旁观者效应损伤造血干祖细胞的研究模型的构建方法及其应用

　　1.本发明属于造血干细胞移植技术领域，尤其涉及旁观者效应损伤造血干祖细胞的研究模型的构建方法及其应用。背景技术：2.造血干细胞(hsc)移植是治疗各种恶性血液系统疾病及免疫功能障碍的重要手段。hsc移植率低和造血重建缓慢是hsc在临床疾病治疗中的应用瓶颈。目前尚无有效策略明显地提高hsc移植率和造血重建速度，究其根本原因是目前对hsc移植后受到受体微环境作用以及hsc再生的分子机制尚不明确。3.目前临床上在进行hsc移植时，仍需要对患者进行大剂量的放疗或化疗预处理。然而，大剂量放疗预处理在清髓的同时，会对植入的hsc产生“旁观者”效应(ribe)损伤，即直接受到辐射的细胞通过信号转导引起未受到辐射的邻近细胞的损伤，从而不利于hsc的植入和长期造血重建。然而，目前ribe对hsc的影响及其分子机制的研究仍然是空白的。4.研究发现，受到ribe的造血干祖细胞(hspc)内ros大量聚集，导致hspc的dna损伤，线粒体功能障碍，atp生成减少，代谢表型发生改变，有氧呼吸和无氧糖酵解减弱。hsc的长期造血重建能力、自我更新能力以及造血祖细胞(hpc)的体外克隆形成能力下降。在机制上，受到ribe的hspc胞内γ-h2ax表达升高，atm-chk2、atr-chk1信号通路激活，p53发生磷酸化；下游激活p21、p16、puma-caspases，导致hspc细胞周期发生阻滞，衰老和凋亡增加。5.因此，如何提供可用于ribe研究的模型，为体内外干预ribe的损伤作用、提高造血干细胞的植入率以及促进长期造血重建提供新方法，为临床上需要放疗预处理的骨髓移植患者提供hsc移植的新策略奠定理论基础，已成为亟待解决的问题。技术实现要素：6.针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供旁观者效应损伤造血干祖细胞的研究模型的构建方法及其应用，通过构建旁观者效应损伤造血干祖细胞的体内及体外研究模型，并使用模型进一步揭示和完善ribe对造血干祖细胞的损伤机制，为需要做放疗预处理的骨髓移植患者制定有效的治疗方案提供了理论基础。7.为达此目的，本发明采用如下技术方案：8.第一方面，本发明提供了旁观者效应损伤造血干祖细胞的体内研究模型的构建方法，所述构建方法包括：9.将造血干祖细胞注射到x射线照射后的小鼠体内，分选归巢到小鼠骨髓中的造血干祖细胞，即为所述旁观者效应损伤造血干祖细胞的体内研究模型。10.本发明中，先通过x射线照射小鼠，再将造血干祖细胞注射到小鼠的体内，辐射后的细胞将信号转导给未经辐射照射的造血干祖细胞并引起其损伤，在体内模拟了旁观者效应损伤的过程，与实际的ribe过程十分接近，应用于相关机理的研究中，结果准确，对于造血干祖细胞移植的研究意义重大。11.优选地，所述注射的方法包括经尾静脉注射。12.优选地，所述注射的造血干祖细胞数量为(1～5)×106个/只，例如可以是1×106个/只、2×106个/只、3×106个/只、4×106个/只或5×106个/只等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。13.优选地，所述x射线照射的总剂量为4～10gy，例如可以是4gy、5gy、6gy、7gy、8gy、9gy或10gy等，照射次数为1～3次，例如可以是1次、2次或3次，照射频率为1～3次/天，例如可以是1次/天、2次/天或3次/天，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。14.本发明中，所述x射线照射的方案包括：(1)4gy照射1次；(2)10gy照射1次；(3)3.3gy每天照射3次，持续1天；(4)3.3gy每天照射1次，持续3天。15.优选地，所述小鼠包括免疫缺陷小鼠。16.优选地，所述分选的方法包括流式分选。17.优选地，所述分选的时间为注射后的15～18h，例如可以是15h、15.5h、16h、16.5h、17h、17.5h或18h等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。18.作为优选技术方案，本发明所述的旁观者效应损伤造血干祖细胞的体内研究模型的构建方法，包括以下步骤：19.(1)x射线照射：20.对免疫缺陷小鼠进行x射线照射，所述x射线照射的方法包括4gy照射1次、10gy照射1次、3.3gy每天照射3次持续1天或3.3gy每天照射1次持续3天中的任意一种；21.(2)将造血干祖细胞按(1～5)×106个/只的数量经尾静脉注射到x射线照射后的小鼠体内；22.(3)注射后的15～18h，流式分选归巢到小鼠骨髓中的造血干祖细胞，即为所述旁观者效应损伤造血干祖细胞的体内研究模型。23.第二方面，本发明提供了第一方面所述的旁观者效应损伤造血干祖细胞的体内研究模型的构建方法构建得到的旁观者效应损伤造血干祖细胞的体内研究模型。24.第三方面，本发明提供了旁观者效应损伤造血干祖细胞的体外研究模型的构建方法，所述构建方法包括：25.将造血干祖细胞与x射线照射后的骨髓细胞进行transwell共培养，收集培养上室中的造血干祖细胞，即为所述旁观者效应损伤造血干祖细胞的体外研究模型。26.本发明中，通过将造血干祖细胞与x射线照射后的骨髓细胞进行transwell共培养，构建了旁观者效应损伤造血干祖细胞的体外研究模型，可以从体外对ribe的作用机制进行进一步验证。其与体内研究模型相互配合，共同用于相关的基础研究中，保证了研究结果的准确性与适用性，应用价值更高。27.优选地，所述x射线照射的总剂量为4～10gy，例如可以是4gy、5gy、6gy、7gy、8gy、9gy或10gy等，照射次数为1～3次，例如可以是1次、2次或3次，照射频率为1～3次/天，例如可以是1次/天、2次/天或3次/天，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。28.本发明中，所述x射线照射的方案包括：(1)4gy照射1次；(2)10gy照射1次；(3)3.3gy每天照射3次，持续1天；(4)3.3gy每天照射1次，持续3天。29.优选地，所述造血干祖细胞与x射线照射后的骨髓细胞的数量比例为1:(8～12)，例如可以是1:8、1:9、1:10、1:11或1:12等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。30.优选地，所述共培养的条件为36～38℃、4％～5％的co2浓度，温度例如可以是36℃、36.5℃、37℃、37.5℃或38℃等，co2浓度例如可以是4％、4.2％、4.4％、4.6％、4.8％或5％等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。31.优选地，所述胎牛血清在所述共培养使用的培养基中的体积分数为8％～10％，例如可以是8％、8.5％、9％、9.5％或10％等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。32.优选地，所述血小板生成素(tpo)在所述共培养使用的培养基中的浓度为48～52ng/ml，例如可以是48ng/ml、48.5ng/ml、49ng/ml、49.5ng/ml、50ng/ml、50.5ng/ml、51ng/ml、51.5ng/ml或52ng/ml等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。33.优选地，所述干细胞因子(scf)在所述共培养使用的培养基中的浓度为48～52ng/ml，例如可以是48ng/ml、48.5ng/ml、49ng/ml、49.5ng/ml、50ng/ml、50.5ng/ml、51ng/ml、51.5ng/ml或52ng/ml等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。34.优选地，所述flt-3(fms-like tyrosine kinase3，fms样酪氨酸激酶3)在所述共培养使用的培养基中的浓度为48～52ng/ml，例如可以是48ng/ml、48.5ng/ml、49ng/ml、49.5ng/ml、50ng/ml、50.5ng/ml、51ng/ml、51.5ng/ml或52ng/ml等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。35.优选地，所述共培养使用的培养基为8％～10％体积分数的胎牛血清、48～52ng/ml的血小板生成素、48～52ng/ml的干细胞因子和48～52ng/ml flt-3，余量为imdm培养基。36.优选地，所述收集的方法包括离心收集。37.优选地，所述收集的时间为共培养后的15～18h，例如可以是15h、15.5h、16h、16.5h、17h、17.5h或18h等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。38.作为优选技术方案，本发明所述旁观者效应损伤造血干祖细胞的体外研究模型的构建方法，包括以下步骤：39.(1)x射线照射：40.对骨髓细胞进行x射线照射，所述x射线照射的方法包括4gy照射1次、10gy照射1次、3.3gy每天照射3次持续1天或3.3gy每天照射1次持续3天中的任意一种；41.(2)将造血干祖细胞与x射线照射后的骨髓细胞进行transwell共培养，所述造血干祖细胞与x射线照射后的骨髓细胞的数量比例为1:(8～12)，所述共培养的条件为36～38℃、4％～5％的co2浓度，使用的培养基为8％～10％体积分数的胎牛血清、48～52ng/ml的血小板生成素、48～52ng/ml的干细胞因子和48～52ng/ml flt-3，余量为imdm培养基；42.(3)共培养后的15～18h，离心收集培养上室中的造血干祖细胞，即为所述旁观者效应损伤造血干祖细胞的体外研究模型。43.第四方面，本发明提供了第三方面所述的旁观者效应损伤造血干祖细胞的体外研究模型的构建方法构建得到的旁观者效应损伤造血干祖细胞的体外研究模型。44.第五方面，本发明提供了n-乙酰半胱氨酸、萝卜硫素和白藜芦醇在缓解和/或治疗造血干祖细胞的旁观者效应损伤中的应用。45.优选地，所述n-乙酰半胱氨酸、萝卜硫素和白藜芦醇通过清除造血干祖细胞中的活性氧来缓解和/或治疗造血干祖细胞的旁观者效应损伤。46.本发明中，n-乙酰半胱氨酸(nac)、萝卜硫素(sulforaphane)和白藜芦醇(resveratrol)作为抗氧化剂，可以清除造血干祖细胞中的活性氧，从而缓解或治疗因放疗预清髓而对植入的造血干祖细胞产生的旁观者效应损伤。47.第六方面，本发明提供了n-乙酰半胱氨酸、萝卜硫素和白藜芦醇在提高造血干祖细胞移植效果中的应用。48.本发明中，n-乙酰半胱氨酸、萝卜硫素和白藜芦醇均能不同程度地降低ribe对造血干祖细胞的损伤，减少移植进入的造血干祖细胞的凋亡、老化，从而提高造血干祖细胞的植入率、促进长期造血重建以及提高人造血祖细胞的体外克隆形成能力。49.优选地，所述n-乙酰半胱氨酸、萝卜硫素和白藜芦醇通过清除造血干祖细胞中的活性氧来缓解和/或治疗造血干祖细胞的旁观者效应损伤，进而提高造血干祖细胞的移植效果。50.优选地，所述n-乙酰半胱氨酸、萝卜硫素和白藜芦醇在x射线照射前使用。51.相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：52.(1)本发明建立了ribe损伤造血细胞的体内研究模型，弥补了ribe对造血细胞损伤研究的空白，为ribe损伤造血细胞的研究提供了基础；53.(2)本发明还建立了ribe损伤造血细胞的体外研究模型，通过此模型证明体外ribe对造血细胞的不良影响与体内基本一致，并借助此体外研究模型进一步探究了ribe损伤hsc的机制；54.(3)本发明利用三种小分子抗氧化药物(nac、sulforaphane和resveratrol)对ribe体内/外模型进行干预，结果显示均能不同程度地降低ribe对hspc长期造血重建和克隆形成能力的损伤，为临床上需要放疗预处理的骨髓移植患者制定有效的治疗方案提供了理论基础。附图说明55.图1a为实施例3中ir组和nr组的外周血中cd45+细胞占比的统计结果图片；56.图1b为实施例3中ir组和nr组骨髓中细胞植入的流式检测结果图片；57.图1c为实施例3中ir组和nr组骨髓中细胞植入的统计结果图片；58.图1d为实施例3中ir组和nr组骨髓中细胞分化的统计结果图片；59.图1e为实施例3中ir组和nr组骨髓中cd45-cd235a+细胞占比的统计结果图片；60.图2a为实施例4中ir组和nr组的外周血中cd45+细胞占比的统计结果图片；61.图2b为实施例4中ir组和nr组骨髓中细胞植入的流式检测结果图片；62.图2c为实施例4中ir组和nr组骨髓中细胞植入的统计结果图片；63.图2d为实施例4中ir组和nr组骨髓中细胞分化的统计结果图片；64.图3a为实施例5中ir组、nr组和阴性对照组(neg)的dcf-da的检测曲线图片；65.图3b为实施例5中dcf-da法检测ir组和nr组的活性氧改变倍数统计结果图片；66.图3c为实施例5中dhe法检测ir组和nr组的活性氧改变倍数统计结果图片；67.图3d为实施例5中ir组和nr组的γ-h2ax mfi改变倍数统计结果图片；68.图4a为实施例6中ir组、nr组和neg组的dcf-da的检测曲线图片；69.图4b为实施例6中dcf-da法检测ir组和nr组的活性氧改变倍数统计结果图片；70.图4c为实施例6中ir组、nr组和neg组的dhe的检测曲线图片；71.图4d为实施例6中dhe法检测ir组和nr组的活性氧改变倍数统计结果图片；72.图4e为实施例6中ir组和nr组细胞的γ-h2ax基因的免疫荧光染色图片以及wb检测图片(比例尺＝7μm)；73.图4f为实施例6中ir组和nr组细胞的atm、atr、chk1和chk2的基因表达水平的检测结果图片；74.图4g为实施例6中ir组和nr组细胞的atr、atm、chk1、chk2、磷酸化的chk1和磷酸化的chk2的wb检测结果图片；75.图4h为实施例6中ir组和nr组细胞的p-atm、p-53bp1和foxo3a的免疫荧光染色图片(比例尺＝7μm)；76.图5a为实施例7中dcf-da法检测各组细胞的活性氧改变倍数统计结果图片；77.图5b为实施例7中各组细胞的磷酸化p-53和γ-h2ax的免疫荧光染色图片(比例尺＝7μm)；78.图5c为实施例7中各组细胞的凋亡比例的检测结果图片；79.图6a为实施例8中骨髓中各组细胞植入的流式检测结果图片；80.图6b为实施例8中骨髓中各组细胞植入的统计结果图片；81.图6c为实施例8中骨髓中cd45+细胞的植入率倍数变化的结果图片；82.图6d为实施例8中各组细胞在骨髓中分化的统计结果图片；83.图7a为实施例9中骨髓中各组细胞植入的流式检测结果图片；84.图7b为实施例9中骨髓中各组细胞植入的统计结果图片；85.图7c为实施例9中骨髓中cd45+细胞的植入率倍数变化的结果图片；86.图7d为实施例9中各组细胞在骨髓中分化的统计结果图片。具体实施方式87.为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。88.实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。89.材料与方法：90.fc-r阻断剂、cd34+和ls柱购自miltenyi biotec公司；91.imdm-fbs购自gibco公司；92.抗兔488抗体、apc-cy7、pe-cy7、apc、percp-cy5.5、apc-cy7、pe、fitc和bv510购自bd公司；93.tpo、scf和flt-3购abm公司。94.nog小鼠来自北京维通利华实验动物技术有限公司。95.人脐带血由天津市中心妇产医院提供，并且得到了中国医学科学院血液病医院血液学研究所伦理委员会的同意，且所有脐带血供者均签署了知情同意书。96.正常人骨髓细胞来自骨髓移植的无关供者，所有获取细胞均得到了中国医学科学院血液病医院血液学研究所伦理委员会的同意，且所有骨髓细胞供者均签署了知情同意书。97.人脐血cd34+细胞分离方法如下：98.(1)将新鲜脐血分装于无菌的血浆瓶中，加入hes(羟乙基淀粉)，体积比例为脐血:hes＝5:1，充分混匀后，室温静置40min，沉降红细胞；99.(2)于50ml离心管中预置15ml ficoll，将30ml去除红细胞的脐血缓慢加在上面，不要破坏界面；100.(3)在20℃下2000rpm离心20min，升降速均设置成no brake；101.(4)离心结束后，小心吸掉上层液体，收集白膜层的单个核细胞，将单个核细胞放入离心管，加入pbs溶液，混匀后，1500rpm离心8min；102.(5)弃上清液，用20ml pbs重悬细胞，混匀后取10μl计数，剩余细胞在20℃下1500rpm再次离心8min；103.(6)弃上清液，按每108个细胞加入300μl的比例加入pbs，充分重悬细胞；104.(7)避光条件下，按每108个细胞加入100μl的比例加入fc-r阻断剂，充分重悬细胞；105.(8)避光条件下，按每108个细胞加入100μl的比例加入cd34+磁珠，充分重悬细胞，4℃孵育30min；106.(9)孵育结束后，向每管中加入pbs，吹打混匀后1500rpm离心8min；107.(10)弃上清液，按每108个细胞加入500μl的比例加入pbs，重悬细胞；108.(11)将ls柱安装到磁铁架子上，用pbs润洗柱子3次，每次3ml；109.(12)把充分重悬的细胞悬液逐滴加到ls柱里(柱子上放尼龙膜过滤细胞)，使标记好磁珠的细胞通过梯度磁场；110.(13)向柱子中加3ml pbs冲洗柱子，重复3次；111.(14)将ls柱子小心移出磁场，将ls柱放在无菌的收集管上，加入3ml pbs，用活塞快速推出细胞，混匀后计数；112.(15)富集到的人脐血cd34+细胞可用于后续实验，或冻存于液氮中。113.人骨髓细胞的分离方法如下：114.(1)将新鲜获取的健康人骨髓血放置于无菌的50ml离心管中，加入红细胞裂解液(ack)，比例为骨髓血:ack＝1:4，充分混匀后，室温静置不少于6min，裂解红细胞；115.(2)在4℃下1500rpm离心5min；116.(3)弃上清，每管用20ml pbe重悬细胞，充分混匀，取10μl计数，在4℃下1500rpm离心5min；117.(4)弃上清，收集到的骨髓细胞用imdm-fbs重悬备用。118.免疫荧光染色的方法如下：119.(1)将收集到的cd34+细胞用1ml pbs清洗1次，1500rpm离心5min，弃尽上清液；120.(2)用pbs重悬细胞，调整细胞浓度为1.0×106个/ml；121.(3)甩片：取细胞50μl(细胞总数为5×104个)，500rpm离心8min后，小心取下载玻片，并用记号笔在反面做好标记，用油笔在正面细胞周围画框；122.(4)洗片：将100μl pbs从细胞旁边小心滴到载玻片上，洗涤细胞3min，将载玻片倾斜，从一侧吸走pbs(以下操作均同此)；123.(5)固定：将100μl 4％pfa从细胞旁边滴到载玻片上，室温固定15min；124.(6)洗片：每片载玻片上滴加100μl pbs，洗涤3min，重复2次；125.(7)通透：将新配的0.2％triton-x-100滴到载玻片上，室温通透15min；126.(8)洗片：每片载玻片上滴加100μl pbs，洗涤3min，重复2次；127.(9)洗片：每片载玻片上滴加100μl pbb(pbs配成的0.5％bsa)，洗涤3min，重复3次；128.(10)封闭：每片载玻片上滴加100μl 2％bsa(pbs配制)，室温封闭1h；129.(11)一抗孵育：按照说明书上的指示用pbb稀释一抗，将配好的一抗溶液滴到载玻片上，每片滴加100μl，盖上封口膜，4℃孵育过夜；130.(12)洗片：揭去封口膜，用pbb洗片5次，每片滴加100μl，每次3min；131.(13)二抗孵育：将抗兔488抗体，按1:1000用pbb稀释，每片滴加100μl，室温避光孵育1h；132.(14)洗片：用pbb洗片5次，每片滴加100μl，每次3min；133.(15)洗片：用pbs洗片3次，每片滴加100μl，每次3min；134.(16)封片：每片滴加dapi 8μl，用盖玻片封片后上机观察。135.实施例1136.本实施例构建旁观者效应损伤造血干祖细胞的体内研究模型以及抗氧化药物干预的旁观者效应损伤造血干祖细胞的体内研究模型，步骤如下：137.(1)将6～8周龄、体重为18～22g的雌性免疫缺陷小鼠(nog小鼠)随机分组，分为nr组(对照组)、ir组(x射线照射组)、ir+nac组(x射线照射前使用nac预处理)、ir+sf组(x射线照射前使用sulforaphane预处理)和ir+res组(x射线照射前使用resveratrol预处理)；138.(2)ir+nac组、ir+sf组和ir+res组小鼠在照射前7天用抗氧化药物处理，处理方案如下：139.ir+nac组：腹膜内注射，100mg/kg/天，1天1次，连续7天，并同时加喂含1mg/ml nac的水；140.ir+sf组：灌胃，5mg/kg/天，1天1次，连续7天；141.ir+res组：灌胃，20mg/kg/天，1天1次，连续7天；142.(3)对各组小鼠进行10gy的x射线照射，剂量率1.2gy/min，nr组为对照组，不作任何处理；143.(4)将富集的人脐血cd34+细胞按1×106/只的数量经尾静脉注射到各组小鼠体内；144.(5)注射后17h，流式分选归巢到小鼠骨髓中的人cd34+细胞，即可得到在体内受到ribe的人cd34+细胞，以供进一步研究。145.其中，流式分选体内受到ribe的人cd34+细胞的方法如下：146.1)脱颈处死小鼠，于75％酒精中浸泡2min；147.2)取小鼠双上肢的肱骨及双下肢的股骨、胫骨和髂骨，用器械去除骨表面附着的肌肉组织，用pbe冲取骨髓细胞；148.3)加红细胞裂解液裂解红细胞，室温下静置6min，4℃下1500rpm离心5min，弃上清；149.4)1ml pbe重悬细胞，用尼龙膜过滤收集到的小鼠骨髓细胞，并计数；150.5)标记抗体，4℃避光孵育30min；151.标记的细胞类型、使用的抗体种类以及用量如表1所示。152.6)1ml pbe洗1次，4℃下1500rpm离心5min，弃上清；153.7)2ml pbe重悬细胞，加入dapi，流式分选小鼠骨髓中的人cd34+细胞。154.表1155.标记荧光通道用量(μl)mcd45apc-cy70.5hcd45pe-cy71hcd34apc1156.实施例2157.本实施例构建旁观者效应损伤造血干祖细胞的体外研究模型以及抗氧化药物干预的旁观者效应损伤造血干祖细胞的体外研究模型，步骤如下：158.(1)配置干细胞完全培养基(含10％体积分数的胎牛血清、50ng/ml tpo、50ng/ml scf和50ng/ml flt-3，余量为imdm培养基)，以及含nac(100μm)、sf(2.5μm)和res(0.1μm)的干细胞完全培养基；159.(2)分离人骨髓细胞，裂解其中的红细胞，分为nr组(对照组)、ir组(x射线照射组)、ir+nac组(x射线照射前使用nac预处理)、ir+sf组(x射线照射前使用sulforaphane预处理)和ir+res组(x射线照射前使用resveratrol预处理)，照射前30min，分别使用相应组别的培养基重悬骨髓细胞(nr组和ir组使用干细胞完全培养基)；160.(3)对各组人骨髓细胞进行10gy的x射线照射，剂量率1.2gy/min，nr组为对照组，不作任何处理；161.(4)将照射后的细胞接种到24孔板中，每孔1×106细胞，补加700μl对应组别的培养基；162.(5)将transwell加到24孔板上，将富集后的人脐血cd34+细胞使用200μl干细胞完全培养基重悬后加到transwell中，每孔1×105细胞，在37℃、5％co2条件下孵箱内进行共培养；163.(6)共培养17h后，收集上室中的人cd34+细胞，加1ml pbs重悬，吸取悬浮细胞计数，1500rpm离心5min，弃上清液后再用1ml pbs重悬，尼龙膜过滤并计数后，即可得到在体外受到ribe的人造血细胞，用于后续实验。164.实施例3165.本实施例将实施例1中ir组和nr组的体内受到ribe的人cd34+细胞移植到小鼠体内，检测其细胞植入及分化情况，步骤如下：166.(1)将6～8周龄、体重为18～22g的雌性nog小鼠随机分组，移植前一天对小鼠进行2gy的x射线照射，剂量率1.2gy/min；167.(2)将分选得到的各组人cd34+细胞分别经尾静脉移植给2gy照射后的小鼠，移植后4～20周连续检测小鼠外周血中的人cd45+细胞比例；168.(3)移植后20周，将小鼠脱颈处死，收集小鼠骨髓细胞1×106个，用染色缓冲液洗涤后重悬，加入抗体，4℃避光孵育30min，用2ml染色缓冲液洗涤1次，用流式细胞仪检测小鼠骨髓中细胞的植入及分化情况。169.标记的细胞类型、使用的抗体种类以及用量如表2所示。170.表2[0171][0172]ir组和nr组的外周血中cd45+细胞占比的统计结果如图1a所示，可以看出ir组外周血中人造血细胞的百分比明显下降；[0173]骨髓中细胞植入的流式检测结果如图1b所示，统计结果如图1c所示。由图可知，ir组比nr组低2.7倍(ir vs nr：38.7±7.2％vs 14.2±3.8％，p＝0.009)；更值得注意的是，ir组小鼠骨髓中人hpc(cd34+cd38+)和hsc(cd34+cd38-)也都明显低于nr组(hpc植入率下降约1.7倍，hsc植入率下降约2.8倍)，说明ribe对供体hsc/hpc的植入均有明显的影响。[0174]骨髓中细胞分化的检测结果如图1d所示，cd45-cd235a+细胞占比如图1e所示，可以看出植入到小鼠体内的人造血细胞主要分化为cd33+的髓系细胞和cd19+的b细胞(图1d)，ir组cd235a+红系细胞比例明显低于nr组(图1e)，说明受到旁观者效应的人hsc红系重建受到抑制。[0175]实施例4[0176]本实施例将实施例2中ir组和nr组的体外受到ribe的人cd34+细胞移植到小鼠体内，检测其细胞植入及分化情况，步骤与实施例3中的相同。[0177]ir组和nr组的外周血中cd45+细胞占比的结果如图2a所示，可以看出ir组在受体外周血中的植入比相对于nr组逐渐下降；[0178]骨髓中细胞植入的流式检测结果如图2b所示，统计结果如图2c所示。流式分析的检测结果发现ir组人cd45+细胞在小鼠骨髓中的植入相比于nr组下降了1.9倍(ir vs nr：18.5±3.3％vs 9.7±1.9％，p＝0.023)，说明受到体外ribe的人cd34+细胞的植入能力下降。另外，与nr组相比，ir组小鼠骨髓中人hsc(cd34+cd38-)明显降低，其比例下降约3.1倍，而hpc(cd34+cd38+)细胞的植入情况则与nr组没有明显差异。[0179]以上实验结果提示，体外ribe明显降低了人hsc的植入，但对人hpc的植入没有明显影响，这可能是由于hpc对ros水平升高及辐射的反应不如hsc敏感导致的。[0180]骨髓中细胞分化的检测结果如图2d所示，可以看出植入到小鼠体内的人造血细胞主要分化为cd33+的髓系细胞和cd19+的b细胞。[0181]实施例5[0182]本实施例通过活性氧荧光探针(dcf-da)以及二氢乙锭(dhe)检测实施例1中的ir组和nr组的体内受到ribe的人造血细胞的ros水平。[0183]dcf-da检测ros的步骤如下：[0184](1)脱颈处死小鼠，于75％酒精中浸泡2min；[0185](2)取小鼠的两根股骨，用器械去除骨表面附着的肌肉组织，用pbe冲取骨髓细胞；[0186](3)使用红细胞裂解液裂解红细胞，室温下静置6min，4℃下1500rpm离心5min，弃上清；[0187](4)用1ml pbe重悬细胞，用尼龙膜过滤收集到的小鼠骨髓细胞；[0188](5)4℃下1500rpm离心5min，弃上清；[0189](6)用100ml pbe重悬细胞，根据表3进行抗体标记，4℃下避光孵育30min；[0190](7)每管加1ml pbs，清洗细胞1次，1500rpm离心5min，弃尽上清液；[0191](8)用500μl 10μm的dcf-da溶液重悬细胞，37℃下摇床中孵育20min；[0192](9)用1ml冷的pbs终止反应，1500rpm离心5min，弃上清液；[0193](10)用1ml冷的pbs清洗1次，1500rpm离心5min，弃上清液；[0194](11)用500μl冷的pbs重悬，每管加入dapi溶液，使其终浓度为1μg/ml，过膜后1h内用流式细胞分析仪进行检测。[0195]表3[0196]标记荧光通道用量(μl)mcd45apc-cy70.5hcd45pe-cy71hcd34apc1[0197]dhe检测ros的步骤如下：[0198](1)小鼠处死前30min腹腔注射dhe，用量为10mg/kg/只；[0199](2)脱颈处死小鼠，于75％酒精中浸泡2min；[0200](3)取小鼠的两根股骨，用器械去除骨表面附着的肌肉组织，用pbe冲取骨髓细胞；[0201](4)使用红细胞裂解液裂解红细胞，室温下静置6min，4℃下1500rpm离心5min，弃上清；[0202](5)用1ml pbe重悬细胞，用尼龙膜过滤收集到的小鼠骨髓细胞；[0203](6)4℃下1500rpm离心5min，弃上清；[0204](7)根据表4进行抗体标记，4℃下避光孵育30min；[0205](8)用1ml pbe清洗，1500rpm离心5min，弃尽上清液；[0206](9)用500μl pbe重悬，加入dapi溶液，使其终浓度为1μg/ml，过膜后用流式细胞分析仪进行检测。[0207]表4[0208]标记荧光通道用量(μl)mcd45apc-cy70.5hcd45fitc1hcd34apc1[0209]ir组、nr组和阴性对照组(neg)的dcf-da的检测曲线如图3a所示，dcf-da法检测ir组和nr组的活性氧改变倍数统计结果如图3b所示，dhe法检测ir组和nr组的活性氧改变倍数统计结果如图3c所示。[0210]受到ribe的人hspc的ros水平明显增加，用dcf-da探针检测ir组hspc的ros水平是nr组的2倍(图3b)，用dhe染色发现ir组hspc的ros水平是nr组的2.7倍(图3c)。大量的实验数据证明hspc对ros高度敏感，过高水平的ros可引起hspc的dna氧化损伤，并最终导致细胞损伤。[0211]随后用流式细胞分析仪检测人hspc中γ-h2ax的平均免疫荧光强度(mfi)的改变倍数，结果如图3d所示。结果发现，受到ribe的人hspc中γ-h2ax的mfi是nr组的1.5倍(图3d)。作为dna损伤的标志，γ-h2ax通常被用作dna损伤发生的证据，上述结果表明在体内受到ribe的人hspc发生了dna氧化损伤。[0212]实施例6[0213]本实施例通过dcf-da以及dhe检测实施例2中的ir组和nr组的体外受到ribe的人造血细胞的ros水平。[0214]dcf-da检测ros的步骤如下：[0215](1)将收集到的上室cd34+细胞用1ml pbs清洗1次，1500rpm离心5min，弃尽上清液；[0216](2)根据表5进行抗体标记，4℃下避光孵育30min；[0217](3)用1ml pbs清洗1次，1500rpm离心5min，弃尽上清液；[0218](4)用500μl 10μm的dcf-da溶液重悬细胞，37℃下摇床孵育20min；[0219](5)用1ml冷的pbs终止反应，1500rpm离心5min，弃上清液；[0220](6)用1ml冷的pbs清洗1次，1500rpm离心5min，弃上清液；[0221](7)用300μl冷的pbs重悬，加入dapi溶液，使其终浓度为1μg/ml，过膜后1h内用流式细胞分析仪进行检测。[0222]表5[0223]标记荧光通道用量(μl)lin-bv5101hcd34apc1hcd38pe-cy71[0224]dhe检测ros的步骤如下：[0225](1)将收集到的上室cd34+细胞用1ml pbs清洗1次，1500rpm离心5min，弃尽上清液；[0226](2)根据表6进行抗体标记，4℃下避光孵育30min；[0227](3)用1ml pbs清洗1次，1500rpm离心5min，弃尽上清液；[0228](4)用500μl 5μm的dhe溶液重悬细胞，37℃下摇床孵育20min；[0229](5)用1ml冷的pbs终止反应，1500rpm离心5min，弃上清液；[0230](6)用1ml冷的pbs清洗1次，1500rpm离心5min，弃上清液；[0231](7)用300μl冷的pbs重悬，加入dapi溶液，使其终浓度为1μg/ml，过膜后用流式细胞分析仪进行检测。[0232]表6[0233]标记荧光通道用量(μl)lin-bv5101hcd34apc1hcd38fitc1[0234]ir组、nr组和阴性对照组(neg)的dcf-da的检测曲线如图4a所示，dcf-da法检测ir组和nr组的活性氧改变倍数统计结果如图4b所示；ir组、nr组和阴性对照组(neg)的dhe的检测曲线如图4c所示，dhe法检测ir组和nr组的活性氧改变倍数统计结果如图4d所示。[0235]由图可知，ir组cd34+细胞内的ros水平明显高于nr组，提示体外ribe同样能够导致人hspc细胞内ros升高，也就是说体外ribe导致人hspc功能受损的主要原因与体内ribe一致。[0236]对上述细胞中γ-h2ax的表达水平进行检测。[0237]利用免疫荧光抗体对收集到的transwell上室中的人cd34+细胞进行γ-h2ax染色，荧光显微镜下可以看到ir组γ-h2ax的foci的数量明显多于nr组；用wb的方法进一步检测了γ-h2ax的表达水平，同样可以看到ir组γ-h2ax的蛋白水平明显高于nr组(如图4e所示)。以上实验结果提示，在体外受到ribe的人cd34+细胞发生了dna损伤。[0238]作为dna损伤反应中的信号感受分子，当dna损伤发生时，atm、atr被激活，激活的atm/atr进一步导致chk1和chk2激酶磷酸化，从而放大dna损伤反应。利用rt-pcr技术对在体外受到8h ribe的人cd34+细胞中上述dna损伤感受分子的基因表达水平进行了检测，结果发现atm、chk1和chk2的基因表达水平升高(如图4f所示)。wb结果可以看到，ir组人cd34+细胞中atm、atr、chk1和chk2的总蛋白表达水平较nr组升高但差异不明显，但是磷酸化的chk1(s317)和chk2(thr68)蛋白水平明显高于nr组(如图4g所示)。[0239]采用免疫荧光染色的方法对各组cd34+细胞中活化状态的atm(ser1981)做了测定，荧光显微镜下可以看到ir组cd34+细胞中atm(ser1981)foci数量明显多于nr组(如图4h所示)。通过免疫荧光染色检测了激活状态的foxo3a和53bp1，可以看到作为dna氧化应激损伤应答分子的foxo3a和53bp1(ser1778)的foci数量在ir组cd34+细胞中明显增加。[0240]实施例7[0241]本实施例检测实施例2中各组体外受到ribe的人造血细胞的ros水平及凋亡情况。[0242]通过dcf-da染色法检测transwell上室中细胞内的ros水平(步骤与实施例6相同)，结果如图5a所示。结果显示ir组人cd34+细胞内的ros水平明显高于nr组，但ir+nac、ir+sf和ir+res组细胞内的ros水平则明显低于ir组，表明nac、sf和res处理后能明显降低在体外受到ribe的人cd34+细胞内的ros水平。[0243]随后对各组细胞进行免疫荧光染色(步骤与实施例6相同)，对细胞中dna损伤的标记物进行检测，结果如图5b所示。可以看到nac、sf和res处理后ribe人cd34+细胞中激活的p53(ser15)foci数量和γ-h2ax foci数量均明显少于未用抗氧化药物处理的ir组。[0244]使用annexin v和7-aad对各组的人cd34+细胞进行标记，从功能上对nac、sf和res的保护作用进行了验证，流式细胞分析仪检测结果如图5c所示。结果发现，ir+nac、ir+sf和ir+res组的人cd34+细胞中annexin v+细胞(凋亡细胞)的比例均较ir组下降，说明nac、sf和res处理能明显减少ribe人cd34+细胞的凋亡。[0245]以上结果说明，nac、sf和res体外处理能明显降低收到ribe的人cd34+细胞内的ros水平，减少人cd34+细胞dna损伤进而防止其凋亡发生，初步证明了nac、sf和res对体外受到ribe的人hspc具有保护作用。[0246]实施例8[0247]本实施例以ribe损伤的体外研究模型作为对象，验证3种小分子药物对受到ribe的人hsc植入的影响。[0248]将实施例2中的各组体外受到ribe的人cd34+细胞移植到小鼠体内，检测其细胞植入及分化情况，步骤与实施例3中的相同。[0249]骨髓中各组细胞植入的流式检测结果如图6a所示，统计结果如图6b所示，cd45+细胞的植入率倍数变化如图6c所示，骨髓中细胞分化的检测结果如图6d所示。[0250]由图可知，ir组小鼠骨髓中人cd45+细胞的植入相比于nr组下降了2.6倍，而用nac、sf和res处理后，能明显改善体外受到ribe的人hsc的植入效果，ir+nac组较ir组植入率升高了3.8倍，ir+sf组较ir组升高了3.3倍，ir+res较ir组升高了2.3倍(ir vs nr：6.4±2.1％vs 16.5±3.5％，p＝0.029；ir vs ir+nac：6.4±2.1％vs 24.3±8.5％，p＝0.048；ir vs ir+sf：6.4±2.1％vs21.33±5.6％，p＝0.034；ir vs ir+res：6.4±2.1％vs 14.6±2.8％，p＝0.036；n＝6to 8)。[0251]另外，nac、sf和res均能不同程度的提高小鼠骨髓中人hsc(cd34+cd38-)细胞亚群的比例(ir vs nr：0.9±0.2％vs 1.7±0.3％，p＝0.017；ir vs ir+nac：0.9±0.2％vs 1.5±0.2％，p＝0.037；ir vs ir+sf：0.9±0.2％vs 1.5±0.3％，p＝0.048；ir vs ir+res：0.9±0.2％vs 1.6±0.3％，p＝0.037；n＝6to 8)，但是，只有sf和res能够提高小鼠骨髓中人hpc(cd34+cd38+)细胞亚群的比例(ir vs nr：2.3±0.5％vs 4.2±1.1％，p＝0.13；ir vs ir+nac：2.3±0.5％vs 4.4±1.6％，p＝0.21；ir vs ir+sf：2.3±0.5％vs 6.2±1.4％，p＝0.025；ir vs ir+res：2.3±0.5％vs 5.2±1.0％，p＝0.015；n＝6to 8)。[0252]植入到小鼠体内的人造血细胞主要分化为cd33+的髓系细胞和cd19+的b细胞。ir+res组cd235a+红系细胞的比例也较ir组高，但是其他组与ir组红系细胞的比例没有明显差异。以上对小鼠骨髓中人的各系细胞检测结果说明，res体外处理有利于人hsc向髓系和红系分化。[0253]实施例9[0254]本实施例以ribe损伤的体内研究模型作为对象，验证3种小分子药物对受到ribe的人hsc植入的影响。[0255]将实施例1中的各组体外受到ribe的人cd34+细胞移植到小鼠体内，检测其细胞植入及分化情况，步骤与实施例3中的相同。[0256]骨髓中各组细胞植入的流式检测结果如图7a所示，统计结果如图7b所示，cd45+细胞的植入率倍数变化如图7c所示，骨髓中细胞分化的检测结果如图7d所示。[0257]由图可知，用nac、sf和res处理后，同样能明显改善体内受到ribe的人hsc的植入效果，ir+nac组较ir组植入率升高了1.8倍，ir+sf组较ir组升高了2.6倍，ir+res较ir组升高了2.2倍(ir vs nr：19.5±3.9％vs 52.6±5.9％，p＝0.0005；ir vs ir+nac：19.5±3.9％vs 34.9±4.8％，p＝0.028；ir vs ir+sf：19.5±3.9％vs 51.6±8.0％，p＝0.003；ir vs ir+res：19.5±3.9％vs 42.9±9.3％，p＝0.039；n＝4to 7)。[0258]与体外抗氧化处理一样，nac、sf和res均能不同程度地提高小鼠骨髓中人hsc(cd34+cd38-)细胞亚群的比例(ir vs nr：0.86±0.13％vs 1.41±0.15％，p＝0.017；ir vs ir+nac：0.86±0.13％vs 1.39±0.11％，p＝0.008；ir vs ir+sf：0.86±0.13％vs 1.56±0.20％，p＝0.014；ir vs ir+res：0.86±0.13％vs 1.55±0.17％，p＝0.008；n＝4to 7)，但是与体外用药不同的是(在体外sf和res均能提高小鼠骨髓中人hpc的比例)，只有res能够提高小鼠骨髓中人hpc(cd34+cd38+)细胞亚群的植入率(ir vs nr：2.61±0.58％vs 5.89±0.66％，p＝0.003；ir vs ir+nac：2.61±0.58％vs 3.82±0.38％，p＝0.10；ir vs ir+sf：2.61±0.58％vs3.79±0.93％，p＝0.28；ir vs ir+res：2.61±0.58％vs 4.75±0.73％，p＝0.04；n＝4to7)。[0259]由以上研究结果可以发现，体内用nac、sf和res处理均能不同程度地提高在体内受到ribe的人hsc的植入率。对各组小鼠骨髓中人的各系细胞进行检测发现，植入到小鼠体内的人造血细胞主要分化为cd33+的髓系细胞和cd19+的b细胞。另外值得注意的是，体内受到ribe能够影响人hspc在小鼠体内向红系的分化，但是nac、sf和res在小鼠体内用药时都不能改善体内ribe造成的人hspc向红系分化的损伤。[0260]综上所述，本技术构建了旁观者效应损伤造血干祖细胞的体内、体外研究模型，证明了ros是ribe引起损伤的主要机制，在体外和体内用抗氧化药物进行干预均能不同程度的降低ribe对hspc的损伤。一方面进一步验证了过多的ros生成是ribe造成hspc损伤的主要机制，另一方面为临床上需要放疗预处理的骨髓移植患者制定有效的治疗方案提供了理论基础。[0261]本技术明确了ribe对hspc的损伤作用和功能变化，发现并制定了体内外干预ribe损伤作用和提高人造血干祖细胞的植入和长期造血重建的新方法。为临床上需要放疗预处理的骨髓移植患者提高hsc移植效果制定新策略奠定了理论基础。[0262]申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。