重塑生命之脉：生物血管工程的挑战与未来

　　在工程和再生医学领域进行了长期的探索后，构建体外大型组织（尤其是需要血管化的组织）仍然堪称艰巨之事。设计血管工程技术，以满足越来越多的生物工程血管需求，是现代医学面临的挑战。为此，科研人员不断需要攻克复杂的问题，包括活细胞在体内的分布、组织化、黏附、迁移和成熟，制备或获取功能性的细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）和发展非血栓形成的内皮等。[1]

　　自1950年代以来，组织工程血管移植物（Tissue-Engineered Vascular Grafts, TEVG）被期望能缓解大血管移植的紧张状况。TEVG的主要优点在于其可以减少动物源性大血管移植后的免疫排斥反应。但是，尽管在药理学、材料科学和设备制造等领域取得了显著的进步，合成的TEVG并未能显著降低总体死亡率和发病率。[2]

　　因此需引入一种新的解决方案，即开发组织工程血管导管，通过促进内皮细胞、平滑肌细胞在类似ECM的生物材料中生长。然而，只用一种或两种类型的活细胞在生物材料基质中已被证明不足以重建活血管。

　　随后的研究主要集中在理解血管的结构组成，以及如何增强细胞的黏附性和组织的凝聚力，以赋予血管结构稳定性并促进其在体内的整合。必须注意到，血管的大小可能会在血管层次结构中产生显著的差异，因此大型和小型血管的工程化需求和设计方法可能会大相径庭。[3]

　　本篇将重点讨论生物工程大型血管结构的最新进展。在设计和制造生物工程血管时，需要考虑生物相容性、可降解性、足够的机械性能和渗透性，以及大小的可变性。为了满足这些要求，已经出现了一些新的方法，例如片材轧制，直接脚手架，基质成型和3D生物打印。这些方法使得有可能模拟大型血管的结构，无论是在体外实验还是体内应用。

　　尽管血管组织工程领域已有显著的突破，但想要设计和制造理想的大型血管，仍需攻克一系列的挑战。以下是一些关键的需求和挑战：

　　血管组织的构成与结构：血管的结构和功能由其生物分子构成决定，这些组成元素在血管的不同层级中有所变化。因此，理解这些元素并据此选择适合的生物材料和细胞来源，是制造理想血管的重要一环。

　　生物相容性表面：开发出与血液接触时具有良好生物相容性的表面，是一个颇具挑战性的任务。理解和模拟与血液接触的表面以及必要的抗血栓形成机制，对于成功构建血管至关重要。使用特定设计的生物材料、细胞和生物分子（如促血管生成因子）可能有助于解决这个问题。[4]

　　制造技术与细胞分布：理想的制造技术应能生成具有最高细胞存活率的血管，并能模拟出三个基本血管层的结构。当前的一大挑战是如何自然地在血管组织内部分布细胞。在血管中，平滑肌细胞（Smooth Muscle Cells, SMC）和内皮细胞（Endothelial cells, EC）分别位于中血管层（Tunica media）和内血管层（Tunica intima）。在使用基于无细胞支架的方法时，这些细胞的分布常难以达到理想状态。[5]

　　机械性能：血管需要具备足够的机械性能，以承受体内植入过程中的缝合，以及支撑约2000-3000 mmHg的生理血压。仅仅制造出模拟血管的细胞化管状结构并不足够，这些结构还应在动态生物反应器中进行调节和成熟。这种活性成熟条件是获取功能性植入式血管的关键。[6]

　　血管组织以其独特的复杂性著称，虽然其基本功能是输送血液，但其组织构造和结构特征却因血管类型（如动脉、毛细血管或静脉）以及大小（如大血管直径大于6毫米，小血管直径小于1毫米）而存在显著的差异。其中，动脉以其坚韧的结构最为引人注目，承担着高效的长距离输送任务，通常需要强化或替换以恢复健康的血流。动脉由三层结构构成：内膜负责防止血栓形成，介质则提供必要的机械强度，而外膜则是一种富含胶原蛋白的结缔组织，维护血管的完整性，防止其变得过于脆弱。[7]

　　内膜（Intima）：由内皮细胞、基底层和无细胞内皮下间隙构成，其中，内皮细胞形成了紧密的防线，直接与血液接触。这些细胞在血液凝固、炎症反应、屏障功能、血流调节以及细胞外基质的合成和分解中起着关键的角色。内膜与介质之间由内部弹性层（Internal Elastic Lamina, IEL）隔开，该层含有弹性蛋白和IV型胶原蛋白。

　　介质（Media）：主要由平滑肌细胞和I型、III型胶原蛋白构成，平滑肌细胞和胶原纤维在血管轴线上呈同心圆排列，呈现出收缩表型，使得血管具有收缩和扩张的能力。

　　外膜（Adventice）：作为血管壁的最外层，主要由嵌入在松散的胶原蛋白基质中的成纤维细胞以及I型和III型胶原蛋白等结缔组织构成，其功能是防止血管过度伸展或过度收缩。图1：血管的一般结构

　　显然，尽管血管常被简化为单纯的管道，其内部结构却异常复杂，各层之间的相互作用使得血管能够对供应的器官进行适时的重塑和灌注。对于在体外模拟血管的研究，这种复杂性是必须深入理解并精准模拟的关键。

　　在活性血管组织的生长和整合过程中，选取恰当的细胞来源是关键。然而，选择血管细胞所面临的挑战在于，其来源和数量的限制性。这其中，供体年龄的增长和所选细胞类型会影响细胞的增殖能力。[8]

　　首先需要关注的是患者自身的自体细胞。这种细胞类型因其降低移植排斥反应的潜力而备受关注。但是，分离并扩增足够数量的原代细胞（Primary Cells）以满足治疗需求，常常成为一大难题。

　　随着科技进步，干细胞技术（包括自体干细胞和诱导性多能干细胞，即Induced Pluripotent Stem Cells, iPSC）成为了一种富有前景的内皮细胞和平滑肌细胞的替代来源。成体干细胞的优点是可立即使用，然而，其活力受限于患者的健康和年龄，这使得治疗策略和验证过程复杂化。因此，胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells, ESC）越来越多地应用于血管组织工程研究，尽管其在临床使用中存在伦理和潜在致瘤性问题。[9][10][11][12]

　　iPSC因其几乎无限的细胞供应和能够分化为特定血管系列的优点而备受瞩目。[13]然而，就如同ESC，iPSC的应用也引发了对其在肿瘤发生中可能的角色和植入细胞命运的关切。[14]此外，目前各研究实验室采用的分化方案各异，因此，为了确保这些分化细胞能安全有效地应用于临床，必须建立统一且可靠的方案，以评估每个分化步骤对细胞功能的影响。

　　在血管组织工程中，选择合适的生物材料以便形成血管组织至关重要。受到血管壁的复杂结构影响，生物材料的选择必须基于其机械、物理、化学、生物特性，生物相容性，及其可降解性等多方面因素。此外，对生物材料在机械刺激和温度变化下的反应，化学组成和微观结构变化，以及动力学特性等方面的理解也非常重要。[15]

　　在这个领域，目前的研究主要使用三类生物材料：合成聚合物（Synthetic Polymers）、可生物降解聚合物（Biodegradable Polymers）、以及生物聚合物（Biopolymers）。如聚四氟乙烯（ePTFE）、聚对苯二甲酸乙二醇酯（Dacron?）和聚氨酯等合成聚合物一直以来在血管工程中被广泛研究和使用。然而，这些材料的生物相容性较差，且大多数低渗透性，不利于营养物质扩散。

　　为了克服这些限制，研究者开始使用不同的生物材料配方，配合血管细胞的播种进行血管结构的再造。在最后的阶段，利用细胞分泌的细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）与血管细胞一同重建血管。这种方式提高了透性和生物相容性，但如何在保证足够机械强度的同时，优先使用天然生物材料，仍然是一个挑战。[16]

　　另外一些研究则利用主要由聚合物（如藻酸盐，明胶，纤维蛋白或琼脂糖等）[17][18]组成的水凝胶（Hydrogels）[19]。然而，更多的研究正专注于开发复杂的多功能生物材料，封装感兴趣的蛋白质以指导血管组织的形成。

　　对于具有特定表面化学修饰的合成材料的使用，添加特定涂层甚至蛋白质修饰的研究也在进行中。在选择这些策略时，必须考虑到他们对血管最终使用的影响。如果是针对原位血管再生的研究，材料的选择和设计必须以启动自然愈合反应为主要目标。而如果是基于离体血管的发育的研究，那么人体血管细胞的体外培养步骤以及这些细胞与特定生物材料的结合使其粘附，增殖和成熟则至关重要。这些在合适的生物材料上进行的体外细胞培养步骤，将最终确定血管在植入前的机械和生物学特性。

　　早期的血管组织工程尝试始于1950年代，以合成材料制成的无细胞血管移植物来替换体内大直径（大于6毫米）的动脉。然而，创造小直径（小于6毫米）的血管移植物存在诸多挑战。为解决这一问题，研发了组织工程血管（Tissue-Engineering Blood Vessel, TEBV）。这种血管通常由胶原蛋白支架形成，然后接种细胞以生成血管的三个主要组成层。尽管此种模型的机械强度较低，但是它验证了利用人类细胞进行血管移植的组织工程研发是可行的。[20]

　　随后，科研者试图结合TEBV的生理特性和血管移植物的机械阻力特性。他们在合成材料上直接接种内皮细胞，创造了第一个带有单层内皮细胞的合成移植物。然而，由于合成材料难以被体内吸收，科研者开始探索创建全生物的TEBV。[21]

　　在1998年，第一个可生物降解的TEBV应运而生。该种TEBV完全基于使用培养的人类细胞，无需任何合成或外源性生物材料。尽管此种TEBV的使用寿命相对较短，但它的机械强度达到了2600mmHg，较早期的模型有显著提升。[22]

　　面对血管组织工程的挑战，即如何在管状结构内大规模分布、组织和和成熟各种细胞，科研者已开发出多种技术。例如，细胞片工程、异源血管组织的脱细胞化，以及通过静电纺丝或成型制作合成支架，然后进行细胞接种等。

　　基于支架的细胞播种策略是组织工程和再生医学领域的关键研究课题。该策略充分利用3D多孔结构，以此来促进新组织的形成以及材料的生物降解。主要方式就是将细胞直接接种到具有生物相容性的支架上，让细胞在其上粘附并生长。这个过程可以采用静态或动态方式，通过将支架浸入含有目标细胞的溶液中，让细胞自然粘附在支架上。[23][24]利用脱细胞化异种组织的支架是一种简便的方式。这种方式的优势在于可以保留原有血管的结构和细胞外基质的复杂构造。但是，尽管其使用便利，可能会引发宿主的严重免疫反应，从而限制了其使用范围。[25]图2：使用天然或工程血管来源制造组织工程血管静电纺丝技术是另一种制备多孔支架的方法。这项技术利用电力将溶解或熔化的聚合物纤维生成为数百纳米的直径，之后，沉积的纳米纤维形成高度多孔的网状物。然而，由于其使用高电压和大部分溶剂型材料，这项技术不能直接应用于活细胞的沉积。[26]图3：通过静电纺丝技术制造组织工程血管对于细胞播种策略，细胞的接种密度、均匀性和完整性是血管组织播种和功能的关键因素。被动接种是标准程序，但是存在一些问题，如支架中细胞分布的异质性，以及对支架内细胞迁移的高度依赖等。为了解决这些问题，已经开发出动态播种技术，如利用旋转系统，通过离心力将细胞均匀地转移到多孔支架中，或者利用磁场导向磁标记的细胞，使其形成管状结构。[27]体内支架细胞化和培养是一种富有前景的方案，它能直接将结构集成到宿主系统中，实现快速细胞化。但是，支架与宿主细胞间的复杂相互作用使得预测支架的命运变得相当困难，可能导致纤维化、血栓形成、孔隙阻塞，以及支架的缓慢降解。[28][29]

　　模塑细胞化生物材料技术通过简单的方式制造出各种定制的形状结构。这个过程很直观：只需将生物材料溶液倒入一个具有所需外形的模具中，待溶液凝固，形成网状或凝胶化后，模具便可被移除，从而得到预设定的结构。尽管如此，这项技术的应用仍有其困难，例如在铸造过程中，细胞在凝胶化之前可能会因重力和沉淀作用在模具底部积累，导致细胞分布的非均匀性。[30][31]图4：通过成型技术制造组织工程血管A：将不同的聚合物溶液注入双隔室模具中B：将可牺牲的模具成型为一种ECM水凝胶

　　细胞片工程技术，特别是细胞片滚动技术，是基于在二维环境中培养细胞层，然后将其与二维基质一起转移。一个常见的做法是将细胞层包裹在管状物或心轴上，然后再进行包裹，直到形成所需数量的细胞层组成的血管。或者，也可以在心轴周围卷绕有生物材料层的细胞层。此外，细胞片堆叠方法允许不同的细胞层按序堆叠。[32]图5：通过细胞片工程制造组织工程血管A：不同细胞类型片材的顺序轧制B：将培养细胞片滚动到聚合物片上C：在同一基质上滚动培养的两种不同细胞类型D：三片细胞叠放

　　然而，以上所有技术，尽管都能创造出模拟天然血管结构的血管结构，但大多数都基于细胞接种，这在三维架构中无法精确定位细胞。同时，这些技术过程复杂，涉及多个步骤，且时间耗费长，尤其是对于制造三个不同血管层。因此，为了克服这些困难，组织工程研究人员正在探索使用创新的先进技术，例如增材制造方法，如3D生物打印，这种技术有望在一个制造步骤中就完成三层蜂窝化系统的生产。

　　3D打印，也称为增材制造，是一项依靠计算机辅助设计（CAD）模型进行连续材料层堆积的技术，以此创造出三维物体。其中，当细胞被添加到打印材料中，得到的混合物被称为生物墨水。生物墨水的出现使得可以生产厘米级别大小的3D物体，并对细胞在物体内的位置进行空间控制。这种技术被称为生物打印技术，使得制造具有解剖形态、复杂且功能性异质细胞结构成为可能。[33]

　　目前，支持生物打印的技术有许多，如喷墨滴沉积（Inkjet Drop Deposition）[34]、激光辅助沉积（Laser-assisted Deposition）[35]、立体光刻（Stereolithography）[36]和微挤出（Microextrusion）[37]等。但不是所有的技术都适合制造血管组织，尤其是由厘米级别大小的管状结构的三个不同细胞层组成的血管组织。微挤出式生物打印因其可使用多种可能的生物材料和细胞，而成为制造大型血管组织的理想选择。图6：用于血管组织工程的不同3D生物打印技术A：挤出生物打印B：同轴生物打印C：浴内生物打印

　　同轴技术，是一种基于使用特殊同轴喷嘴的技术，它可以将一种生物墨水“包裹”在另一种生物墨水中，从而在血管工程中形成多个同心层，构造出管状结构。利用这种三重同轴生物打印技术，科研人员已经成功用两种不同的生物墨水制造出了仿生的组织工程血管。[38]

　　然而，尽管同轴技术目前是制造具有预期三层结构的血管组织的最先进方法，但其制造的血管大小和结构仍然受到同轴喷嘴尺寸的限制。因此，如何在尽可能短的时间内独立生物打印出每一层的相同结构，仍是未来研究的重要方向。

　　要制造出功能性的三层血管——由内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞组成，制作过程仅仅是初步。接下来的关键步骤，被称为组织成熟，也许是制造血管组织中最复杂、最关键，也是耗时最长的环节。在这个阶段，细胞适应自己的三维环境，形成细胞外基质，并建立细胞与细胞之间的连接。[39]

　　研究表明，流体流动产生的机械应力能够促进细胞及组织的成熟。细胞的成熟，以及最终的组织形成，其实是体内环境的一种体现。因此，用生物反应器模拟体内环境，以进行组织工程，已经成为一项巨大的挑战。这些年来，使用生物反应器在血管工程领域的主要目标是支架内皮化。如今，精细且准确地控制构建体内的细胞成熟和增殖对于组织生成至关重要，因此使用特定的生物反应器已经成为必要。[40][41]

　　在血管工程领域，生物反应器被划分为三大类：静态生物反应器、动态生物反应器和仿生生物反应器。静态生物反应器是在受控环境下进行传统的培养瓶培养，使组织在其内部自然成熟。动态生物反应器是一种特殊的培养瓶，它具备进出口，可以灌输细胞进行内皮化，或者在预培养的组织内部灌输流动，利用流体动力学应力诱导细胞成熟。[42]仿生生物反应器是设计来模拟体内环境的。这种系统能够控制多个参数，如灌流量、pH值、温度、氧气和培养基的进入，以达到最佳的细胞培养效果。其主要目标是提供足够的营养和氧气供应，同时排除废物，以便于组织内部细胞的正确增殖和活动。同时，它通过模拟体内剪切应力条件，使血管细胞准确阐明其生理功能。[43]

　　生物反应器，作为血管工程领域的关键装备，发挥着推动并模拟血管成熟的重要作用。以下为生物反应器的设计与应用策略做一番探讨。

　　生物反应器设计：市售与自制并行

　　市售与自制的生物反应器各具特色，都在血管工程中扮演了重要角色。市售的LumeGen生物反应器[44]和ElectroForce?生物反应器[45]在模拟生理条件——脉冲与血流，以及提供受控环境方面具有优异的表现。而自制的生物反应器，优点在于灵活多样，如双模式生物反应器系统[46]、自制灌注生物反应器[47]、双层血管移植物的自制灌注生物反应器[48]等，都能满足特殊的科研需求，比如制造血管构建体和刺激等。图7：市售生物反应器的设计图A：LumeGen生物反应器设计图B：ElectroForce?生物反应器设计图图8：自制生物反应器的概念图A：双模式生物反应器系统B：灌注生物反应器C：双层血管移植物的灌注生物反应器

　　生物反应器应用策略：多元刺激引导成熟

　　血管成熟策略基于多种刺激手段，如血流、机械刺激、脉冲压力等。流动所诱导的剪切应力，对平滑肌细胞迁移到血管结构支架以及内皮细胞的成熟和增殖具有重要影响。同时，通过模拟心跳的脉冲，产生爆破压力，可以对血管壁施加拉伸力，从而进一步促进细胞成熟。[49][50]

　　生物反应器：挑战与未来展望

　　总的来说，生物反应器在血管工程中主要用于支架的内皮化植入，为内膜层的形成打好基础，而对于另外两层的形成和成熟则仍面临挑战。尽管3D生物打印等技术已使三层血管组织的重建变得可能，但新重建的血管仍需要通过生物反应器的成熟过程来获得生理特性和足够的机械强度。然而，未成熟的血管必须足够强壮，能够抵抗内部流动并在整个成熟过程中保持在生物反应器中，这便是未来需要研究和解决的关键问题。[51]

　　Reference:Devillard, C.D. and Marquette, C.A., 2021. Vascular tissue engineering: Challenges and requirements for an ideal large scale blood vessel.Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, p.913.