或单导联心电图示 AF 心律，无明显重复的P 波和RR间期不规则（房室传导未受损时）可诊断为临床AF[]。（3）临床结局：是否发生心肌梗死、卒中、术后感染、急性肾功能损害、死亡、二次开胸、谵妄。

　　所有数据使用 SPSS 26.0 统计分析软件进行统计学分析。正态分布的计量资料采用均数±标准差（±s）描述，组间比较采用独立样本t检验。非正态分布的计量资料采用中位数（上下四分位数）［M（P25，P75）］表示，组间比较采用秩和检验。计数资料采用频数描述，组间比较采用Fisher确切概率法。单因素分析中P≤0.05的变量及有临床意义的变量纳入 logistic 回归分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

　　本研究已通过首都医科大学医学伦理委员会审查（2022sy067）。研究按照世界卫生组织《赫尔辛基宣言》制定的道德标准，所有入选患者在研究前均对研究知情同意，告知术后需采用24 h动态心电检查持续监测，并采集血样及心包引流液标本用于研究。同时，本研究对所有研究中的临床资料坚持严格保密原则。

　　本研究共纳入15例患者，其中男9例、女6例，平均年龄（65.6±8.2）岁，其中6例术后出现AF，9例未出现AF，POAF的发生率为40.0%。POAF首发时间为术后2.7～82.5（37.5±32.2）h。两组患者一般资料分析发现，POAF组患者三尖瓣轻度反流比例显著高于non-POAF组（P=0.041）。两组其余基线资料差异均无统计学意义；见。

　　POAF组手术时间、术后1 d的CK-MB和CTNI、术后0～6 h和24～48 h心包引流液量高于non-POAF组，差异有统计学意义（P>0.05）。本研究中，无患者发生术后心肌梗死、卒中、术后感染、急性肾功能损害、死亡、二次开胸。两组患者术中及术后资料见。

　　本研究检测了术后0 h外周血液及心包引流液中miR-3187-5p水平，结果发现，POAF组心包引流液中miR-3187-5p水平显著高于non-POAF组（P=0.012），而在外周血中二者差异无统计学意义（P=0.797）；见。

　　筛选单因素分析中P≤0.05及有临床意义的变量进行logistic回归。P≤0.05的变量包括三尖瓣反流、手术时间、术后1 d CK-MB和CTNI，术后0～6 h和24～48 h引流液量、术后0 h心包引流液中miR-3187-5p水平。但由于术后0～6 h引流液量与术后24～48 h引流液量具有强相关性，二者只能选择其一进入方程。本研究选择与POAF相关性更强的术后24～48 h引流液量进入二元logistic回归分析。此外，考虑到临床实际应用意义，对于术后0 h心包引流液miR-3187-5p以及术后24～48 h引流液量，我们采用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线确定其最佳截断值，将两个连续变量转化为分类变量进入多元回归（ROC结果：术后24～48 h引流液量≥260 mL，miR-3187-5p相对表达量≥2.11为最佳临界值）。基于以上考虑，最终进入多元回归的变量为分类变量：三尖瓣反流、术后24～48 h引流液量≥260 mL、miR-3187-5p相对表达量≥2.11，以及连续变量：手术时间、术后1 d CK-MB和CTNI。结果显示，miR-3187-5p相对表达量≥2.11是CABG术POAF的独立预测因子。单因素以及多因素logistic回归结果见。该预测模型的Cox & Snell R2=0.433，Nagel kerke R2=0.585，曲线下面积（area under the curve，AUC）为0.861，特异度、灵敏度分别为88.9%、83.3%；见。

　　利用 Targetscan、miRWalk和miRDB软件分别预测到1204、17111和811个miR-3187-5p的靶基因，取3者的交集，获得201个共有靶基因。miRTarbase数据库中经试验验证的靶基因有1519个，合并后共得到1642个基因集合用于后续富集分析。

　　将预测到的miR-3187-5p的1642个靶基因导入STRING数据库平台，选择物种为人类，获取PPI关系，采用Cytoscape 3.9.1 软件进行可视化分析。利用 Cytohubba 插件计算PPI网络中每个基因的节点度（Degree），其中颜色越深对应的Degree值越大（由于基因数众多，选择Degree值前150的基因作图）。Degree值排名前10位的基因分别为MRTO4、WDR43、IMP4、NAT10、DIEXF、RRP12、GNL3L、KCTD19、RBM19、HEATR1，其中大多与细胞增殖相关；见。

　　针对1642个miR-3187-5p靶基因进行GO功能富集分析，发现靶基因在细胞组分方面富集于β-连环蛋白TCF复合物；在分子功能方面富集于β连环蛋白结合、MAP激酶支架活性；在生物学过程方面富集于Ras蛋白信号传导、MAPK级联调节、JAK-STAT级联的负调控、SMAD蛋白信号传导（P值均＜0.05）；见。进一步进行KEGG信号通路富集分析发现靶基因在多个与心肌胶原代谢相关的信号通路如MAPK、Wnt、TGF-β、JAK/STAT信号通路中富集（P值均＜0.05）；见。

　　另外，将基因归类发现，在GO功能分析及KEGG信号通路富集分析中，miR-3187-5p能够调控TGF-β信号通路上的关键抑制型分子SMAD6、TGIF2、FMOD、NBL1、ACVR2A；MAPK信号通路上的关键抑制型分子AKT2、PTPN5；以及Wnt信号通路上的关键抑制型分子CtBP1、Rspo3、Rspo4、CTNNBIP1、SFRP1；见。

　　本研究首次对miR-3187-5p与CABG术后POAF的关系进行了初步探讨，发现POAF组患者术后0 h心包引流液中miR-3187-5p水平显著高于non-POAF组，验证了前期miRNA测序结果。miR-3187-5p可能通过调控TGF-β、MAPK、Wnt信号通路调节术后心房胶原代谢，进而参与POAF的发生。

　　POAF是CABG术后常见的心律失常并发症，既往文献[-]报道发生率为30%～40%，本研究中POAF发生率也为40%。本研究收集了来自外周血和心包引流液不同来源的样本，较为全面地分析了CABG术后0 h miR-3187-5p 的空间分布规律及其与POAF发生的关系；并通过生物信息学分析，初步探讨了miR-3187-5p参与POAF发生的可能机制。本研究作为大型前瞻性研究的前期初步探索，为后期临床研究的开展提供了基础和方向。

　　本研究首次发现POAF组患者术后0 h的心包引流液中miR-3187-5p水平显著高于non-POAF组。在进一步控制混杂因素后，心包引流液中的miR-3187-5p在本研究只有15例样本的情况下，仍然呈现很强的预测性，单个因子对于POAF的预测能力高达86.1%。既往研究[,]发现在心血管疾病患者和非小细胞肺癌患者血液中miR-3187-5p下调；miR-3187-3p则在非小细胞肺癌患者血液中上调[]，在增生性瘢痕成纤维细胞中下调[]。然而目前关于心包引流液中miR-3187-5p水平及其与POAF的关系，既往研究尚无报道。

　　本研究发现相对于心包引流液，两组间血液中的miR-3187-5p水平相差不大。一方面，可能与本研究样本量少，检测效能较低有关。另一方面也说明，相对于手术后全身系统性的病理生理变化，心脏局部的病理生理变化可能更能反映POAF的发生机制。心包引流液主要是手术后心脏和胸腔渗血或渗液及淋巴液，其主要反映了手术后心脏局部的病理生理变化[]。所以心包引流液中的因子水平相对于血液中因子的水平更能代表心脏局部的变化，从而更能反映心房在遭受了手术创伤后所发生的变化。本研究在小样本的情况下，发现了心包引流液中，而非外周血液中的miR-3187-5p对POAF的影响，进一步说明了手术带来的心房局部病理生理变化是POAF发生的重要触发机制。

　　目前对于miR-3187-5p研究较少，对于其上游通路相关文献未见报道。本研究采用TransmiR v2.0，对miR-3187-5p上游的转录因子进行预测，发现ERG、EZH2、KDM2B、LARP7等转录因子调控miR-3187-5p的表达，但此发现需要进一步通过双荧光素酶检测等方法进行实验验证。关于miR-3187-5p的下游通路，本研究采用生物信息学分析发现，miR-3187-5p可能通过调控TGF-β、Wnt及MAPK等信号通路上的关键分子进而调控CABG术后早期胶原代谢，参与POAF的发生。

　　TGF-β是纤维化形成的重要因素之一，而SMAD信号转导通路是TGF-β发挥重要作用的主要支路[]。通过生物信息学分析发现miR-3187-5p负调控TGF-β通路的抑制型转录调控因子SMAD6[]、ACVR2A、FMOD、TGIF2和NBL1。miR-3187-5p通过负调控作用，削弱抑制因子对TGF-β信号通路的抑制作用，进而促使术后早期心肌胶原合成增加。

　　在MAPK信号通路中，ERK1/2 是 MAPK 家族的关键激酶之一，活化的 ERK1/2 可使一系列转录因子磷酸化以调控相关肥大基因的表达，从而促进心肌肥厚，其主要通过Ras-RAF-MEK-ERK 级联激活发挥作用[]。miR-3187-5p在Ras-RAF-MEK-ERK中，负调控抑制型分子PTPN5、AKT2，促使ERK表达，从而促胶原代谢失衡。

　　Wnt 信号通路的激活是纤维化疾病的共同特征，β联蛋白在细胞中持续积累通过 Wnt 信号通路激活成纤维细胞，促进成纤维细胞增殖以及胶原纤维的分泌[]。miR-3187-5p则在Wnt信号通路中负调控抑制型因子SFRP1、CtBP1、Rspo3、Rspo4、CTNNBIP1，抑制其阻碍Wnt被激活后信号传导的作用，进一步使β联蛋白持续累积，促使纤维细胞增殖和胶原纤维分泌。

　　此外，我们进一步构建了 miR-3187-5p 靶基因所编码蛋白质之间的相互作用网络，发现节点度排名前10位的基因中NAT10、RRP12、GNL3L、RBM19、HEATR1曾被报道参与细胞增殖的过程[-]。以NAT10为例，余程[]的研究发现在利用颈动脉球囊损伤构建血管新生内膜形成的SD大鼠模型中敲除NAT10后，可抑制细胞增殖、迁移，促进细胞凋亡。miR-3187-5p 可能在手术带来的血管损伤触发的损伤-修复反应中负调控NAT10，进而促进心房局部成纤维细胞增加，促进胶原合成增加。

　　再者，本研究单因素分析结果显示相对于non-POAF组，POAF组三尖瓣反流患者比例更大、术后1 d CK-MB和CTNI值更高、术后0～6 h和24～48 h心包引流液量更多、手术时间更长，但由于本研究样本量较少，因此这些因素在回归方程中未能进入模型，但是可供今后大样本临床研究筛选危险因素时作为参考。三尖瓣反流与右心房结构改变相关，而心房重构是AF的关键病理基础[]。术后CK-MB和CTNI值高表示心肌损伤程度大，直接反映了手术对心脏损伤的程度，而术中心肌再灌注损伤与POAF发生有关[]。术后心包引流液量多的患者更易发生POAF这一结论也与本研究团队前期工作结论相符[]，引流量的增加可能由手术时间长、心脏应激性增加、术后液体不平衡所致，亦可反映手术损伤程度。心肌受损程度曾被报道与POAF的发生有关[]。CABG手术时间与POAF发生的关系尚未有明确报道，推测其可能为主动脉交叉夹钳时间延长所致，而这一因素是较为明确的可能增加POAF发生率的因素[]。

　　本研究存在几点局限性。一是未检测基线血液中miR-3187-5p水平，因此不能排除基线差异对于结果的影响，将在未来研究中进行弥补。二是，本研究对miR-3187-5p的信号通路进行了生物信息学分析与预测，发现其通过调控TGF-β等通路参与POAF的发生，尚未开展动物实验对通路进行验证，但本研究结果可对后期的通路研究提供方向与基础。三是，本研究发现miR-3187-5p与POAF发生有关。但POAF发生机制复杂，已被证实与炎症反应、纤维化相关。因此，关于miR-3187-5p是否是POAF发生的关键分子，需要进一步开展细胞和动物实验，通过敲减或过表达miR-3187-5p，观察其对POAF发生情况的影响。四是，由于疫情管控原因，研究期间纳入患者较少，造成心房大小、三尖瓣反流、术后心功酶等可能对AF有影响的因素未能纳入模型。最终仅1个因素“术后0 h心包引流液miR-3187-5p水平≥2.11”具有预测价值。此结果一方面与样本量小有关，另一方面也反映了miR-3187-5p水平的强大预测能力。再者，本研究样本来自于同一家医院，影响研究结果的外推性，但本研究结果可为今后大样本、多中心研究提供研究方向。

　　本研究首次对CABG术后患者血液和心包引流液中的miR-3187-5p与POAF的关系进行了初步探索，并发现术后0 h心包引流液中的miR-3187-5p是一种潜在的、新型的、无创的POAF预测因子，其可能通过调控TGF-β、MAPK、Wnt信号通路进而促使CABG术后早期胶原代谢失衡，心房中胶原沉积增加，进而促使术后早期结构重构，导致POAF的发生。研究结果为POAF的发生机制探讨提供了新思路，并为临床POAF的精准预测和预防提供了研究基础。

　　利益冲突：无。

　　作者贡献：闫子伊负责数据收集与分析，论文撰写；赵海波、贺春岳负责数据收集与分析；刘溢思负责研究构思与设计，数据收集与分析，论文撰写与修订。