【转化医学研究】鼻咽癌吉西他滨加顺铂治疗后的肿瘤免疫微环境

　　这是一篇2023年4月发表于Nature Medicine的研究，第一作者单位是中山大学肿瘤防治中心。

　　文章亮点在于基于临床研究结果，首次阐明化疗后肿瘤微环境的变化，为后续的研究奠定基础。同时里面也非常详尽而系统地展示了单细胞测序与肿瘤微环境研究的研究方法，非常有借鉴意义。

　　吉西他滨加顺铂（GP）化疗是治疗鼻咽癌的标准疗法。然而，支撑其临床活性的机制尚不清楚。这里，利用单细胞RNA测序和 T细胞和B细胞受体测序，对匹配的、未接受治疗的和GP后的 化疗后的NPC样本（n = 15对），我们显示GP化疗 激活了以先天性B细胞（ILB）为主的抗肿瘤免疫反应。化疗所诱导的DNA片段激活了STING I型干扰素依赖的途径，以增加主要组织相容性 复合物I类在癌细胞中的表达，并同时通过Toll样受体诱导 ILB通过Toll样受体9信号传导。ILB通过ICOSL-ICOS轴进一步扩大滤泡辅助和辅助1型T细胞，随后在化疗后增强了三级淋巴器官样结构中的细胞毒性T细胞。化疗后，缺乏生殖中心的三级淋巴器官样结构中的细胞毒性T细胞。在一个接受GP化疗的鼻咽癌患者的3期试验中（NCT01872962，n = 139），ILB频率与总生存率和无病生存率呈正相关。在GP和免疫疗法联合治疗的鼻咽癌患者（n = 380）中，它也是一个预测有利结果的指标。总的来说，我们的研究提供了一个高分辨率的肿瘤免疫微环境图，并发现了以B细胞为中心的抗肿瘤免疫。我们还发现并验证了ILB是一种基于GP的鼻咽癌治疗的潜在生物标志物，这可以改善患者的管理。

　　越来越多的证据表明，化疗的疗效不仅涉及直接的细胞毒性作用，而且还依赖于同时激活抗肿瘤免疫反应1,2。虽然肿瘤特异性免疫的重要性已被强调，但临床上有效的化疗如何驱动微环境的线索和成分以引起最佳的抗肿瘤反应却不甚了解。已发表的调查化疗免疫调节作用的研究主要集中在化疗诱导的肿瘤抗原暴露或死亡细胞释放的危险信号，也称为免疫原性细胞死亡3。然而，简单地释放抗原或危险信号远不足以克服肿瘤的免疫规避；长期暴露于抗原甚至会导致免疫耐受4。成功的化疗诱导的抗肿瘤反应的免疫学变化还有待充分了解。此外，细胞尸体和死亡细胞的碎片预计会被树突状细胞（DCs）处理和呈现，以引起抗原特异性T细胞反应3。然而，这一过程需要有功能的DCs，而在肿瘤微环境的压力下，DCs往往是缺乏的或耐受性的5，在缺乏适配信号的情况下，抗原呈递最终会导致T细胞激活不足5。在现实世界的肿瘤学实践中，以DC为基础的治疗效果有限就证明了这一点6。此外，肿瘤免疫微环境（TIME）中的其他免疫成分也没有得到充分的探讨。最近的研究结果表明，除了分泌抗体外7,8，B细胞是抗原呈递细胞（APC），在肺癌中启动滤泡辅助T（TFH）细胞反应9。目前，关于B细胞是否能够触发抗肿瘤T细胞反应的数据很少，如果是的话，化疗如何改变B细胞的环境信号和功能表型。

　　吉西他滨（GEM）加顺铂（DDP）（即GP）方案是癌症治疗中广泛使用的化疗方案，包括肺癌、胰腺癌、乳腺癌和头颈癌。虽然GP对大多数癌症的疗效相当有限，但我们最近的试验表明，局部晚期鼻咽癌（NPC）患者对GP治疗反应良好，总反应率为94.5%，反应者的5年总生存率为89.7%10,11。鼻咽癌是最具侵袭性的头颈部癌症之一，具有向淋巴结和远处器官转移的高频率12，代表了一个合适的模型，以解决临床有效的化疗如何重塑TIME以引起最佳抗肿瘤反应和持久的肿瘤控制。

　　在这项研究中，我们全面地描述了鼻咽癌患者GP化疗后TIME的演变模式，并确定了以前未被认可的先天样B细胞（ILBs）在GP后主导抗肿瘤免疫反应。利用多学科方法，我们确定了ILBs的诱导及其与T细胞的功能交叉对话，显示出增强的抗肿瘤潜力，以及肿瘤细胞中主要组织相容性复合体（MHC）I类表达的同时增加。此外，ILBs是基于GP的鼻咽癌治疗的潜在生物标志物。总之，我们的研究为临床上高效的GP化疗提供了新的生物学见解，并将为癌症患者的个性化治疗策略提供参考。

　　我们首先分析了15名鼻咽癌患者在GP化疗前后30个匹配肿瘤样本中TIME的演变（Cohort_1, SYSUCC_E队列；扩展数据表1，扩展数据图1a,b，补充图1a,b，补充表1和方法）。使用10X Genomics Chromium液滴式单细胞RNA测序（scRNA-seq）的既定方案，我们获得了216,893个单细胞转录组（方法）。同时，构建了30个匹配样本中6个样本的单细胞T和B细胞受体测序（scTCR-seq和scBCR-seq）库（扩展数据图1a）。细胞被聚类为七个主要群体（图1a），根据其独特的基因图谱，可进一步分为86个亚群体（扩展数据图1c,d和补充图1c,d）。

　　一般来说，T细胞和B细胞在化疗前后构成了鼻咽癌样本80%以上的免疫成分（图1b）。值得注意的是，与相匹配的未接受治疗的样本相比，化疗后样本中的非浆液性B细胞明显增加（图1b）。进一步的原位染色证实了肿瘤中CD20+非浆液性B细胞的密度明显增加（扩展数据图2a）。相比之下，NPC样本中的T细胞和骨髓细胞的频率在化疗后并没有明显增加（图1b）。此外，单细胞分析13表明，癌细胞改变的轨迹从未治疗的样本中的高增殖细胞开始（群组0、3和4），后来在化疗时分化为两条轨迹；尽管一小部分细胞在选择压力下采用了纤毛细胞的特征（轨迹_II，群组_2和11），但主要细胞向轨迹_I分化（群组_1和12），其特征是抗原呈递分子的明显表达（图1c，扩展数据图2）。1c，扩展数据图2b和补充图2a,b）。一致的是，化疗后检测到MHC I类和抗原呈现基因的表达增加（扩展数据图2c）。进一步的FACS分析证实了新鲜样本中人类白细胞抗原（HLA）-A、HLA-B和HLA-C的增加，特别是在反应性肿瘤中（图1d）。同样，轨迹_I的特征与有利的预后明显相关（队列_2，SYSUCC_M队列，n = 150；图1e，扩展数据图2d，扩展数据表2和补充表2）。图1-1 | GP化疗重塑NPC的肿瘤微环境

　　a, 化疗前后30个匹配的鼻咽癌样本（Cohort_1）的216,893个肿瘤驻留细胞的单细胞聚类。显示主要细胞簇（左）、患者身份（中）和治疗状态（右）的均匀流形近似和投影（UMAP）图。 b，化疗后主要的免疫成分改变；上面的饼状图进一步显示其主要的亚型改变（n=15对）。 c，化疗前后30个匹配的NPC样本的6,546个肿瘤细胞的单细胞簇和化疗时肿瘤细胞簇的伪时间轨迹。显示肿瘤细胞簇的UMAP图（左）和轨迹推断图（右）。分支的轨迹用短箭头表示（右上），分支根据治疗状态用颜色编码（右下）。 d，化疗前后匹配的NPC肿瘤中肿瘤细胞MHC I类表达的FACS分析。代表图（左）和反应性和非反应性肿瘤中肿瘤细胞MHC I类表达的量化（右）显示。MFI，平均荧光强度。e, NPC患者DFS的Kaplan-Meier曲线，根据队列2中trajectory_I(Cluster_1)的标签分数的高低进行分层。根据中位表达值对患者进行了二分法划分。危险比（HRs）和95%的置信区间（CIs）是使用Cox回归模型计算的（通过log-rank检验的双侧P值）。 f，IFN-I相关途径在扩展数据图2c的匹配样本中的丰富程度。

　　我们接下来调查了MHC I类和抗原呈递基因在癌细胞中的增强表达。单细胞数据集显示I型干扰素（IFN-I）信号通路和对IFN-I通路的反应在化疗后的NPC样本中富集，MHC I类增加（图1f）。类似地，在图1d中MHC I类增加的样本中，化疗后肿瘤中的干扰素-β（IFNβ）的水平比匹配的治疗前的样本高三倍（图1g）。一致的是，我们观察到STAT1的明显激活（IFN-I的下游信号）（扩展数据图2e）。

　　然后，我们开始探究化疗引起的IFN-I信号传导是否有助于MHC I类和抗原呈递基因的上调。人鼻咽癌HK1和HONE1细胞系被GEM、DDP或GP联合治疗。接触GEM或DDP导致IFNβ的产生增加和STAT1的明显激活（图1h,i和扩展数据图2f,g）。正如预期，GEM和DDP的组合产生了协同效应（图1h,i和扩展数据图2f,g）。我们观察到在用GP处理的NPC细胞中，IFN信号相关的MHC I类和抗原呈递基因也有类似的变化（图1j和扩展数据图2h-k）。相反，这种处理并不影响与IFN信号无关的抗原呈递基因CANX的表达（扩展数据图2h,i,k）。值得注意的是，DDP和GEM都会导致DNA损伤14,15。事实上，化疗后样本中表达环状GMP-AMP合成酶（cGAS）的细胞与不表达cGAS的细胞相比，MHC I类分子和IFN-I信号的水平和对IFN-I信号的反应明显提高（补充图2c）。此外，在化疗后的NPC样本中，观察到DNA传感器STING的表达明显增加，STING的激活也得到加强，MHC I类增加（图1k和扩展数据图2l）。相应地，GP化疗协同触发了NPC细胞中STING-TBK1-IRF3途径的激活（图1l和扩展数据图2m）。我们进一步使用CRISPR-Cas9系统在HK1细胞中敲除STING，发现这种干预有效地废除了化疗诱导的IFNβ、随后的STAT1激活和MHC I类和抗原表达基因的升高（图1m和扩展数据图2n）。在STING敲除的HONE1细胞中也观察到类似的发现（扩展数据图2o-q）。我们进一步在STING敲除的HK1细胞中过表达STING，发现STING的过表达可以挽救IFNβ的产生（图1n）。因此，化疗可以通过STING依赖的IFN-I途径增强NPC细胞中MHC I类相关的抗原呈递机制。图1-2 | GP化疗重塑NPC的肿瘤微环境

　　g,k, 化疗后鼻咽癌样本中IFNβ（g）和磷酸化（p-）STING（k）的水平变化。h-j,l, IFNβ (h), p-STAT1 (i), MHC class I (j), and p-STING, p-TBK1 and p-IRF3 (l) 在用GEM, DDP或GP处理的HK1细胞中（48 h; n = 3）。m, IFNβ, p-STING和p STAT1在STING基因敲除的HK1细胞中，用或不用GP处理（48小时；n = 3）。 n, IFNβ, p-STING和STING在STING基因敲除的HK1细胞中，用转染所述质粒的GP处理（48小时；n = 3）。显著性是通过双侧配对样本t检验（b,d,f,g,k）或双侧单向方差分析（ANOVA），然后通过最小显著性差异（LSD）检验进行多重比较（h,j,m,n）。

　　化疗后癌细胞中MHC I类表达的增强，促使我们探索免疫微环境中CD8+T细胞亚群上TCR特性的改变。在CD8+T细胞中，共发现了14个独特的集群（图2a和补充图3a-c）。化疗后，天真样CD8+T（Cluster_0）、活化的CD8+T（Cluster_2）和两个细胞毒性T淋巴细胞（CTL）集群（Cluster_3和10）明显增加（图2a）。相比之下，衰竭的T细胞（Cluster_5）的百分比下降（图2a）。这种衰竭的CD8+T细胞的减少在原位得到进一步证实，特别是在反应性样本中（扩展数据图3a）。衰竭的CD8+T细胞中自我更新基因TCF7的表达增加，而衰竭标志物LAG3和HAVCR2的表达减少（扩展数据图3b）；这些改变与有利的化疗反应相关（扩展数据图3c）。为了支持我们的假设，CD8+TCR的特征在化疗后有了改变（扩展数据图3d），每个CD8+T细胞群都含有新克隆，尽管它们的频率不同（图2a）。值得注意的是，在化疗后的NPC样本中，新克隆构成了超过70%的衰竭CD8+T细胞（Cluster_5）（图2a），这表明新克隆可以在化疗后的NPC环境中经历早期激活和后续衰竭。与这一观察一致，化疗后的肿瘤裂解液比治疗前（Pr）的对应物能更有效地引发自体CD8+T细胞产生干扰素-γ（IFNγ）（图2b）。

　　有趣的是，与CD8+T相比，CD4+T细胞的TCR谱出现了更大的变化（扩展数据图3d），化疗后14个簇中的每个簇都含有超过90%的新克隆（图2c和补充图3d,e）。我们注意到，TFH（Cluster_6）和1型辅助（TH1）类T细胞（Cluster_7）的比例在化疗后有所增加，这两种细胞已被报道为维持CTL反应16,17（图2c）。FACS分析显示，化疗后反应者的NPC组织中IFNγ+TH1和CXCR5+TFH细胞都明显增加（扩展数据图3e,f和补充图4a,b）；原位多重免疫荧光证实，化疗后反应性肿瘤中TH1样和TFH细胞的绝对浸润密度（每平方毫米细胞）明显提高（扩展数据图3g,h）。与此相一致，化疗后从鼻咽癌肿瘤中分离出的CD4+T细胞有效地促进了自体CD8+T细胞的细胞毒性功能，而中和白细胞介素-21（IL-21）或阻断干扰素γ受体-1（IFNγR1）则极大地损害了这个过程（图2d和补充图3f,g）。相比之下，来自治疗前样本的CD4+T细胞几乎没有增强自体CD8+T细胞的细胞毒性（补充图3h）。在临床上，在NPC样本中，TH1样和TFH细胞与颗粒酶B（GZMB）+CD8+T细胞呈正相关（图2e）。生存分析表明，在单变量和多变量生存分析中，TH1样和TFH细胞优先与有利的预后相关（图2f和补充表3）。这些观察结果在SYSUCC_M队列中得到验证（扩展数据图3i,j和补充表4和5）。此外，调节性T（Treg）细胞的百分比在化疗后明显下降（图2c中的Cluster_0, 8, 12）。图2-1 | GP化疗引发类似TH1和TFH激发的CTL反应图2-2 | GP化疗引发类似TH1和TFH激发的CTL反应

　　a,c, 77,090个CD8+T细胞（a）和54,373个CD4+T细胞（c）的单细胞聚类，这些细胞来自化疗前后匹配的鼻咽癌样本（n = 15对）。显示CD8+和CD4+T细胞集群（左上）、治疗状态（右上）、化疗后成分改变（中间）和相应集群中新克隆的百分比（底部）的UMAP图。新克隆被定义为化疗后样品中才出现的CDR3序列。b，化疗后从鼻咽癌肿瘤中获得的肿瘤源性CD8+T细胞分别在化疗前和化疗后在培养基中培养或用25μg ml-1匹配的肿瘤质量裂解物刺激20小时，在1μg ml-1抗CD28抗体存在下。通过ELISpot检测IFNγ的水平。d, 在存在或不存在同型抗体、IL-21中和抗体或IFNγR1屏蔽抗体的情况下，将化疗后从NPC肿瘤中分离出的共8×104个肿瘤来源的CD8+T细胞加上25μg ml-1的肿瘤块裂解液单独培养或与自体肿瘤CD4+T细胞以1:1的比例共培养9天。通过FACS检测所述细胞因子和基因的水平。代表性的FACS图显示在补充图3f。e, 肿瘤浸润性TH1样细胞（x轴，左）、TFH细胞（x轴，右）和肿瘤浸润性GZMB+CD8+ CTLs（y轴）在原位NPC肿瘤中的频率的相关性。相关系数和双侧P值是用Spearman相关分析计算的。f, NPC患者的DFS的Kaplan-Meier曲线，按肿瘤浸润TH1样细胞（左）和TFH（右）的高（≥50%）与低（<50%）的百分比分层。HRs和95%CIs是用Cox回归模型计算的（通过log-rank检验的双侧P值）。显著性是通过双侧样本t检验（a,c）或双侧单因素方差分析，然后通过LSD检验进行多重比较（b,d）来确定。

　　我们接下来询问NPC微环境如何在化疗后促进效应性CD4+TH反应。髓系APCs是维持CD4+T细胞激活和分化的最有力的亚群18。然而，进一步的分析显示，骨髓类APCs的频率，包括典型的DCs（Cluster_4，5和9）和肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）（Cluster_1，7，10和11），在化疗后要么没有变化，要么甚至下降（图3a，扩展数据图4a和补充图5a，b）。同样，一个基于配体受体的算法19表明，DC2和/或TAMs与CD4+T细胞之间的相互作用得分在化疗后没有变化，甚至下降（扩展数据图4b）。一致的是，化疗后从肿瘤样本中分拣出的DC（肿瘤源性DC（tDCs））显示出诱导Treg细胞而不是触发TH1和TFH细胞的功能（图3b和补充图5c-e）。同样，化疗后肿瘤中骨髓类APCs的丰度也不能区分反应者和非反应者（图3c）。

　　上述结果促使我们进一步探索化疗后驱使效应性TH细胞的潜在因素。事实上，B细胞与CD4+TH细胞的相互作用得分高于髓系APC的相互作用得分（图3d），特别是与TFH和TH1样细胞（扩展数据图4c）。因此，B细胞的丰度与TH1、TFH和活化的TH亚群的百分比呈正相关，但不包括Treg细胞（扩展数据图4d）。然后，我们以单细胞分辨率剖析了不同的B细胞群（图3e和补充图5f,g），我们发现两个明显增加的B细胞群（Cluster_5和8），在治疗前的肿瘤中占肿瘤浸润性B细胞的7.3%，但在化疗后急剧增加到18.5%（扩展数据图4e）。图3-1 | ILB主导的抗肿瘤T细胞免疫的鉴定。

　　a，单细胞数据集中匹配的鼻咽癌样本在化疗前后骨髓APC亚群的改变构成（n = 15对）。b, 化疗后总共有1.6 × 105个肿瘤来源的T细胞在单独或混合培养基中培养。在培养基中单独培养或与自体TDCs以10:1的比例共培养数天。通过FACS检测TH1（9天）、TFH（3天）和Treg（6天）细胞的百分比。c, 在单细胞数据集中，化疗后肿瘤中DC2和TAM细胞的百分比在反应者和非反应者之间的比较（n = 15）。框图表示中位数（中心），第25和75百分位数（框的边界），以及最小和最大（须）。d, CD4+TH细胞和DC2、TAMs和B细胞之间的细胞-细胞相互作用组。e，来自匹配的鼻咽癌样本的51,352个B细胞的单细胞聚类。(n = 15对)在化疗前后的单细胞聚集。f，热图显示CD27、IGHD、IGHM、CD25、NR4A1和NR4A2在幼稚B、ILB、记忆B和血浆B细胞中的表达。

　　我们进一步调查了B细胞的Cluster_5和Cluster_8的表型特征。总的来说，这两个集群都显示出活化状态，CD25、NR4A1和NR4A2高表达（图3f）。有趣的是，与记忆型和血浆型B细胞相比，这些集群的VH区转录物的体细胞高突变（SHMs）明显较低（图3g），BCR的多样性较高（图3h），IGHD和IGHM的表达增加（图3f），表明这些细胞处于幼稚期。然而，与幼稚B细胞相比，这些集群表达的记忆细胞标记物CD27的水平更高（图3f）。这些数据表明，Cluster_5和Cluster_8共享一个CD27+IgD+IgM+先天性的表型20,21。使用CD27和IgD作为标记物（扩展数据图4f），我们证实化疗后NPC样本中ILB的频率（肿瘤浸润性B细胞的百分比）有所增加，尤其是在应答者中（扩展数据图4g，补充图4c和补充图5h）。同时，应答者化疗后血液中ILBs的频率也明显增加，尽管与TIME相比程度较低（扩展数据图4h和补充图4d）。

　　已经证明ICOSL信号驱动生发中心（GCs）22的TFH分化。有趣的是，ICOSL在ILBs的表达明显高于tDCs，以及幼稚B、记忆B、血浆B和双阴性B细胞（图3i，j和补充图4c）。此外，化疗后ILBs的ICOSL进一步升高（图3k和扩展数据图4i）。同时，化疗后TH1和TFH细胞中的ICOSL受体ICOS也明显增加（扩展数据图4j,k）。类似地，ILBs和TFH或TH1类细胞之间的ICOSL依赖性相互作用得分也很高（图3l）。因此，ILBs可能在化疗后对NPC肿瘤微环境的TFH和TH1样细胞有重要的调节作用。图3-2 | ILB主导的抗肿瘤T细胞免疫的鉴定。

　　g，6个样本的scBCR-seq数据中IgH、IgL和IgK序列的SHM计数，包括幼稚B、ILB、FCRL4+B、记忆B和浆体B细胞。h，从六个样本的scBCR-seq数据中得到的跨B细胞群的BCR多样性。i, 化疗后NPC肿瘤组织中ICOSL+ ILBs与ICOSL+ tDCs的百分比分析。j，FACS分析NPC肿瘤指定B细胞亚群中ICOSL+ B细胞的百分比。k，化疗前后匹配的NPC肿瘤中ILB ICOSL表达的FACS分析。代表性的图表（左）和结果的量化（右）显示。l, 泡沫热图显示了化疗前后样本中TFH和TH1样细胞，以及ILBs和髓系亚群通过ICOSL-ICOS轴的相互作用得分。双侧的P值是用置换试验计算的。显著性是通过双侧样本t检验（a,b,e,i,k），双侧t检验（c），双侧Wilcoxon秩和检验（g），或双侧单因素方差分析，然后进行LSD检验进行多重比较（j）。

　　为了进一步探究ILBs在化疗后对TIME的贡献，我们对化疗后NPC样本中的ILBs和肿瘤浸润T细胞进行了时空剖析。在应答者中，化疗后三级淋巴器官（TLO）样结构中出现了明显的ILB聚集（图4a和扩展数据图5a），CD4+T细胞也密集地浸润在其中（图4a和补充图6）。此外，使用更多的颗粒状纵向样本（治疗前、1周后、2-3周后、4-5周后），我们观察到，在开始化疗1周后，ILB频率（肿瘤浸润B细胞的百分比）在TLO样结构中明显增加。另一方面，随着时间的推移，ILB在无反应的鼻咽癌患者中只有微弱的增加（图4b，补充图7和补充图8a）。图4-1 | 化疗后ILB与TFH和TH1样细胞在TLO样结构中聚集和聚类。

　　a, 原位多重免疫荧光（mIF）分析反应者和非反应者化疗前后匹配的NPC肿瘤中的ILBs和CD4+T细胞。代表性的图像（左；高分辨率图像见补充图6）和化疗时与CD4+T细胞物理接触的ILBs比例的量化（右）显示。扩展资料图5a显示了化疗后反应者肿瘤中的TLO样结构。b, ILBs在治疗前、化疗后1周、2-3周和4-5周的纵向变化，来自应答者和非应答者的NPC肿瘤。代表性的图像（左；高分辨率图像见补充图7）和ILBs的纵向频率和密度的量化（右）显示。

　　我们进一步描述了TLO样结构中ILBs附近的T细胞。有趣的是，增殖T细胞的水平明显增加（图4c和补充图9），增殖T细胞的细胞密度与ILBs的密度呈正相关，但与非ILB的幼稚B细胞无关（补充图8b）。同样在这些区域，我们检测到更多的TH1、TFH和GZMB+CD8+T细胞，但Treg和HAVCR2+CD8+T细胞较少（图4d）。值得注意的是，化疗后的样本中TLO样结构的数量明显增加（化疗前后24名患者的匹配样本中分别发现19个TLO和98个TLO样结构；图4e）。值得注意的是，化疗后的缺乏GC区（98个中的0个；图4f和补充图10），而在治疗前的样本中近50%（19个中的9个）的TLOs含有GCs（图4f）。重要的是，这些缺乏GC的TLO样结构的数量在应答者中明显增加（图4g）。我们验证了图4b（扩展数据图5b）中纵向肿瘤样本系列中发现的GC缺陷的TLO样结构。图4-2 | 化疗后ILB与TFH和TH1样细胞在TLO样结构中聚集和聚类。图4-3 | 化疗后ILB与TFH和TH1样细胞在TLO样结构中聚集和聚类。

　　c, TLO样结构和ILB无龛区域中靠近ILB龛的T细胞和Ki67+增殖性T细胞的水平。d，TLO-样结构和ILB无龛区域中靠近ILB龛的TH1样、TFH、Treg、GZMB+CD8+ CTLs和HAVCR2+耗尽的CD8+T细胞（TEX）的密度和频率。c,d中的方框图表示中位数（中心），第25和75百分位数（方框边界），以及最小和最大（晶须）。e，治疗前的肿瘤中TLO的数量和化疗后匹配样本中TLO样结构的数量。化疗后匹配样本中的TLO数量。TLO或TLO样结构的总数显示在顶部。f，治疗前肿瘤中典型的TLOs和化疗后匹配肿瘤中TLO样结构中GCs的存在。代表性图像（左；高分辨率图像见补充图10）和 图中显示了e样本中GCs的定量（右）。GC B被染色 g, NPC中GC缺失的TLO样结构的数量。化疗后应答者和非应答者中的GC缺陷TLO样结构数量。数据为平均值±s.d。显著性是通过双侧配对样本t检验（a,e），双侧单因素方差分析，然后进行LSD检验进行多重比较（b）、 双侧的Wilcoxon秩和检验（c,d），或双侧的学生t检验（g）。

　　我们采用扩散图来重建B细胞的轨迹23；结果表明，ILBs显示了一个稳定的轨迹，即从幼稚的B细胞到化疗时的逐步激活（图5a和扩展数据图5c）。考虑到化疗诱导的DNA片段可以增强MHC I类在癌细胞中的表达（图1），我们研究了这种化疗相关的DNA片段在诱导ILBs中的潜在作用。将B细胞与GP化疗处理过的癌细胞（GP-SN）的培养上清液孵化，成功诱导了ILBs（图5b）。在这个系统中，通过用DNase预孵化GP-SN或阻断B细胞上的Toll样受体9（TLR9）来耗尽DNA，可以废除GP-SN诱导的ILBs（图5b）。一致的是，TLR9信号传导和下游途径在ILBs中明显上调（图5c）。此外，癌细胞损伤的分子特征与ILBs上的TLR信号传递呈正相关（补充图8c）。图5-1 ILBs通过ICOSL-ICOS轴扩大TFH和TH1细胞以引起CTL反应。

　　a, B细胞的轨迹。b, 从接受化疗的鼻咽癌患者的外周血中分离出的B细胞，在没有或有DNase I或TLR9抑制剂的情况下，与50%的GP-SN共存20小时。c, 在单细胞数据集中，ILBs与幼稚B细胞的信号通路上调。

　　我们进一步研究了ILBs是否促进了TH1和TFH细胞的反应。考虑到人类和小鼠鼻咽部在解剖学和组织学上的差异，到目前为止还没有有效的动物模型；因此，我们选择从鼻咽癌患者化疗后的肿瘤中获得肿瘤来源的ILBs和T细胞来研究ILB的体外功能。在共培养系统中，与非ILB B细胞相比，ILB显示出更大的潜力来扩大IFNγ+IL-2+TH1和CXCR5+TFH细胞（图5d，e）。值得注意的是，这些ILB扩增的CD4+T细胞增强了CD8+T细胞在有肿瘤裂解物存在的情况下表达GZMB和穿孔蛋白的能力，并且这一过程被中和IL-21所削弱（图5f）。图5-2 ILBs通过ICOSL-ICOS轴扩大TFH和TH1细胞以引起CTL反应。

　　为了阐明ILB介导的TH1和TFH扩增的机制，我们首先使用特异性抗体屏蔽ILB中的HLA-DR信号，发现这种处理几乎没有改变ILB诱导的TH1和TFH扩增，揭示了ILB以一种与MHC II类无关的方式调节TFH和TH1（图5g，h和扩展数据图5d）。鉴于ICOSL-ICOS轴代表了我们单细胞数据集中ILBs和效应TH细胞之间排名靠前的配体-受体对之一（补充表6），我们随后阻断了T细胞上ICOS受体的信号，发现这种处理有效地抑制了ILBs的TH1和TFH扩增（图5g，h和扩展数据图5d）。ICOS信号在哺乳动物雷帕霉素（mTOR）依赖的途径中起作用，以触发糖酵解和随后效应T细胞的增殖24。与此相一致的是，在肿瘤来源的CD4+T细胞的培养系统中加入ICOS激动剂能有力地激活PI3K-Akt-mTOR途径，而不是其他信号（图5i）。一致的是，用雷帕霉素抑制CD4+T细胞中的mTOR激活，大大削弱了ILB介导的TH1和TFH扩增（图5j和扩展数据图5e,f）。这些数据表明，化疗利用TLR9信号诱导ILBs，通过ICOSL-共刺激途径引发TFH和TH1细胞的扩增。图5-3 ILBs通过ICOSL-ICOS轴扩大TFH和TH1细胞以引起CTL反应。

　　d,e, 化疗后共1.6 × 105个肿瘤来源的T细胞在培养基中单独培养或与纯化的自体肿瘤ILBs（CD27+IgD+）和非ILB B细胞（CD27-或IgD-）以4:1的比例共同培养，时间为指定天数。通过FACS检测TH1（d）（9天）和TFH（e）（3天）的百分比。f，化疗后取样的总共8×104个肿瘤来源的CD8+T细胞加上25微克毫升-1的肿瘤块裂解物，单独在培养基中培养9天，或与8×104个自体肿瘤CD4+T细胞或与这些细胞在有或没有同型或抗IL-21抗体的情况下与2×104个自体肿瘤ILBs预孵化。指示的细胞因子和基因的水平 细胞因子和基因的水平是通过FACS检测的。g,h, 将化疗后取样的总共1.6×105个肿瘤来源的T细胞与自体肿瘤ILBs以4:1的比例在存在或不存在同种型、抗HLA-DR或抗ICOS抗体的情况下共培养数日。通过FACS检测TH1（g）（9天）和TFH（h）（3天）的百分比。i, 肿瘤来源的CD4+T细胞不作处理或用ICOS激动剂抗体刺激。通过Western blot检测所述信号的激活情况（n = 4）。j, 在有或没有DMSO或雷帕霉素的情况下，将化疗后取样的总共1.6×105个肿瘤来源的T细胞与自体肿瘤ILBs以4:1的比例共培养数天。通过FACS检测TH1（9天）和TFH（3天）的百分比。数据为平均值±s.d。显著性是通过双侧单因素方差分析和LSD检验来确定的，用于多重比较（b,d-h;）或双侧配对样本t检验（j）

　　最后，我们探讨了ILBs的临床意义。在SYSUCC_E队列（Cohort_1，n = 15对）中，化疗后样本中的ILB频率能有效区分应答者和非应答者（应答和非应答样本中ILBs分别为18.5%和7.0%，P = 0.04；图6a）。此外，ILBs比骨髓DCs和巨噬细胞更能预测化疗疗效（曲线下面积（AUC）ILB = 0.82，AUCDC2 = 0.58，AUCTAM = 0.52；图6b）。与我们的机制研究结果一致，ILBs的频率与TFH、TH1和活化T细胞的频率呈正相关，但与Treg细胞无关（图6c）。与那些ILBs频率低或ILBs ICOSL低（尽管ILB频率高）的患者相比，存在ICOSL高的ILB群体也表现出最有利的化疗反应（图6d）。图6-1 | ILBs预测GP的治疗对鼻咽癌患者的疗效。

　　a, 在单细胞数据集（Cohort_1）中，化疗后肿瘤中ILBs的百分比在反应者和非反应者之间。使用学生t检验计算双侧的P值。框图表示中位数（中心），第25和75百分位数（框的边界），以及最小和最大（晶须）。b, 比较单细胞数据集（Cohort_1）中化疗后ILBs、DC2和TAMs对化疗反应的预测能力（AUC）。AUC和双侧P值是通过接收器操作特征（ROC）分析计算的。c, 单细胞数据集（Cohort_1）中ILBs的频率（x轴）和CD4+T细胞亚群（y轴）之间的相关性。相关系数和双侧P值是通过Spearman相关分析计算的。d, Cohort_1患者中G1（ILB频率低）、G2（ILB频率高+ILB-ICOSL低）和G3（ILB频率高+ILB-ICOSL高）的反应者和非反应者的百分比。使用卡方检验计算双侧的P值。

　　重要的是，利用已发表的多中心III期临床试验（NCT01872962）10（Cohort_3，GP试验队列，n = 139；扩展数据表3，补充图11a,b和方法）中收集的患者样本，我们发现在接受GP化疗的NPC患者的所有亚组中，肿瘤浸润ILB的频率增加与有利的无病生存（DFS）和总生存（OS）显著相关（图6e和扩展数据图6a）。此外，ILB浸润水平较高的患者不仅表现出更好的局部肿瘤控制，而且远处转移率也较低（扩展数据图6a）。包括已知预后因素在内的多变量Cox回归分析显示，ILB是有利结局的独立预测因素（补充表7）。作为支持，我们进一步计算了基于单细胞数据集的ILB标签基因集（方法和补充表8），并证实ILB标签也可以预测SYSUCC_M队列的有利生存结果（队列_2，n = 150；图6f，扩展数据图6b和补充表9）。鉴于本研究揭示了GP化疗的免疫调节作用，以及GP和免疫检查点抑制剂（ICI）联合治疗NPC25-27的临床疗效，我们最终在GP-ICI队列（Cohort_4，n = 380；扩展数据表4和方法）中测试了ILBs是否会作为GP和ICI联合治疗反应的潜在生物标志物。无论通过SP142免疫组化评估的程序性死亡配体1（PD-L1）蛋白表达如何，都能观察到治疗反应（补充图11c），尽管在PD-L1阳性患者（由肿瘤细胞或免疫细胞>1%定义）中有更好的反应趋势，但该结果没有达到统计学意义。此外，我们观察到，肿瘤浸润ILB的频率增加与确认的客观反应率明显相关（图6g）。一致的是，ILB浸润水平较高的患者有更长的无进展生存期（PFS）和OS（图6h）。考虑到已知的预后因素，多变量的Cox回归分析证实，ILBs是有利的生存结果的独立预测因素（补充表10）。图6-2 | ILBs预测GP的治疗对鼻咽癌患者的疗效

　　e, 在Cohort_3（GP试验队列）中，所有和接受GP化疗的NPC患者亚组的DFS的Kaplan-Meier曲线，按肿瘤浸润ILB的高（≥50%）和低（<50%）频率分层。ILB是通过原位mIF分析测量的。多变量分析见补充表7。f, Cohort_2中所有NPC患者和按ILB特征的高表达与低表达分层的亚组的DFS的Kaplan-Meier曲线。患者按中位表达值进行二分法。基因组列于补充表8，多变量分析列于补充表9。e,f中的HRs和95%CIs是用Cox回归模型计算的（通过log-rank检验的双侧P值）。g, Cohort_4（GP-ICI队列）中低频（<50%）与高频的肿瘤浸润ILB（≥50%）亚组的完全缓解、部分缓解、疾病稳定和疾病进展的百分比。ILB的测量采用原位mIF分析。使用卡方检验计算双侧的P值h，接受GP加ICI联合治疗的NPC患者的PFS（左）和OS（右）的Kaplan-Meier曲线，根据Cohort_4中高（≥50%）与低（<50%）肿瘤浸润ILBs分层。HRs和95%CIs是根据Cox回归模型计算的（通过log-rank检验的双侧P值）。多变量分析见补充表10。

　　免疫反应的激活对于化疗的长期肿瘤控制至关重要；然而，对于临床上高效的化疗是如何触发肿瘤特异性免疫反应的还知之甚少。在本研究中，我们对化疗后TIME的演变进行了全面的单细胞剖析，并提供了临床高效化疗诱导的以B细胞为中心的抗肿瘤免疫反应的证据（补充图12）。

　　化疗通过直接杀死细胞来减少肿瘤的负担。此外，它还通过免疫抑制细胞或通过抑制炎症反应（或两者）28诱发免疫抑制微环境。我们的研究表明，临床上有效的化疗可以诱导以B细胞为中心的效应性T细胞反应，这表明化疗可以成为ICI的一个有希望的协调者。这可以通过提高MHC I类的表达来直接调节肿瘤的免疫原性，同时通过加强ILBs和效应性TH细胞之间的交叉对话来提高CD8+T细胞的效率和数量。化疗引起的向更多免疫原性TIME的重塑突出了它们与ICI的治疗组合的机会。最近在临床实践中，化疗-免疫治疗联合策略的成功也证明了这一概念29-31。例如，pembrolizumab加铂金和5-氟尿嘧啶的组合最近被批准用于转移性和复发性头颈癌，基于OS的好处29。尽管有一些有希望的临床数据，但也值得注意的是，一些试验未能证明联合化疗和免疫治疗的疗效32,33。鉴于目前的联合方案主要依赖于临床经验，而不是对潜在机制的了解，了解临床上高效的化疗是如何重塑TIME的，可能对临床指导有很大的参考意义。

　　我们的研究与以前的研究相呼应，显示化疗后TIME中的骨髓类DCs在促进效应T细胞反应方面效率不高。值得注意的是，我们进一步揭示了ILBs的一个独特亚群通过ICOSL-ICOS轴触发了TFH和TH1扩增，这进一步增强了细胞毒性T细胞的效应功能。这些数据为免疫治疗组合策略的临床管理提供了新的启示，表明除了旨在恢复常规DCs功能的治疗外，激活特定B细胞亚群的治疗方案在未来的实践中可能代表了与免疫治疗组合的一种有希望的选择。

　　B细胞具有多种功能，可以参与免疫监视或抑制，与分化阶段、环境信号或空间位置密切相关34-38。在这项研究中，接受T细胞无关的信号的ILBs以抗体无关的方式发挥抗肿瘤作用。癌症中的ILBs很少被报道，它们主要存在于边缘地区、周边地区或腹腔，并通过增殖来抵抗细菌感染20,39,40。我们发现化疗可以增强先天免疫刺激（即DNA），使TIME中ILBs上的TLR9参与其中。B细胞的功能取决于表型和位置。在这项研究中，ILBs在化疗后密集地聚集在NPC的TLO样龛中，促进它们与T细胞的密切接触。有趣的是，这些TLO样结构对GCs是缺乏的。以前的研究报告说，TIME中的TLOs主要是依靠活跃的GCs产生保护性的类开关抗体来发挥抗肿瘤作用，而没有GCs的TLOs则功能较差41,42。然而，我们的研究结果表明，缺乏GC的TLOs也可以具有临床意义。这些发现共同表明，治疗性干预可以重塑B细胞的可塑性，建立一个抗肿瘤环境。与这一观点一致，Lu等人最近的一份报告43也发现，化疗诱导补体信号以增强B细胞的抗肿瘤特性。

　　本研究的一个固有的局限性是没有在体内研究ILBs对T细胞的影响，因为到目前为止，鉴于人类和小鼠鼻咽部在解剖学和组织学上的差异，还没有有效的具有免疫能力的NPC动物模型。尽管如此，我们还是采用了一个体外共培养系统，利用肿瘤衍生的ILBs和化疗后从患者身上获得的T细胞来评估ILBs的活性，利用颗粒状的纵向原位数据来解读ILBs的动态变化模式，并采用多个临床队列来验证ILBs的临床意义。

　　我们的研究揭示了化疗时的克隆替代，这主要是在免疫治疗的背景下报道的44,45。进一步研究的一个方向是利用生物信息学方法将这些治疗后被替换的TCR序列与特定的抗原相匹配。对与爱泼斯坦-巴尔病毒（EBV）相关的鼻咽癌进行研究将是特别有趣的，通过ELISpot检测来寻找T细胞对EBV抗原的反应性，并观察反应性T细胞的TCR是否与反应者和非反应者的肿瘤中的序列相匹配。这也可能对未来NPC患者的个体化治疗有参考价值。

　　总之，这项研究揭示了临床上高效的GP化疗激活了以ILB为中心的抗肿瘤免疫反应，涉及缺乏GCs的TLO样结构。我们的单细胞数据集为研究界提供了一个新的NPC资源，并为在未来的临床实践中指定最佳化疗-免疫治疗组合策略铺平了道路。此外，我们验证了ILBs是鼻咽癌化疗反应和预后的候选生物标志物，这可以促进患者管理。

　　任何方法、额外的参考文献、《自然》组合报告摘要、源数据、扩展数据、补充信息、致谢、同行评审信息；作者贡献和竞争利益的细节；以及数据和代码可用性声明均可在https://doi.org/10.1038/s41591-023-02369-6。

　　本研究得到了中山大学肿瘤中心（SYSUCC）（编号：B2021-260-1）和中山大学附属第五医院（SYSU5-K41-1）的研究和伦理委员会的批准。涉及人类参与者的实验是根据研究和伦理委员会的建议进行的。所有参与者都获得了充分的知情同意，并符合《赫尔辛基宣言》（2013年版）的规定。

　　本研究包括来自4个独立队列的684名患者。所有患者都有组织学证实的鼻咽癌，并有完整的临床和随访数据。根据第八届美国癌症联合委员会的分期系统进行分类。除Cohort_3的患者外，其他队列的患者没有作为临床试验的一部分进行治疗。

　　队列_1。队列1由15名在SYSUCC接受GP化疗的患者组成，并在化疗前后收集匹配的样本进行scRNA-seq或scTCR/scBCR-seq（SYSUCC_exploratory或SYSUCC_E队列；扩展数据表1）。纳入标准包括：组织学诊断的、世界卫生组织II型或III型的局部晚期鼻咽癌患者，计划接受2-3个周期的新辅助化疗。化疗方案包括GEM（1,000 mg m-2）加DDP（80 mg m-2），每3周一次。所有患者都是连续招募的，以避免引入选择偏差。详细的纳入和排除过程见扩展数据图1b。

　　队列2。队列2由150名在SYSUCC治疗的患者组成，他们使用Affymetrix HTA 2.0微阵列46（SYSUCC_微阵列或SYSUCC_M队列；扩展数据表2）进行分析。

　　队列_3。队列3由139名接受GP化疗的多中心III期临床试验10（GP试验队列）的患者组成。临床样本是随着多中心患者的加入而同时收集的；试验方案中没有预定的生物标志物分析。值得注意的是，生物标志物分析人群（BAP）的基线特征与意向治疗（ITT）人群相当（扩展数据表3和补充图11a）；BAP的临床结果也代表ITT人群（补充图11b）。除了Cohort_3的患者，本研究中所有接受GP的患者都是在GP被批准用于治疗NPC后开始治疗的。

　　队列4。队列4由380名接受GP化疗加ICI的回顾性多中心患者组成（GP-ICI队列；扩展数据表4）。虽然GP+ICI治疗直到2022年才被纳入美国国家综合癌症网络指南，作为NPC的一种选择（基于大型III期随机试验），但早在2017年，I期和II期试验就报道了使用免疫疗法及其与GP化疗联合治疗NPC的疗效和安全性（例如，参考文献27,47,48）。已发表的研究为临床医生提供了一种选择，即在征得患者同意的情况下提供这种方法，特别是对于那些疾病复发风险预计较高的大块头疾病。因此，接受GP+ICI（包括托利帕利单抗、康瑞单抗、辛替利单抗、提斯利单抗、彭博利单抗、尼沃鲁单抗和伊匹木单抗）试验的患者在临床治疗期间对 "标签外用药 "给予了书面的知情同意，这得到了机构伦理委员会的批准。在这项研究中，我们对这些数据进行了回顾性分析； 纳入标准包括：2019年至2022年期间在SYSUCC或SYSU第五医院接受GP和ICI联合治疗的组织学诊断的鼻咽癌患者，具有完整的基线资料、可评估的基线和治疗后扫描、随访资料，以及保存在医院实验室或病理科的鼻咽部生物样本。

　　在治疗开始前和两个周期的化疗后，使用标准护理中常规采用的活检钳，在内窥镜检查中从患者身上获得新鲜的活检样本。例行进行苏木精和伊红染色的质量控制，以确保收集的样本来自肿瘤部位。使用FACS分离原发性肿瘤浸润性免疫细胞，包括整体T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、ILBs、非ILB B细胞和DCs。简而言之，FACS是在流式细胞仪（Moflo, Beckman Coulter）上进行的。使用标准的前向散射宽度（FSC-W）与面积（FSC-A）的标准来抛弃双胞胎和捕获单胞胎。CD45+CD3+、CD45+CD3+CD4+和CD45+CD3+CD8+栅极分别用于分类整体T、CD4+T和CD8+T细胞（补充图13a）。CD45+CD19+门用于分拣整体B细胞，如我们以前描述的那样49,50。ILB在CD45+CD19+B细胞门内使用CD27+IgD+进行分选。非ILB B细胞包括B细胞门内的剩余细胞（CD45+CD19+CD27-和CD45+CD19+IgD-）（补充图13a）。CD45+CD3-CD19-CD56-CD11c+门被用来获得tDCs（补充图13b）51。在CytoFLEX流式细胞仪（Beckman Coulter）上用流式细胞仪验证了分选群体的纯度（98%纯度）。收集到的细胞要么立即用于共培养实验，要么在DMSO存在下冷冻保存在-80℃或液氮中。

　　新鲜血液样本来自于治疗开始前或两个周期的化疗后的患者。通过Ficoll密度梯度离心法从血液中分离外周血单核细胞（PBMCs）。在MACS柱纯化系统（Miltenyi Biotec）中使用抗CD19磁珠从PBMCs中选择B细胞。使用MACS柱纯化系统（Miltenyi Biotec）中的抗CD14磁珠从PBMCs中纯化单核细胞。为了产生单核细胞衍生的DC，将纯化的单核细胞在补充有粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（40纳克-1）和白细胞介素-4（40纳克-1）的完整的罗斯威尔公园纪念研究所（RPMI）1640培养基中培养6天；如我们以前所述，在第3和第5天更换一半培养基52。此后，用25 μg ml-1的肿瘤裂解液培养DC 12小时，用200 ng ml-1的脂多糖（LPS）刺激它们24小时来诱导成熟。

　　用于scRNA-seq的样本用PBS（Thermo Fisher Scientific）清洗并切成小块（<1 mm3）。然后将样品转移到5毫升含有胶原酶IV（1微克毫升-1）（Thermo Fisher Scientific）的DMEM中，随后在37℃下孵育40分钟以上，每10分钟手动摇动一次。孵化后，用流管（5毫升圆底聚苯乙烯试管，带细胞过滤器快盖，BD-Falcon）过滤样品，滤液在800rpm下离心5分钟。我们接下来收集细胞颗粒，用细胞保存液（CELLBANKER 2）重新悬浮。最后，用血球仪进行细胞计数，并使用胰蓝染色评估细胞的活力。整个过程在90分钟内完成。

　　细胞悬液被加载到10X Chromium系统上进行 使用Chromium Single Cell 3′ Library & Gel Bead Kit v2 或v3（10X Genomics）或5′文库和凝胶珠套件（10X Genomics），以达到每孔8,000至14,000个细胞。完整的文库 在Illumina HiSeq X Ten平台上进行测序，采用150bp 对偶读配置；单细胞基因表达文库是根据制造商的说明生成的。详细的数据处理流程见 详细的数据处理工作流程在补充方法中描述。方法（scRNA-seq数据处理）。

　　根据制造商的协议，用Chromium Single-Cell 5′ V(D) J试剂盒（10X Genomics）生成V(D)J文库。TCR和BCR文库在Illumina HiSeq X Ten平台上进行测序。详细的数据处理工作流程见补充方法（scTCR和scBCR数据处理）。

　　人鼻咽癌HK1和HONE1细胞系在含有10% FCS（Gibco）的RPMI 1640培养基（Gibco）中，在37℃和5% CO2的培养箱中培养。使用0.25%胰蛋白酶-EDTA（Gibco）进行细胞消化和通过，并用无血清细胞冷冻液（NCM Biotech）冷冻。

　　GEM（齐鲁制药）和DDP（Hansoh Pharma）被稀释在0.9%的正常盐水中；不含药物的0.9%盐水被用作阴性对照。在体外药物实验中，根据我们以前的工作53，对HONE1和HK1细胞使用168nM的GEM，对HONE1和HK1细胞使用1,680nM的DDP。

　　用GEM和DDP处理48小时后，测量NPC肿瘤样本或HONE1和HK1细胞系中MHC I类、抗原表达基因和IFN刺激基因的表达。使用TRIzol（Invitrogen）从培养的细胞中分离总RNA。逆转录定量PCR（RT-qPCR）按以前的描述进行54。引物序列列于补充表11。相对拷贝数是通过计算感兴趣的基因相对于GAPDH的折叠变化差异来确定的。所有实验均为一式三份。

　　使用含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒和PhosSTOP（Roche）的放射免疫沉淀细胞裂解液（Beyotime Biotechnology）提取总蛋白。西方印迹法是按照我们以前的描述进行的54。每个泳道上都有同等数量的细胞裂解液。使用的抗体列于补充表11。

　　根据制造商的说明，使用ELISA试剂盒（NeoBioscience）检测体外培养系统上清液和NPC肿瘤样本中IFNβ的浓度。

　　使用BLOCK-iT RNAi Designer（Thermo Fisher Scientific）设计针对STING的特定shRNA序列，并插入pLKO.1质粒（Addgene）以转染HONE1细胞。使用Lipofectamine 3000（Invitrogen）进行转染，通过RT-qPCR检测和Western blot检测STING的敲除效率。shRNA的序列列于补充表11。

　　为了产生STING基因敲除的HK1细胞，使用Benchling设计了最佳的单向导RNA靶序列。STING靶序列（列于补充表11）被克隆到PX458质粒中。HK1细胞被转染和分类，并通过Western blot验证敲除效率。

　　将匹配的未接受治疗和化疗后的鼻咽癌患者的石蜡包埋肿瘤样本切成4微米的连续切片，并进行免疫组化或多色免疫组化处理。

　　免疫组织化学。 免疫组化是为了说明化疗后肿瘤样本中STING和STAT1的激活情况。将切片与针对人p-STING（细胞信号技术公司）和p-STAT1（细胞信号技术公司）的初级抗体进行孵化，并按照我们之前的描述进行55。使用针对人PD-L1（Abcam）的初级抗体评估PD-L1状态。评估了PD-L1在肿瘤细胞和免疫细胞上的表达。使用KF-PRO-020数字病理切片扫描仪获得整体扫描图像；使用HALO图像分析软件（Indica Labs）分析p-STING和p-STAT1染色的组织化学评分（H-scores）。染色强度用以下评分标准进行评分： 0，无阴性；1，低阳性；2，阳性；3，高阳性。然后通过染色强度得分和阳性细胞的百分比相乘来确定H分数。计算每个样品的平均分数。分数的理论界限从0（0%细胞染色）到300（100%细胞染色，强度为3+）。

　　多色免疫组织化学。使用PANO 7-plex IHC试剂盒（Panovue）对未接受治疗和接受化疗后的鼻咽癌患者的肿瘤样本进行了多重染色和多光谱成像。4微米的福尔马林固定的石蜡包埋切片经过脱蜡、补水并进行高温抗原检索。然后将组织与阻断抗体稀释液在室温下孵育10分钟，然后与一抗在4℃下孵育过夜。使用了以下主要抗体和浓度： 抗CD45（ZSGB-BIO）；抗CD3（Abcam）；抗CD4（ZSGB-BIO）；抗CD8（ZSGB-BIO）；抗CD20（Sigma-Aldrich）；抗CD27（Abcam）；抗HAVCR2（细胞信号技术）；抗PD-1（细胞信号技术）； 抗CXCR5（细胞信号技术）；抗CXCL13（ZSGB-BIO）；抗BHLHE40（Novus Biologicals）；抗FOXP3（细胞信号技术）；抗IgD（Abcam）；抗CD21（ZSGB-BIO）；抗MECA-79（Novus Biologicals）；和抗BCL6（ZSGB-BIO）。此后，玻片与二抗在室温下孵育10分钟，然后进行泰拉米信号放大。接下来，玻片进行微波加热处理的抗原检索。最后，在所有抗原都被标记后，用DAPI（Sigma-Aldrich）对细胞核进行染色。用Akoya Vectra Polaris玻片扫描仪以200倍放大率获得整体扫描图像。阴性对照是通过省略初级抗体进行的，免疫荧光信号通过减去阴性对照的染色进行调整。每个荧光信号的光谱都是用单一染色的切片建立的。然后使用inForm图像分析软件（PerkinElmer）获得减去自体荧光后的重建图像。通过检测DAPI通道中的圆形信号来确定细胞核面积。使用DAPI和相应的细胞亚型特异性标记物的共聚焦信号来评估一个细胞亚型的百分比。用HALO（Indica实验室）对多色图像中单个或共同表达的标记物进行量化。为了量化与CD4+T细胞有物理接触的ILB的比例，使用Imaris显微镜图像分析软件分析图像，如前所述56。两位操作者（J.Y.和Q.M.）不了解患者的临床信息，独立对图像进行评分；结果由一位病理学家（X.C.）随机复核。使用免疫荧光染色法确定TLOs的存在，其聚集物为 CD3+T和CD20+B细胞。

　　细胞用荧光色素结合的抗体染色，然后用流式细胞仪（Moflo，Beckman Coulter）进行分析。对于细胞内的细胞因子染色，用白细胞活化鸡尾酒（BD Pharmingen）在37℃下刺激细胞5小时。接下来，用表面标记物染色，用IntraPrep试剂（Beckman Coulter）固定和渗透，最后用细胞内标记物染色。细胞内转录因子的染色是用True-Nuclear Transcription Factor Buffer Set（eBioscience）进行的。本研究中使用的单克隆抗体列于补充表11。使用Gallios流式细胞仪（Beckman Coulter）获取数据，并使用FlowJo软件（FlowJo LLC）进行分析。

　　对于mIF数据，ILB的频率由CD20、CD27、IgD和DAPI共聚焦斑点/整个扫描玻片中的CD20和DAPI共聚焦斑点）×100%确定。同样，对于FACS数据，ILB的频率是用CD45+CD19+CD27+IgD+细胞/CD45+CD19+细胞×100%计算的。

　　如前所述，用GEM加DDP处理NPC细胞系HK1。处理24小时后，收集GP化疗的癌细胞的培养上清液（GP-SN）。如前所述，从化疗后的鼻咽癌患者的PBMC中分离出人B细胞，然后在没有或有TLR9抑制剂（Selleck Chemicals）的情况下与50%的GP-SN共存20小时。在某些情况下，使用DNase I（Sigma-Aldrich）在37℃下消化GP-SN细胞的DNA 1小时，然后对该酶进行热失活处理。根据IgD（BD Pharmingen）、CD27（eBioscience）和IgM（Beckman Coulter）的表达水平，用FACS检测ILBs的水平。

　　从化疗后的鼻咽癌患者获得的FACS分选的CD4+T细胞不作处理，或用ICOS屏蔽抗体（10 μg ml-1, AdipoGen）或雷帕霉素（20 nM）进行预处理。此后，在存在或不存在HLA-DR屏蔽抗体（BD Pharmingen）的情况下，将细胞单独或与自体肿瘤衍生的ILBs、或非ILB B细胞、tDCs或血液单核细胞衍生的成熟DCs在培养基中培养2天。随后，在RPMI 1640培养基中维持细胞，并补充20 IU ml-1 IL-2（eBioscience），持续指定的天数。通过FACS检测所述细胞因子和基因的水平。

　　在化疗后从NPC肿瘤中获得的肿瘤源性CD8+T细胞不作处理，或在化疗前后用25 μg ml-1的匹配肿瘤 在化疗前后20小时内，用25微克/毫升的匹配肿瘤质量裂解液处理。1μg ml-1的抗CD28抗体。为了获得肿瘤裂解液，将肿瘤组织切成小块并悬浮于 将肿瘤组织切成小块并悬浮在RPMI 1640培养基中。然后进行五次冷冻（液氮）和解冻（37 °C 水浴）循环。通过离心去除大颗粒（2,000克，4℃，10分钟），收集上清液并储存在-80℃以备使用。储存在-80℃待用。IFNγ的产生是通过 ELISpot检测。在另一组实验中，从NPC肿瘤中获得的肿瘤来源的CD8+T细胞 在另一组实验中，从化疗前后的NPC肿瘤中获得的肿瘤来源的CD8+T细胞与 在有或没有同型抗体的情况下，与自体肿瘤来源的CD4+T细胞共培养，或没有自体肿瘤来源的CD4+T细胞。在存在或不存在同型抗体、IL-21中和抗体（Novus Biologicals）或IFNγR1屏蔽抗体（R&D Systems）9天。同时，加入25μg ml-1的肿瘤块裂解液和1μg ml-1的抗CD28 来触发肿瘤特异性T细胞反应。在某些情况下、 CD4+T细胞在与CD8+T细胞共培养之前，先用自体肿瘤衍生的ILBs进行预孵化。通过FACS检测GZMB、穿孔蛋白和CD107a 的表达是通过FACS检测的。

　　根据制造商的说明，使用商业试剂盒（BD Pharmingen）进行ELISpot检测。简而言之，96孔硝酸纤维素板（Merck Millipore）在4℃下用5 μg ml-1的抗人IFNγ捕获抗体包衣过夜。然后洗孔并在室温下用10% FCS-RPMI 1640培养基阻断2小时。然后，将1×105个纯化的肿瘤CD8+T细胞孵化在孔中，在化疗前和化疗后分别用匹配的肿瘤块裂解物进行刺激。洗涤后，用2μg ml-1的生物素化的抗人IFNγ检测抗体孵化平板，用链霉亲和素-辣根过氧化物酶显影，然后加入3-氨基-9-乙基咔唑底物试剂。用ELISpot阅读器扫描图像，并手动计算斑点数量.

　　为了确定恶性细胞和免疫细胞集群的强大标记基因特征，使用了Seurat的FindMarkers功能57。将目标细胞簇与主要区间内的所有其他不同系的细胞进行比较。在分析中排除了一个管家基因的子集。标记基因的名单是用以下标准选择的： (1)有两个以上的折叠变化和Bonferroni校正的P<0.05的基因；(2)在目标集群中10%以上的细胞中可检测到表达的基因；(3)AUC>0.6；和(4)根据文献知识，目标集群的典型标记。

　　使用Seurat中的AddModuleScore功能对每个样品的目标簇中的单个细胞进行路径富集评分。路径和基因集从公共的分子特征数据库（MSigDB）（http://www.gsea-msigdb. org/gsea/msigdb/index.jsp）和CancerSEA（http://biocc.hrbmu.edu. cn/CancerSEA/）下载。limma软件包被用来识别不同的路径和基因组。不同的路径和基因组。

　　三种算法，包括monocle、扩散成分分析 和RNA速度，被用来推断化疗中细胞的发育轨迹。化疗的细胞的发育轨迹。

　　Monocle。在目标细胞类型上使用了Monocle2 R软件包13。具体来说，我们首先使用差异化基因（DEGs）提取了不同集群的差异化表达基因（DEGs）。使用差异基因测试（differentialGeneTest）功能，用本杰明尼 Hochberg校正的P<0.01。然后，根据DEGs在无差异基因群中的表现，进行细胞排序。在无监督的情况下，根据DEGs进行细胞排序；在降维后构建发展轨迹。在降维和细胞排序后构建了发展轨迹、 使用默认参数。绘制推测的轨迹时使用 plot_cell_trajectory函数绘制。

　　扩散成分分析。扩散分量分析 来重建目标细胞的发育轨迹。类型。使用非线性降维技术构建扩散图，以确定主要的非线性成分。变化58。该图是用R软件包Destiny中的DiffusionMap函数构建的。构建的，使用的是R软件包Destiny中的DiffusionMap函数，使用默认参数23。

　　RNA速度。RNA速度的计算是为了将速度 矢量投射到低维嵌入（上文提到的单细胞空间或扩散图），以帮助确定发育谱系59。具体来说，使用Velocyto Python软件包，根据CellRanger输出的对齐的BAM文件59，重新计算拼接和未拼接的读数。然后，基因表达状态的时间衍生物被 通过区分未拼接和拼接的mRNAs来估计基因表达状态的时间导数。结果是可视化的，用短箭头表示细胞的进化方向。

　　细胞连接组是在配体-受体相互作用的基础上产生的，因为复杂的细胞外反应是从配体与其同族受体的结合以及随后特定细胞信号传导途径的激活开始的19。策划的配体、受体及其相互作用的储存库在connectomeDB2020中被引用，这是一个最新更新的数据库，其中有2,293个人工策划的配体-受体对，有文献支持60。具体来说，为了描绘互动网络，我们首先使用CellPhoneDB Python软件包进行了细胞-细胞交流分析，该软件包根据单细胞基因表达数据预测两种细胞类型之间富集的细胞相互作用19。然后根据一种细胞类型对受体的表达和另一种细胞类型对相应配体的表达来计算两种细胞类型之间富集的配体-受体相互作用强度。如前所述，在目标集群之间进行配对比较，默认为1,000次19。通过计算平均值高于实际平均值的比例，得到相应配体-受体复合物的细胞类型特异性的可能性的P值。只有P<0.05的配体-受体对被计算在内。接下来，考虑到丰富的细胞群往往比罕见的细胞群集体发送和接收更强的信号，特别是在匹配的治疗无效和化疗后的样本中，我们进一步建立了重量定向、治疗无效和化疗后的互动网络模型，其中两个集群之间的互动分数是通过考虑每组的细胞在所有测序细胞中的比例来计算的，公式如下：公式1

　　ScoreA Li→→BRi代表一个特定的配体-受体对在细胞类型A和细胞类型B之间的得分。细胞类型A和细胞类型B之间的特定配体-受体对的得分。配体i在细胞类型A中的平均表达量，PA为细胞类型A的比例。受体i在B型细胞中的平均表达量，PB为B型细胞的比例。最后，ScoreA→B是A型细胞和B型细胞之间的相互作用得分之和。细胞类型A和细胞类型B之间的相互作用得分之和。

　　为了将TCR结果与基因表达数据相结合，仅对被鉴定为CD8+和CD4+T细胞的细胞进行了基于TCR克隆型的分析。先前存在的TCR被定义为具有CDR3序列的TCR，在治疗无效的病人样本中检测到；新的TCR被定义为具有CDR3序列的TCR，在化疗后才出现在样本中。

　　为了计算B细胞亚群的SHM率，使用Change-O工具包61处理scBCR数据（补充图14）。通过使用IgBLAST和AssignGenes.py将序列与IMGT测序数据库文件对齐来实现V（D）J基因的命名；使用DefineClones.py确定B细胞克隆家族；使用CreateGermlines.py重建种系V（D）J序列。然后用Shazam R软件包估计体细胞超突变。为了衡量不同B细胞亚群的BCR多样性，我们用Alakazam的alphaDiversity功能估计了克隆丰度的香农熵，这是一个常用的量化多样性的指标，自举200次（参考文献61）。

　　计算了ILBs的频率与T细胞不同亚群之间的相关性。细胞浸润水平是由基因表达特征推断出来的；每个样本的得分是使用R62中的GSVA软件包计算的单样本基因集富集分析；随后进行相关性分析。使用喉咽内窥镜和磁共振成像根据实体瘤的反应评价标准63来评价患者的客观治疗反应。部分或完全缓解被归类为化疗反应者；疾病稳定或进展被归类为无反应者。计算了免疫细胞浸润和治疗反应之间的关联。此外，还比较了不同亚群预测化疗反应的准确性。

　　实验中的误差条表示s.e.m.或s.d.。各组间的差异通过配对或不配对的学生t检验、Wilcoxon秩和检验或单因素方差分析计算，然后通过Fisher's LSD检验进行多重比较，如所示。各亚组的基本临床特征用卡方检验进行比较。使用Spearman相关分析计算ILB水平和不同T细胞亚群之间的关联。使用ROC分析计算AUC，以比较不同亚群预测治疗反应的准确性。对于生存分析，采用对数rank检验来比较各组之间的曲线。为了调整临床相关的协变量，采用了多变量的Cox比例危害模型来计算HRs、95%CIs和调整后的P值64。所有测试都是双侧的。统计分析使用Prism（GraphPad软件）、R和SPSS进行。

　　关于研究设计的更多信息，可在本文链接的《自然组合报告摘要》中找到。扩展图1-1 单细胞聚类情况

　　a, 工作流程图和研究设计。 b, 流程图显示患者的纳入标准和Cohort_1的招募过程。 c, 基于scRNA-seq数据的主要细胞集群的识别。左图：UMAP图显示代表样本的主要细胞集群。中间：热图显示代表样本的拷贝数变异（CNVs）。显示了单个细胞（行）和染色体区域（列）： 右图：显示代表基因的表达的UMAP图。扩展图1-2 单细胞聚类情况

　　d，显示肿瘤和免疫细胞亚群的UMAP图。扩展图2-1，化疗激活STING-IFN-I通路，增强癌细胞的抗原表达能力

　　a，化疗前后匹配的鼻咽癌肿瘤的原位CD20+B细胞密度。 b，UMAP图显示13个肿瘤细胞簇，按患者身份（左）和治疗状态（右）着色。 c，单细胞数据集中每个患者的MHC I类和抗原表达基因的表达。d, NPC患者DFS的Kaplan-Meier曲线，按队列2中trajectory_I(Cluster_12)的签名得分高低进行分类。根据中位表达值对患者进行了二分法划分。e, 图1d中NPC样本化疗后phospho-STAT1的变化。 f,g, IFN-β水平（f），用GEM、DDP或GP治疗的HONE1的phospho-STAT1（g）（48 h；n = 3）。h-k，用GEM、DDP或GP治疗的HK1（h,k）和HONE1（i,j）中MHCclassI和抗原呈递基因的表达（48小时；n = 3）。扩展图2-2，化疗激活STING-IFN-I通路，增强癌细胞的抗原表达能力

　　l，单细胞数据集中化疗后肿瘤细胞STING表达的变化。分析中包括了MHC classI inc增加的样本（n = 5对）。盒子的底部和顶部分别是第25和75个百分位数（四分位数范围）。m, 磷酸化STING、STING、磷酸化TBK1、TBK1、磷酸化IRF3和IRF3在用GEM、DDP或GP治疗的HONE1（48小时，n = 3）。 n, MHC classI和抗原表达基因在STING敲除的HK1中表达，无论是否用GP化疗（48小时；n = 3）。 o-q, STING表达（o,p），IFN-β水平（p），磷酸化STING，磷酸化STAT1（p），MHC classI和抗原呈递基因表达（q），在STING敲除的HONE1接受或不接受GP化疗（48 h；n = 3）。(c,l)计算了双侧Wilcoxon检验，(f,h-j,n,o-q)计算了双侧单因素方差分析和LSD检验，进行多重比较。扩展图3-1-化疗引发效应性CD4+和CD8+T细胞反应

　　a，化疗前后匹配的鼻咽癌肿瘤中衰竭的CD8+T细胞的原位mIF分析。代表性的图像（左）和化疗后应答者和非应答者的CD8+T细胞密度、衰竭的CD8+T密度和频率的量化（右）被显示。b，单细胞数据集中的样本（n=15对），化疗前后疲惫的CD8+T（Cluster_5）中TCF7、LAG3和HAVCR2的表达情况。盒子的底部和顶部分别是第25和75百分位数（四分位数范围）。胡须包含了1.5倍的四分位数范围。c，应答者和非应答者之间b的变化程度（n = 15）。图表显示了中位数（中心），第25和75百分位数（框的边界），以及最小和最大（须）。d, 在有scTCR-seq数据的样本中，化疗后预先存在和新出现的CD8+和CD4+T细胞克隆的绝对数量（n = 3对）。e,f, 化疗前后NPC肿瘤中IFN-γ+ TH1（e）和TFH（f）的FACS分析。代表图（左）和化疗后反应者和非反应者中TH1和TFH的变化量化（右）显示。扩展图3-2-化疗引发效应性CD4+和CD8+T细胞反应

　　g,h, 化疗前后匹配的NPC肿瘤中TH1样细胞（g）和TFH（h）的原位mIF分析。代表性的图像（上）以及化疗后应答者和非应答者的CD4+T细胞密度、TH1样细胞密度和频率、TFH密度和频率变化的量化（下）显示。i, Cohort_2中TH1-like（X轴，左）、TFH特征表达（X轴，右）和CTL特征表达（Y轴）的相关性。相关系数和双侧P值是通过Spearman相关分析计算的。j，第二组中按TH1-like（左）和TFH（右）特征的高低表达分层的NPC患者DFS的Kaplan-Meier曲线。患者按中位表达值进行二分法划分。使用Cox回归模型计算HRs和95%CIs（通过log-rank测试计算双侧P值）。(a,e-h)采用双侧配对样本t检验，(b)采用双侧Wilcoxon检验，(c)采用双侧学生t检验。扩展资料 图4-1 | CD27+IgD+IgM+ILB的表达在化疗后增加

　　a, 单细胞数据集中30个匹配的鼻咽癌样本在化疗前后的18208个骨髓细胞的聚类。显示骨髓细胞聚类（左）和治疗状态（右）的UMAP图。b，化疗后骨髓细胞亚群和CD4+Th细胞之间的细胞相互作用得分的变化。c，TH1-TFH细胞和DC2、TAMs、B细胞之间的细胞-细胞相互作用组。d，单细胞数据集中B细胞和CD4+T细胞亚群频率的相关性。相关系数和双侧P值是通过Spearman相关分析计算的。扩展资料 图4-2 | CD27+IgD+IgM+ILB的表达在化疗后增加

　　e，单细胞数据集中匹配的肿瘤样本在化疗前后的ILBs频率（n = 15对）。f，代表性的流式细胞仪图显示CD45+CD19+CD27+IgD+B细胞亚群中的IgM阳性细胞。g，化疗前后匹配的NPC肿瘤中CD45+CD19+CD27+IgD+ILBs的FACS分析。代表图（左）和化疗后应答者和非应答者ILBs变化的量化（右）显示。h，化疗前后匹配的鼻咽癌患者外周血中CD45+CD19+CD27+IgD+ ILBs的FACS分析。代表图（左）和化疗后应答者和非应答者外周ILBs变化的量化（右）被显示。i，单细胞数据集的配对样本中ILB上的ICOSL表达（n = 15对）。j，单细胞数据集中化疗前后匹配样本中TH1样和TFH细胞上的ICOSL表达（n = 15对）。方框的底部和顶部分别是第25和75百分位数（四分位数范围）。胡须包含了1.5倍的四分位数范围。k，化疗前后ICOS在TH1和TFH匹配的NPC肿瘤上的表达的FACS分析。(e,g,h,k)计算了双侧样本t检验，(i,j)计算了双侧Wilcoxon检验。扩展图5- ICOSL诱导的mTOR激活对ILB介导的效应Th的扩展至关重要

　　a，化疗诱导的TLOs典型标志物（CD3、CD20、CD21、MECA-79）的原位mIF染色（n = 5）。代表性图像显示 图4a,c,f的连续切片。b, 代表性的原位mIF图像显示化疗后1周、2-3周、4-5周时GCs的存在（n = 5）。GC B细胞被CD20和BCL6染色。c, 追踪图显示B细胞激活特征在图5a中扩散图的第二部分的表达。细胞沿分量（X轴）投影，线条表示特征表达的移动平均值，阴影区显示标准误差。d, 图5g,h中TH1和TFH细胞的绝