氯化两面针碱新纳米制剂制备方法和抗肝癌应用及验证方法

　　1.本发明涉及医药技术领域，尤其涉及氯化两面针碱新纳米制剂制备方 法和抗肝癌应用及验证方法。背景技术：2.两面针别名入地金牛、入山虎、花椒刺等，为芸香科花椒属植物两面 针的干燥根，味苦、辛,性温，有小毒。祛风活血,麻醉止痛,清热解毒,消肿, 止血。主治风湿性关节炎，类风湿关节炎,坐骨神经痛,腰肌劳损、胃痛,腹 痛,牙痛,咽喉肿痛,感冒头痛,胃溃疡,十二指肠溃疡、肠道蛔虫,跌打损伤,外 伤出血,毒蛇咬伤。内服3?9克。氯化两面针碱属于苯菲啶型生物碱,是入山 虎干燥根提取的一种生物碱。据文献报道,氯化两面针碱对lewis肺癌、 人体鼻咽癌、肝癌、慢性粒细胞白血病等均有抑制作用。3.肝癌问题是复杂的,涉及的病理环节很多,单用某一种药难以适应这种 复杂病情。特别肿瘤组织的微环境不同于正常的组织，由于肿瘤细胞快速 增殖及造成的血管密度降低和血管不规则，肿瘤细胞外基质(ecm)中充 满了相互连接的胶原网络和水凝胶状糖胺聚糖，因此肿瘤组织具有致密的 粘性ecm和较高的间质压。此外，由于肿瘤区域血管异常增殖，具有不 连续基膜的新生内皮细胞，使血管壁渗透性增强，小于200nm的纳米粒子 能穿透血管进入组织间隙，而功能性淋巴管的相对缺乏导致纳米粒子在肿 瘤区域更多的保留，此为肿瘤的促进通透性和保留(epr)效应。由于肿 瘤细胞生长过快，肿瘤血管生成速度相对滞后，且肿瘤血管生成不均匀， 导致肿瘤区域供氧不足，存在不同程度的低氧和坏死区域。由于新陈代谢 异常及组织缺氧，瓦博格效应促使肿瘤细胞进行大量糖代谢活动，将葡萄 糖转化成乳酸，淋巴功能紊乱导致大量乳酸积累在肿瘤区域，使周围环境 呈微酸性(ph值为6.0–7.0)。因此现在还有没有较好治疗肝癌的药物。技术实现要素：4.本发明的目的在于提供氯化两面针碱新纳米制剂制备方法和抗肝癌应 用及验证方法，解决背景技术中提到的技术问题。5.氯化两面针碱新纳米制剂制备方法，所述方法包括如下步骤：6.步骤1：将叶酸改性聚乙二醇1000维生素e琥珀酸酯进行合成，然 后表征；7.步骤2：使用叶酸改性聚乙二醇1000维生素e琥珀酸酯修饰氯化两 面针碱纳米胶束得到氯化两面针碱新纳米制剂；8.步骤3：对氯化两面针碱新纳米制剂进行物理性质和化学性质；9.步骤4：氯化两面针碱新纳米靶向制剂对肝癌细胞靶向抗肿瘤能力的 评价，制备完成。10.进一步地，所述步骤1的具体过程为：3.8g对甲苯磺酰氯(ptsc中加 入20gtpgs在100ml的ch2cl2溶液中，在室温下磁力搅拌滴加28ml 三乙胺，反应12h后，用1mol/ml盐酸室温萃取，将无水硫酸镁加入有机 相中，搅拌、过滤，并在室温下浓缩，室温下将冷无水乙醚滴加到冷凝滤 液中，将白色沉淀在40℃下干燥，tpgs?ptsc配合物是在40ml n,n?二 甲基甲酰胺(dmf)的n2下溶解得到的，然后将乙二胺加入到tpgs?ptsc 溶液中，在40℃下剧烈搅拌24小时得到tpgs?nh2配合物；11.fa44.14 mg和edc 17.14mg的等摩尔当量溶解在去离子水中，磁力 搅拌0.5h，然后滴加等量的nhs 10.36mg的摩尔当量，3h后，将活化的 fa溶液滴nh2?tpgs 100mg，10ml磷酸盐缓冲液，ph 7.4溶液中，室温 搅拌3天，然后用mwco为1000的透析膜用去离子水透析混合物3天， 去除多余的反应物，最后，将样品冻干，得到桔黄色的tpgs?fa粉，即为 叶酸?聚乙二醇1000维生素e琥珀酸酯。12.进一步地，步骤2的具体过程为：13.将tpgs?fa5 mg、nadc 10.8mg/ml和nc2 mg溶解在ph7.4、0.02m、 10ml的磷酸盐缓冲液中，并在室温搅拌24h，然后将反应复合物溶液离 心，去除游离nc，上清液中冷冻干燥得到tpgs?fa/nc，即为氯化两面针 碱新纳米制剂。14.进一步地，所述步骤3中的具体过程为：15.先核磁共振光谱和红外光谱法检测，1h nmr谱用核磁共振光谱仪检 测，样品溶解在dmso中，然后上机检测，傅里叶变换红外光谱检测方法， 样品以干法溴化钾粉末的形式进行测定；16.粒径、形态和zeta电位测定，a?tpgs?nc粒径和zeta电位取制备的 fa?tpgs?nc用激光粒度测定仪测定其粒径分布和zeta电位，在25℃下测 定了纳米粒子在1μm去离子水中的粒径和zeta电位，并使用origin软件 绘制了结果图，测量三个独立的样品的尺寸和zeta电位比较tpgs,tpgs??fa/nc,nc，取fa?tpgs氯化两面针碱纳米胶束滴加于铜网上，用滤纸从 铜网边缘吸去多余液体，滴加3％的磷钨酸溶液进行负染，吸负染液，自然 风干，置于透射电镜下观察纳米胶束的形态并拍照；17.ph敏感环境氯化两面针碱释放测定，fa?tpgs?nc中氯化两面针碱的 ph敏感释放实验分别在ph 5.0和ph 7.4条件下进行，称取5mgfa?tpgs?nc粉末分别溶于5mlpbs溶液，ph为5.0或7.4，置于透析 袋中，透析袋置于含有25ml相应ph的pbs的50ml离心管中，在37℃ 恒温水浴振荡，在预设时间点取样1ml，预设时间点为0分钟,24分钟,48 分钟,72分钟,144分钟,192分钟，同时补充相同温度、相同介质1ml，采 用上述方法用hplc在280nm处测定氯化两面针碱的含量，实验平行设3 组，实验结果求平均值。18.进一步地，步骤4的具体过程为：19.检测氯化两面针碱新纳米靶向制剂对肝癌细胞huh7和li?7的靶向作 用，将罗丹明b异硫氰酸酯和设定量的tpgs?fa/nc溶解在pbs中，超声 30分钟后，室温保持30分钟，离心去除未标记的罗丹明b异硫氰酸酯， pbs洗涤，处理4h后，吸掉罗丹明b异硫氰酸酯标记纳米胶束的培养基， pbs缓冲液冲洗2次后，4％甲醛固定，即15min后，再用pbs缓冲液冲 洗2次，pbs缓冲液冲洗后处理，细胞用dapi染色细胞核，通过激光共 聚焦显微镜上检测。20.氯化两面针碱新纳米制剂的抗肝癌应用，氯化两面针碱新纳米制剂应用 在抗肝癌中。21.氯化两面针碱新纳米制剂的抗肝癌应用的验证方法，所述方法包括如下 步骤：22.步骤1：细胞复苏和冻存：细胞快速复苏，查看细胞冻存登记表，将装 有本研究所需细胞系的冻存管从液氮或－80℃中取出，迅速置于3℃－ 恒温水浴锅中，不断搅动注意时刻观察直至溶解，此过程为1?2min，接着 在生物安全柜中将冻存管中的细胞转移至15ml离心管中，加入设定量含 10％血清的dmem培养基，然后离心，于超净台中弃上清，加入适量培 养基，用1ml枪头重悬细胞，再转移至25cm2细胞培养瓶中，然后置于细 胞培养箱中过夜，细胞培养箱温度为37℃，含有5％co2，次日换液，细胞 缓慢冻存，于显微镜下观察细胞状态、数目，选择对数期、状态好的细胞 进行冻存，于超净台中用0.25％胰酶消化细胞，加入含血清培养基中和， 并转移至15ml离心管中，离心后弃上清，加入1ml配置好的细胞冻存液， 细胞冻存液由100μldmso和900μ0胎牛血清组成，并转移至2ml无菌 细胞冻存管中，做好标记，将冻存管放入具有梯度降温功能的细胞冻存盒 中，置于－80℃冰箱过夜，于次日将上述冻存管置于液氮中长期保存，并 在细胞冻存登记表中详细记录；23.步骤2：细胞培养与传代；2株肝细胞癌细胞系均使用含10％血清的 dmem－培养基培养，肝细胞癌细胞系为huh7和li?7，细胞培养箱条件 为37℃、5％co2、饱和湿度，于显微镜下每天观察细胞状态数目，当细 胞融合度到达80－90％后，用0.25％胰酶消化1－2min，取特定量细胞进 行传代；24.步骤3：将对数期、生长状态良好的细胞用胰酶消化，培养基重悬后， 取50μl细胞重悬液用于细胞计数仪计数，计数后根据细胞生长特点，取2000－3000个细胞接种于96孔板，分为pbs组、tpgs?fa/nc组、5?fu 组，24小时后分别在96孔板中加入上述每组所对应的药物浓度，设置3 个平行复孔，在细胞培养箱中分别培养孵育24h后取出96孔板，弃去孔内 的培养基，每孔加入90μl无血清培养基和10μlmtt试剂，置于37℃细 胞培养箱孵育3h，然后用酶标仪在490nm波长下检测细胞吸光度，即为 od值；25.步骤4：检测氯化两面针碱新纳米靶向制剂抑制huh7和li?7细胞增 殖的影响，通过实验分组：对照组，5?fu，tpgs?fa，nc，分别作用24h、 48h和72h后，发现tpgs?fa/nc组作用效果明显，特别在60μg/ml后 tpgs?fa/nc对huh7和li?7肝癌细胞抑制作用逐渐增强，随着作用时间 延长，特别是72h后tpgs?fa/nc对两株肝癌细胞抑制作用效果明显。26.本发明采用了上述技术方案，本发明具有以下技术效果：27.本发明通过对fa基团和tpgs?fa亚甲基的质子信号进行积分,可知每 个纳米胶束接枝fa基团的平均数目为1.3，同时紫外?可见分光谱图也证明 fa成功偶联到tpgs树枝状大分子，这可以从tpga?fa/nc纳米胶束在 280nm处有强吸收峰得到证明，药物颗粒主要分布在细胞内，并与蓝色细 胞核结合，起到破坏肿瘤细胞dna功能，阻碍肿瘤细胞增殖，结果证明氯 化两面针碱纳米新制剂对肝癌细胞具有靶向作用；氯化两面针碱新纳米靶 向制剂(tpgs?fa/nc)经检测带负电荷，由此可知tpgs?fa/nc带负电 荷不易与正常细胞结合，从而降低毒性。tpgs?fa/nc粒径为14.4±2.7nm， 但自身带负电荷，所以氯化两面针碱纳米微粒与带负电荷的肿瘤细胞膜之 间的相互作用减少，这样氯化两面针碱纳米微粒可能会被限制穿过肿瘤细 胞膜的能力，而叶酸就作为靶向载体，可协助tpgs?fa/nc纳米微粒通过 肿瘤细胞膜，通过叶酸受体介导的内吞途径特异性进入huh7和li?7细胞 内，具有靶向作用。附图说明28.图1为本发明叶酸?聚乙二醇1000维生素e琥珀酸酯合成图。29.图2为本发明tpga?fa/nc的合成过程图。30.图3为本发明聚乙二醇1000维生素e琥珀酸酯(tpgs)1hnmr谱图。31.图4为本发明聚乙二醇1000维生素e琥珀酸酯接枝叶酸(tpgs?fa) 1h nmr谱图。32.图5为本发明氯化两面针碱溶解于乙醇、tpgs和氯化两面针碱新纳米 制剂(tpgs?fa/nc)溶解于pbs中的紫外?可见分光光谱图。33.图6为本发明氯化两面针碱标准曲线。34.图7为本发明tpgs?fa合成流程图。35.图8为本发明tpgs?fa/nc合成流程图。36.图9为本发明nitidine chloride(nc)结构图。37.图10为本发明聚乙二醇1000维生素e琥珀酸酯结构图。38.图11为本发明叶酸结构图。39.图12为本发明fa、tpgs和tpgs?fa红外光谱图。40.图13为本发明氯化两面针碱新纳米制剂粒径分布图。41.图14为本发明tpgs组、氯化两面针碱新纳米制剂组和氯化两面针碱 组粒径对比图。42.图15为本发明氯化两面针碱新纳米制剂电位值分布。43.图16为本发明tpgs组、氯化两面针碱新纳米制剂组和氯化两面针碱 组电位值对比图。44.图17为本发明氯化两面针碱新纳米靶向制剂透射电镜图(tem)。45.图18为本发明在37℃下，在pbs(ph 7.4)和磷酸盐缓冲液(ph 5.0)中， tpgs?fa/nc中nc累积体外释放动力学曲线。46.图19为本发明tpgs?fa/nc对huh7细胞靶向作用图。47.图20为本发明tpgs?fa/nc对li?7细胞靶向作用图。48.图21为本发明tpgs?fa/nc分别24h、48h和72h抑制huh?7细胞增 殖图。49.图22为本发明具有代表性的器官图像显示肿瘤特异性靶向罗丹明b异 硫氰酸酯标记的tpgs?fa/nc纳米颗粒注射后8小时注入huh7肝癌细胞 接种裸鼠图。50.图23为本发明tpgs?fa/nc纳米颗粒在肿瘤和正常器官的生物分布的 定量分析图。51.图24为本发明裸鼠接种肝癌治疗后代表性图。52.图25为本发明腹腔注射治疗裸鼠原位huh7异种移植与氯化两面针碱 纳米颗粒和对照组图。53.图26为本发明氯化两面针碱新纳米制剂抑制裸鼠肿瘤组织aqp3、 nek2、epcam、cd133免疫组化蛋白表达图。54.图27为本发明免疫组化检测tpgs?fa/nc对aqp3、ecapm、cd133、 nek2蛋白在li?7肝癌细胞中的表达水平影响图。55.图28为本发明tpgs?fa/nc作用后对裸鼠肿瘤组织aqp3、epcam、 cd133、nek2蛋白表达影响图。56.图29为本发明通过he染色检测不同处理组对裸鼠器官的影响对比 图。57.图30处理组作用24h后对huh7细胞诱导凋亡作用效果图。58.图31观察hoechst33258染色后各处理组作用24h后对huh7细胞诱导 凋亡作用图。59.图32氯化两面针碱新纳米靶向制剂通过aqp3蛋白调节cd133和 py705?stat3蛋白表达图。60.图33为氯化两面针碱(nc)基团分子结构图。61.图34为tpgs?fa/nc?hif?1复合物三维结构图(a)与相互作用二维 结构图(b)。62.图35为tpgs?fa/nc?vegfd复合物三维结构图(a)与相互作用二 维结构图(b)。63.图36为tpgs?fa/nc?jak1复合物三维结构图(a)与相互作用二维 结构图(b)。64.图37为tpgs?fa/nc?jak2复合物三维结构图(a)与相互作用二维 结构图(b)。65.图38为tpgs?fa/nc?stat3复合物三维结构图(a)与相互作用二 维结构图(b)。66.图39为tpgs?fa/nc?nek2复合物三维结构图(a)与相互作用二维 结构图(b)。67.图40为氯化两面针碱与蛋白对接产物的能量变化图。具体实施方式68.为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，举出优选实施例， 对本发明进一步详细说明。然而，需要说明的是，说明书中列出的许多细 节仅仅是为了使读者对本发明的一个或多个方面有一个透彻的理解，即便 没有这些特定的细节也可以实现本发明的这些方面。69.们为此选用与人体亲和力强的聚乙二醇1000维生素e琥珀酸酯(tpgs) 作为载体，聚乙二醇1000维生素e琥珀酸酯(tpgs)是维生素e的水溶性 衍生物,由维生素e琥珀酸酯(ves)的羧基与聚乙二醇(peg)1000酯化而成, 相对分子质量约为1513。tpgs为淡黄色的蜡状固体,近乎无味,能溶于水, 也能溶于乙醇等大多数极性有机溶剂。室温下在水中溶解度的质量分数为 20％,若超过此浓度,将形成高黏度的液晶相。随着在水中浓度的增加,液 晶相的结构逐渐变化，从各向同性的球状胶束到圆筒状胶束、正反六角形 胶束、反球状胶束,最后成薄层片状液晶态。由于tpgs的两亲性质及良 好的水溶性,对亲脂性物质而言是很好的非离子性表面活性剂。当其与难 溶性药物形成胶束或乳剂时,将显著增加药物在胃肠中的吸收,从而提高 生物利用度。与其他表面活性剂相比,tpgs具有生育酚酯的结构,从而有 一定的抗氧化性,这有助于增加制剂的稳定性。近年来的研究发现，tpgs 具有p?gp抑制作用，可有效地克服肿瘤多药耐药并提高抗肿瘤药物的疗效， 已广泛应用于抗肿瘤药物的递送系统中。在过去20年，肿瘤组织表面叶酸 受体的过度表达成为临床诊断和治疗癌的新靶点。综合分析，其研究主要 集中在以下几个方面：(1)利用叶酸受体的抗体，单抗片断或嵌合小分子 进行肿瘤的诊断及治疗；(2)利用效应分子，如发射射线的放射性核素， 反义寡核苷酸(ason)及抗肿瘤药物等与叶酸类似物进行偶联，并通过受 体介导进入细胞内进行受体显像和靶向治疗；(3)叶酸受体介导的药物靶 向载药系统。以上3种方法相比较而言，前两种技术中存在：单抗技术具 有免疫原性，价格昂贵和分子量大，循环周期长影响诊断准确性，肿瘤组 织与非靶向性组织的放射性核素之比(t∶nt)未达到标准的情况。在受 体介导的药物靶向载药系统中，与其它受体介导的基因载体相比，有其独 特优势：(1)不需合成和纯化配体蛋白，无配体所致的潜在免疫原性；(2) 结构简单，容易合成；(3)体积较小，可重复给药；(4)仅在肿瘤细胞 高表达，具有很好的肿瘤组织靶向性。而叶酸(fa)能特异性地和人体中各 种肿瘤细胞表面超量表达的叶酸受体结合,被细胞内吞。mansouri和lee 等人已证实叶酸接枝的壳聚糖比没有接枝的壳聚糖的转染效率有着明显的 提高。目前，聚乙二醇1000通过修饰可降解生物降解维生素e琥珀酸酯， 该纳米粒子由于能够逃避网状内皮系统的捕捉并加强渗透和滞留作用，因 此被广泛的作为药物控释系统的载体。聚乙二醇1000维生素e琥珀酸酯 (tpgs)对癌细胞也有一定毒性，可以与抗癌药物起协同作用。70.一、实验仪器71.德国激光共聚焦显微镜clsm(leica sp8,germany)72.1h nmr谱用核磁共振光谱仪(brukerav400，germany)73.magna?1r550傅里叶变换红外光谱(thermo scientific，usa)74.agilenl cary60紫外分光度仪(agilenttechnologies,usa)75.美国bdc6plus flow cytometer(bd biosciences,usa).76.生物发光/荧光/x光三合一小动物成像系统(perkinelmer ivis lumina lt, germany)77.化学显影仪(上海勤翔公司)78.二、实验材料：(一)细胞株79.2株肝细胞癌细胞系(huh7、li?7)中国上海科学院细胞库购买而来。80.(二)实验动物81.所有实验用动物均采用balb/c?nu裸鼠，周龄为4－5周。实验动物饲养 在广西中医药大学中心实验室动物房(spf级),购于湖南斯莱克景达实验 动物有限公司,许可证号：scxk(湘)2019?0004。动物实验操作符合国际公 认的动物实验指南，且符合伦理规范。82.(三)实验材料83.中国阿拉丁生物公司??聚乙二醇1000维生素e琥珀酸酯，5g，中国阿拉 丁生物公司—氯化两面针碱(nc),20mg,>98％，中国阿拉丁生物公司??n?hydroxysuccinimide(nhs),5g,98％，中国阿拉丁生物公司??1?ethyl?3?(3?(dimethylamino)propyl)carbodiimide hydrochloride(edc), 5g,98％，中国阿拉丁生物公司?叶酸，500g，中国阿拉丁生物公司?脱氧胆 酸钠(nadc),25g,98％，上海麦克林生化科技有限公司?罗丹明b异硫氰 酸酯,100mg，上海源叶公司?透析袋(mwco＝1000)，美国赛默飞公司???fitc annexin v apoptosis detection kit凋亡检测试剂盒,100t。84.实施例85.氯化两面针碱新纳米制剂制备方法，包括如下步骤86.1、氯化两面针碱自组装纳米胶束传递载体的构建87.1.1、fa?tpgs(叶酸改性聚乙二醇1000维生素e琥珀酸酯)合成与表征。88.3.8g对甲苯磺酰氯(ptsc中加入20gtpgs在100ml的ch2cl2溶液中， 在室温下磁力搅拌滴加28ml三乙胺。反应12h后，用1mol/ml盐酸室温 萃取。将无水硫酸镁加入有机相中，搅拌、过滤，并在室温下浓缩。室温 下将冷无水乙醚滴加到冷凝滤液中，将白色沉淀在40℃下干燥。89.tpgs?ptsc配合物是在40mln,n?二甲基甲酰胺(dmf)的n2下溶解得到 的，然后将乙二胺加入到tpgs?ptsc溶液中，在40℃下剧烈搅拌24小时 得到tpgs?nh2配合物。90.fa44.14 mg和edc 17.14mg的等摩尔当量溶解在去离子水中，磁力搅 拌0.5h，然后滴加等量的nhs 10.36mg的摩尔当量。3h后，将活化的fa 溶液滴nh2?tpgs 100mg，10ml磷酸盐缓冲液，ph 7.4溶液中，室温搅 拌3天。然后用mwco为1000的透析膜用去离子水(9倍，tpgs?fa亚甲基的质子信号进行积分,可知每个纳米胶束接枝fa基团的平 均数目为1.3。同时紫外?可见分光谱图也证明fa成功偶联到tpgs树枝状 大分子(图4)，这可以从tpga?fa/nc纳米胶束在280nm处有强吸收峰得 到证明。105.图4，tpgs?fa1hnmr谱图数据：106.1h nmr(400mhz,dmso)δ8.65(s,1h),8.12(d,j＝7.6hz,1h),7.77–?7.55(m,2h),6.95(dd,j＝13.7,7.6hz,2h),6.74–6.09(m,3h),4.58(d,j＝ 8.3hz,1h),4.51(t,j＝15.6hz,2h),4.38–3.96(m,3h),3.68(s,1h),3.62 (dd,j＝18.7,13.9hz,3h),3.51(s,72h),3.45–2.99(m,40h),2.99–2.74(m, 3h),2.67(dd,j＝22.2,16.7hz,3h),2.57–2.45(m,15h),2.43–2.08(m,3h), 2.00(s,4h),1.91(d,j＝8.5hz,7h),1.83–1.44(m,6h),1.37(s,2h),1.21(d, j＝18.0hz,17h),0.83(t,j＝8.0hz,12h).107.图3，tpgs 1hnmr谱图数据：108.tpgs:1h nmr(400mhz,dmso)δ4.37(t,j＝5.1hz,4h),4.19–3.97(m, 1h),3.77–3.56(m,2h),3.54–3.45(m,46h),3.45–2.49(m,23h),2.97–?2.78(m,1h),3.02–2.49(m,5h),2.77–2.62(m,1h),2.62–2.46(m,3h), 2.09(s,2h),2.05–1.85(m,5h),1.74(s,1h),1.48(ddd,j＝23.0,14.8,8.2hz, 2h),1.36(s,1h),1.13(dt,j＝57.4,7.0hz,21h),0.83(t,j＝8.0hz,7h)。109.(二)氯化两面针碱新纳米制剂包封率测定110.从以上紫外可见光谱(图5)证实了氯化两面针碱新纳米制剂与氯化两面针 碱相比，溶解性增加，在270nm处紫外吸收增强。通过氯化两面针碱标准 曲线(图6)y＝0.949x?0.0079,r2＝0.9995进行定量，结果显示每个氯化两 面针碱纳米胶束包合了5.2个氯化两面针碱分子。111.(三)如图12，(a)为fa，(b)为tpgs，(c)为tpgs?fa，通过红 外光谱法证明了制备成功的tpgs?fa，1028cm?1、1590cm?1和3400cm?1 处的峰分别为c＝o和n?h的特征振动峰，为酰胺键的形成提供了证据，表 明fa和tpgs成功结合。112.(四)dls测量tpgs?fa/nc显示平均粒径为14.4±2.7nm(n＝3, mean±sd)，纳米粒径分布图表明,氯化两面针碱新纳米靶向制剂自组装系统 分布均一，并表明tpgs?fa纳米胶束可以从从水溶液中包合更多的氯化两 面针碱分子。图13?14，tpgs?fa/nc纳米胶束的zeta电位为?15.3±5.6mv (zeta电位分布的mean±sd)，图15?16和表1。113.表1 tpgs,tpgs?fa/nc和氯化两面针新纳米制剂粒径和电位图[0114][0115](五)体外释放作用：选择pbs(ph 7.4)模拟人体生理条件和磷酸盐缓 冲液(ph 5.0)模拟肿瘤细胞生长环境条件下作为缓冲液，在37℃下体外评价 氯化两面针碱纳米靶向制剂(tpgs?fa/nc)中氯化两面针碱(nc)的释 放动力学。如图18所示，经过几天的时间，nc逐渐释放，这表明树枝状大 分子内部的相对疏水性阻止了药物快速释放。其中，tpgs?fa/nc纳米胶束 在192h释放nc的速度相对较慢，ph 7.4时为39.2±1.3％，ph 5.0时为 43.0±2.7％。这表明，tpgs?fa纳米胶束中的羟基与被包封的氯化两面针碱 产生氢键作用，并促进氯化两面针碱释放，氯化两面针碱从tpgs?fa纳米 胶束中释放的速度更快，在酸性条件下(ph 5.0)，tpgs?fa/nc复合物释放nc的速度比生理条件下(ph 7.4)快。在酸性条件下(ph＝5.0)，质子化的 tpgs?fa与带正电荷的nc分子之间存在斥力，增加了nc从树枝状大分子 内部释放的速率。tpgs?fa/nc纳米胶束对其释放动力学的影响与ph响应 性的nc释放行为相似。而在两种ph条件下，游离nc释放速度都较快，在 ph 5.0和ph 7.4时，游离nc释放量分别约为81.7％和73.5％。[0116](六)氯化两面针碱纳米新制剂靶向作用于huh7肝癌细胞和li?7肝癌细 胞[0117]dapi染色液(dapi staining solution)是经过精心优化几乎适用于所有 常见细胞和组织细胞核染色的染色液。dapi是一种可以穿透细胞膜的蓝色 荧光染料。和双链dna结合后可以产生比dapi自身强20多倍的荧光。 和dapi染色常用于细胞凋亡检测，染色后用荧光显微镜观察或流式细胞 仪检测。dapi也常用于普通的细胞核染色以及某些特定情况下的双链 dna染色。ifluortm647鬼笔环肽(phalloidin)是一种来源于毒蕈类鬼笔 鹅膏(amanitaphalloides)的环状七肽毒素，以高亲和力(kd＝20nm)选 择性结合于丝状肌动蛋白f?actin，而不会与单体肌动蛋白g?actin结合，通 常用来标记组织切片、细胞培养物或无细胞体系中的f?actin，从而对f?actin 进行定性和定量分析，也就是绿光标记的细胞骨架。用荧光染料异硫氰酸 罗丹明b分别标记氯化两面针碱和氯化两面针碱纳米新制剂，赋予红色荧 光。[0118]从图19和20可见：通过三种颜色重合，可以观察到标记红色荧光药 物主要分布在细胞的位置，研究药物作用于huh7肝癌细胞和li?7肝癌细 胞。实验分为a组：对照组、b组：氯化两面针碱组、c组：氯化两面针 碱纳米新制剂组，从以下图可见：a组清晰呈现细胞形态，蓝色代表细胞 核，绿色代表细胞骨架；b组在图片重合栏可见红色药物很少与蓝色细胞 核结合，蓝色光还是很明显了，c组在图片重合栏可见红色药物通过绿色 细胞骨架进入细胞内，通过图19放大图可见红色药物颗粒主要分布在细胞 内，并与蓝色细胞核结合，起到破坏肿瘤细胞dna功能，阻碍肿瘤细胞增 殖，结果证明氯化两面针碱纳米新制剂对肝癌细胞具有靶向作用。[0119]tpgs是天然维生素e水溶性衍生物和聚乙二醇(peg)1000已被美国食 品和药品监督管理局(fda)批准为药物增溶剂用于外用，口服和注射。也有 报道称，tpgs是p?gp各种底物的耐药糖蛋白有效抑制剂。更为重要，表明 tpgs对癌细胞具有选择性的细胞毒活性，促进细胞凋亡。最近,它已被证明 是几种抗癌药物有效传递系统，包括阿霉素和姜黄素，改善治疗效果。[0120]本实验通过把叶酸基团成功修饰tpgs,检测带负电荷的tpgs?fa载 体，可以装载吸引带更多正电荷的氯化两面针碱分子。经研究证明氯化两 面针碱检测带正电荷,而正常人细胞大部分带负电荷，可见氯化两面针碱 易于正常细胞结合容易产生毒性；氯化两面针碱新纳米靶向制剂 (tpgs?fa/nc)经检测带负电荷，由此可知tpgs?fa/nc带负电荷不易与 正常细胞结合，从而降低毒性。tpgs?fa/nc粒径为14.4±2.7nm，但自身带 负电荷，所以氯化两面针碱纳米微粒与带负电荷的肿瘤细胞膜之间的相互 作用减少，这样氯化两面针碱纳米微粒可能会被限制穿过肿瘤细胞膜的能 力，而叶酸就作为靶向载体，可协助tpgs?fa/nc纳米微粒通过肿瘤细胞膜， 通过叶酸受体介导的内吞途径特异性进入huh7和li?7细胞内，具有靶向作 用。[0121]肿瘤代谢环境与正常细胞不同，由于过度增殖，如普遍存在缺氧、弱 酸性和某些酶的过表达等特点。肿瘤细胞的能量主要来源于糖酵解。肿瘤 细胞即使在含氧量正常的情况下也能产生过多的乳酸，因此肿瘤细胞中高 糖酵解率的特性是其低ph的主要来源。而且，肿瘤细胞膜内外运转的增多 和对乳酸的清除障碍，导致肿瘤组织的间质细胞呈弱酸性，而血液中的正 常组织和细胞外ph保持恒定在ph7.2?7.4。除此之外，肿瘤细胞器之间的 ph存在差异，内涵体和溶酶体呈酸性环境，且溶酶体(ph4.0?4.5)酸性比 内涵体(ph5.0?6.0)酸性更强。ph敏感性聚合物胶束通过高通透性和滞留效 应epr到达肿瘤细胞，然后主要通过内吞途径被细胞摄取，经内涵体进入 溶酶体。在此过程中，ph值从正常生理条件下降到约ph 5.0，而这种ph 的变化可以诱发胶束的快速释药。实验结果表明tpgs?fa/nc分别在pbs (ph7.4)和磷酸盐缓冲液(ph5.0)中，具有不同的动力学释放效率，其中药物 在ph 5.0释放率比ph7.4高，表明药物在肿瘤部位药物能快速释放，能够 降低药物不良反应，更好地发挥体内抗肿瘤效果。[0122]氯化两面针碱新纳米制剂的抗肝癌应用的验证方法，所述方法包括如 下步骤：[0123](一)细胞复苏、冻存和细胞培养、传代[0124]1.细胞复苏和冻存细胞快速复苏：查看细胞冻存登记表，将装有本 研究所需细胞系的冻存管从液氮或－80℃中取出，迅速置于3℃－恒温水 浴锅中，不断搅动注意时刻观察直至溶解，此过程大约1?2min；接着在生 物安全柜中将冻存管中的细胞转移至15ml离心管中，加入适量含10％血清 的dmem培养基，然后离心(25℃、800－1000rpm 5min),于超净台中弃上 清，加入适量培养基，用1ml枪头重悬细胞，再转移至25cm2细胞培养瓶中， 然后置于细胞培养箱(37℃、5％co2)中过夜，次日换液。细胞缓慢冻存： 于显微镜下观察细胞状态、数目，选择对数期、状态好的细胞进行冻存， 于超净台中用0.25％胰酶消化细胞，加入含血清培养基中和，并转移至 15ml离心管中，离心(25℃、1500rpm下5min)后弃上清，加入1ml配置 好的细胞冻存液(100μldmso和900μ0胎牛血清)，并转移至2ml无菌 细胞冻存管中，做好标记(细胞名称、冻存日期、使用者姓名等)。将 冻存管放入具有梯度降温功能的细胞冻存盒中，置于－80℃冰箱过夜。于 次日将上述冻存管置于液氮中长期保存，并在细胞冻存登记表中详细记录。[0125]2.细胞培养与传代2株肝细胞癌细胞系(huh7、li?7)均使用含10％血清的dmem－培养基培养，细胞培养箱条件(37℃、5％co2、饱 和湿度)。于显微镜下每天观察细胞状态数目，当细胞融合度到达80－90％ 后，用0.25％胰酶(含edta)消化1－2min，取适量细胞进行传代。[0126]2.2将对数期、生长状态良好的细胞用胰酶消化，培养基重悬后，取 50μl细胞重悬液用于细胞计数仪计数，计数后根据细胞生长特点，取适量 细胞(2000－3000个)接种于96孔板，分为pbs组、tpgs?fa/nc组、5?fu 组，24小时后分别在96孔板中加入上述每组所对应的药物浓度，设置3个平 行复孔。在细胞培养箱中分别培养孵育24h后取出96孔板，弃去孔内的培养 基，每孔加入90μl无血清培养基和10μlmtt试剂，置于37℃细胞培养箱 孵育3h。然后用酶标仪在490nm波长下检测细胞吸光度(od值)。[0127](一)mtt检测氯化两面针碱新纳米靶向制剂抑制huh7和li?7细胞增 殖的影响[0128]通过实验分组：对照组，5?fu，tpgs?fa，nc，分别作用24h、48h和 72h后，发现氯化两面针碱新纳米制剂组(tpgs?fa/nc)作用效果明显， 特别在60μg/ml后tpgs?fa/nc对huh7和li?7肝癌细胞抑制作用逐渐增强， 随着作用时间延长，特别是72h后tpgs?fa/nc对两株肝癌细胞抑制作用效 果明显，这也符合tpgs?fa/nc缓释作用特点，如图21所示。[0129]对肝癌细胞皮下移植瘤模型的治疗作用[0130]1.模型建立[0131]将对数期、状态良好的epcam+cd133+人肝癌huh7细胞消化、离心， 再加适量无血清培养基将细胞终浓度调整至1x107个/ml，混匀后从huh7 细胞悬液中用1ml注射器吸取0.2ml含5x106个细胞的混合液，并接种 至裸鼠右腋窝皮下。[0132]选择生长状态好的裸鼠，待肿瘤组织长到2.5cm以上，肌注水合氯醛 麻醉后,切取肿瘤组织，4℃pbs缓冲液(含青霉素100μ/ml、链霉素100 μg/ml)反复漂洗4～6遍,然后剪碎成1mm3大小的组织块。先用0.1％的ⅰ?型胶原酶消化作用10min,倒去上清夜,再加0.2％的胰蛋白酶和0.1％的ⅰ型 胶原酶消化20min,使游离成单个细胞,600r/min离心5min,收集消化的种鼠 肿瘤细胞。分别用无血清培养基制成单细胞悬液，细胞密度调整为2×107 个/ml待接种,每只5×106个配制7.6ml,细胞总数：1.5×108个。取检疫合 格裸鼠30只，用于上述肝癌细胞接种，雄性，体重18～20g，消毒裸鼠注 射部位皮肤，用1ml注射器抽取细胞悬液0.2ml接种于裸鼠右侧腋窝。[0133]2.肝癌细胞皮下移植瘤模型动物分组及给药方案[0134]当小鼠肿瘤体积大于100mm3时按肿瘤体积、体重分层随机数法进 行分组，每组5只，分为4组，即模型对照组、nc组、tpgs?fa/nc 组、5?fu组，腹腔注射给药，每天给药1次，共14天。具体给药方案 见表2。[0135]表2肝癌细胞皮下移植瘤模型的治疗作用给药方案[0136][0137]组表示对照组(不注射药物)，b组表示肿瘤造模组，用红色异硫氰酸 罗丹明b标记药物呈现荧光，通过活体成像仪检测药物靶向作用于肿瘤组 织，结果显示肿瘤组织呈现很强的橙色药物荧光强度，因为尾静脉注射药 物，故血液循环丰富的组织器官：肝脏、心脏、肾脏、肺，脑都会有少量 药物分布，有有很弱的荧光值。但肿瘤组织荧光强度值比其他脏器大，具 有显著性差异,证明氯化两面针碱新纳米制剂靶向作用于肿瘤组织，如图22 和23所示。[0138]如图22,具有代表性的器官图像显示肿瘤特异性靶向罗丹明b异硫氰酸酯 标记的tpgs?fa/nc纳米颗粒注射后8小时注入小鼠huh7细胞异种移植 (t：肿瘤，li：肝脏，h：心脏，l:肺脏，k:肾脏，s:脾脏，b:脑，颜色尺 度:辐射效率，[ps?1cm?2sr?1][μw cm?2]?1，其中在tpgs?fa/nc处理 组中心脏和脑显示非常低的荧光表达量，如图23的(a)中表示正常器官 的生物分布的定量分析，(b)为tpgs?fa/nc纳米颗粒在肿瘤生物分布的 定量分析。[0139]氯化两面针碱新纳米靶向制剂抑制裸鼠成瘤能力的影响[0140]图24皮下成瘤模型表明氯化两面针碱纳米靶向制剂抑制在体内可靶 向抑制肝癌细胞的生长，我们从体外证明了氯化两面针碱新纳米靶向制剂 抑制肝癌细胞增殖作用，接着我们通过裸鼠皮下成瘤模型来进一步探讨氯 化两面针碱纳米靶向制剂在体内对肝癌细胞生长以及对肝癌细胞增殖的影 响。结果显示，与对照组相比，在裸鼠huh7皮下成瘤模型中，氯化两面针 碱纳米靶向制剂组与氯化两面针碱组和阳性对照组5?fu相比，形成肿瘤的 体积明显更小、肿瘤的重量也更轻(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001)能够 有效地抑制肝癌细胞的增殖，并且通过脏器he染色发现，药物对裸鼠重 要脏器无明显毒害作用。图24，裸鼠接种肝癌治疗后代表性图片(n＝5,通 过t检验，肿瘤组织重量的数值表示为：mean±s，d，*p<0.05,**p<0.01, ***p<0.001，tpgs?fa/nc组与nc组、pbs、5?fu组相比较，分别相对应 p＝0.01,8×10?4,2×10?4。[0141]如图25，a:腹腔注射治疗裸鼠原位huh7异种移植与氯化两面针碱纳米 颗粒(红色)和对照组(绿松石色)，5?氟尿嘧啶(紫红色)，蓝色:pbs)每隔 一天注射5次(4mg kg?1，按单位体重nc，如箭头表示)；b:裸鼠体重，(n＝5，通过t检验，肿瘤体积的数值表示：mean±sd，*p<0.05,**p<0.01, ***p<0.001；tpgs?fa/nc组与nc组、5?fu组、pbs组相比较，分别相 对应p＝4.3×10?3,3.4×10?3and 5.0×10?4。[0142]检测了氯化两面针碱新纳米靶向制剂抑制肝癌作用免疫组化结果 从图25和图26可见，根据免疫组化研究显示氯化两面针碱新纳米制剂抑 制aqp3蛋白水平表达，特别减少对肝癌干细胞阳性表达epcam+cd133+ 蛋白水平，同时也减少nek2蛋白表达水平，同时从图26可见氯化两面针 碱新纳米制剂抑制裸鼠肿瘤组织aqp3、nek2、epcam、cd133免疫组 化蛋白表达与对照组pbs对比有显著性差异。表示氯化两面针碱新纳米制 剂可以通过影响nek2表达从而抑制肝癌细胞转移侵袭。图26，氯化两面 针碱新纳米制剂抑制裸鼠肿瘤组织aqp3、nek2、epcam、cd133免疫 组化蛋白表达(**p<0.01)。[0143]图27，免疫组化检测tpgs?fa/nc对aqp3、ecapm、cd133、nek2 蛋白在li?7肝癌细胞中的表达水平影响。图28，tpgs?fa/nc作用后对裸 鼠肿瘤组织aqp3、epcam、cd133、nek2蛋白表达影响。[0144]图29，通过he染色检测不同处理组对裸鼠器官的影响，a组：生理盐 水组，b:nc组，c:tpgs?fa/nc组，d:5?fu组，结果分析：通过he染色 观察，氯化两面针纳米制剂对裸鼠重要器官无毒副作用，安全性高。[0145]流式细胞术检测细胞凋亡过程为：[0146](一)实验步骤：[0147]1.细胞用胰酶充分消化，取细胞接种于6孔板中，分为对照组、5?fu、 tpgs?fa、nc组、tpgs?fa/nc组，加入上述处理组作用细胞48小时。 然后吸除上清液培养基，胰酶消化贴壁细胞，转移15ml离心管中，1500rpm 离心收集细胞后，然后用pbs清洗重悬细胞3次，再离心收集细胞过筛， 避免细胞团，吸取?fitc annexin v/pi凋亡检测试剂加入上述每个离心管 中，再将细胞混悬液转移至流式管中，常温避光孵育20min，最后使用bd 细胞流式分析仪检测细胞凋亡。[0148]2.激光共聚焦显微镜观察细胞凋亡情况huh7细胞按1×104细胞/孔密度 接种于6孔板，里面放置细胞爬片。经过24h后，50％细胞粘附在细胞爬 片上面，分别用含5?fu、tpgs?fa、nc或tpgs?fa/nc(50μg/ml)的新鲜 培养基替换培养液24h后，移除培养基，用2.5％戊二醛在4℃下固定15min， 然后用hoechst33258(1μg/ml,1ml/孔)在37℃下计数15min，然后用冷 pbs洗3次。最后，用20×对huh7细胞成像，用激光共聚焦显微镜检测药 物是否诱导细胞凋亡。[0149](二)实验结果：细胞凋亡结果表明,各处理组作用huh7细胞24h后， 氯化两面针碱新纳米靶向制剂组诱导细胞凋亡率为22.7％±1.1，tpgs?fa 组诱导细胞凋亡率为10.3％±0.1，5?fu组诱导细胞凋亡率为11.9％±0.2， 氯化两面针碱组诱导细胞凋亡率为12.1％±0.3，与对照组凋亡率6.4％±0.1 相比有显著性差异，局有统计学意义。图30各处理组作用24h后，细胞显 示出明显的信号，这与诱导细胞凋亡有关，并且与流式细胞术分析一样， 氯化两面针碱新纳米靶向制剂比氯化两面针碱组诱导肿瘤细胞凋亡的信号 强，显示氯化两面针碱新纳米靶向制剂可以提高氯化两面针碱抗肝癌作用。[0150]二、蛋白免疫印迹[0151](一)实验试剂[0152]美国－bd bioscience公司：脱脂奶粉，中国北京索莱宝：20×tbs、20?×running buffer，美国－thermo scientific公司:marker，北京－普利莱公 司：细胞裂解液－ripa、10×tbst，中国上海碧云天公司：电泳液、 转膜液、ecla液、eclb液、超敏发光液底物和蛋白定量试剂盒，美国－ thermo scientific公司：蛋白酶&磷酸酶抑制剂混合物溶液cocktail，实验用 抗体：详见表3，中国碧云天公司?dapi染色液,10ml；中国北京索莱宝?mtt 试剂,50mg；中国福州迈新生物科技有限公司dab?1031?dab；[0153]3.10中国南京建成公司d005?苏木素染色液；中国国药集团化学试剂 有限公司10004160?中性树胶；中国江苏凯基生物技术股份有限公司 kgsp1?免疫组化笔；中国江苏凯基生物技术股份有限公司kgb5001?pbs； 中国江苏凯基生物技术股份有限公司kgb5001?柠檬酸钠缓冲液；中国福州 迈新rak?2001?耐高温塑料染色架。[0154]表3所用抗体[0155][0156](二)western blot过程：[0157](1)上样、电泳：将10％预制胶放入电泳仪中，上好夹子保证密封 性良好，再加入适量1×电泳液直至浸没梳子上缘，根据实验设计需要及分 组情况加入5?7μl蛋白marker，毎孔再加入10μl待测样品。随后接通电源 开始电泳，恒压下80－140v，直至marker到达预制胶底部，终止电泳。[0158](2)切胶、转膜：将电泳好后的预制胶浸没至转膜液里，根据预染marker 确认目的蛋白位置并小心切下放于转膜夹上。然后根据目的条带的宽度切 取相同大小的孔径为0.45nm的pvdf膜(先浸泡在甲醇中30秒激活)。以黑 (阴极)一海绵一3层滤纸一含目的蛋白的胶一pvdf膜一3层滤纸一海绵一 红(阳极)放置于转膜夹中。主要：膜与胶贴合要紧密，之间不能产生气 泡。最后倒入转膜液浸没转膜夹，将转膜槽置于冰浴中，350ma恒流60 －90分钟。[0159](3)封闭：转膜完成后，将膜取出并浸泡于1×tbst中漂洗除去残留 转膜液，常规选用含5％脱脂牛奶的封闭液，磷酸化蛋白可以用含5％牛血 清白蛋白(bsa)[0160]封闭液。室温下摇床缓慢摇晃60－90分钟。[0161](4)孵育抗体：封闭完毕后，将膜取出并浸泡于1×tbst中漂洗除去 残留封闭液，然后用滤纸吸干膜上的液体，将膜浸没于相应一抗中，4 ℃缓慢摇晃使膜与抗体充分接触孵育过夜。次日用1xtbst剧烈摇晃 10min×3次，再浸没于1：3000稀释的兔或和鼠二抗溶液中，室温下摇床缓 慢摇晃lh，使一抗、二抗充分结合，然后再用1xtbst剧烈摇晃×?次，以备显影。[0162](5)曝光显影：根据蛋白表达量的不同可选择ecl发光液与超敏发 光液，利用bio－rad显影仪曝光成像，运用image?lab软件进行条带分析。[0163](三)氯化两面针新纳米靶向制剂通过aqp3调节jak/stat3通路蛋白表 达。[0164]为了进一步探究氯化两面针新纳米制剂抑制jak/stat3通路具体分子 机制，我们通过蛋白免疫印迹实验检测stat3信号通路相关蛋白的表达情 况。结果显示，药物作用48h后在huh7和li?7细胞能够下调aqp3、cd133、 jak1、jak2、stat3及py705?stat3蛋白表达水平。如图32为氯化两面 针碱新纳米靶向制剂通过aqp3蛋白调节cd133和py705?stat3蛋白表 达图。dmso组、tpgs?fa/nc:10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml。[0165]三、氯化两面针碱与蛋白分子对接模拟试验[0166]分子对接是一种基于配体?受体三维结构的理论模拟方法，该方法通过 将配 体置于受体活性位点处寻找配体?受体之间相互作用的最佳匹配，可以直接 地揭示配体结构与受体活性之间的关系，并已广泛用于药物与蛋白受体筛 选的研究中。利用分子对接技术对比解析氯化两面针碱(配体)作用蛋白 (受体)生物活性的作用位点、作用模式、作用类型的差异。分子对接主 要实验步骤如下：物质准备用于分子对接研究的蛋白取自蛋白质晶 体结构数据库(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)，pdb代码为 1fjm。利用moe软件①删除1fjm的多余对称结构，得到mclr?pp1 的结合物；②从seq处找到nchif?1，从builder将nchif?1改为vegfd、jak1、jak2、stat3、nek2分别得到hif?1、vegfd、jak1、 jak2、stat3、nek2与氯化两面针碱(nc)结合物(图33)。[0167]实验方法[0168]通过moe分子对接技术模拟药物与蛋白相互作用。①打开moe软件 及待对接物。②在moe界面，设定amber力场为10:eht；solvation: r?field；温度25.0℃；ph 7.4；盐度0.05m，在compute/docking...模块 做整体能量输出。③能量最优。右侧功能栏stieview提取出配体(mcs) 与受体(pp1)的结合位点；ligx选中5000受体蛋白数值，提高受体刚性， 利于配体与受体不同位点的结合，同时为受体、配体加上氢和电荷；点击 右侧minimized，实现配体与受体结合的能量最优和评分。④moe界面， compute/docking...模块再做一次整体能量输出。⑤moe界面， compute/ligandinteractions...模块输出作用、作用键类型等数据。⑥不同残 基结合面积的输出：moe界面，新建database界面，依次输入两个分子 的结合物、第一个分子、第二个分子，在dbv界面计算。第一个分子与 第二个分子面积之和减去这两个分子分别的结合物面积，所得面积的一半 即为配体与受体对接物的结合面积。hif?1、vegfd、jak1、jak2、stat3、 nek2与氯化两面针碱(nc)结合物解析hif?1、vegfd、jak1、jak2、 stat3、nek2与氯化两面针碱(nc)结合物的空间结构、关键作用位点、配 体?受体面积评分、氢键进行比较解析，并与分子western blot实验结果对 比分析，阐明氯化两面针碱(nc)对hif?1、vegfd、jak1、jak2、stat3、 nek2蛋白作用，如图34?39所示。[0169]rda分析结果表明，药物?蛋白结合后整体能量的下降程度与氯化两面 针碱(nc)与hif?1、vegfd、jak1、jak2、stat3、nek2蛋白生物活性 的结合作用存在正相关性。通常而言，对接产物的能量变化与相互作用强 弱成一定相关性，能量下降越大，相互作用越强；且配体?受体相互作用与 对接物整体结合面积变化相关，受配体亲疏水性差异及结合物氢键、离子 键作用的制约。前述关于药物?蛋白配合物结合面积变化的研究表明对接产 物整体结合面积与能量下降值存在负相关性，同时结合面积的变化受疏水 作用和空间位阻的影响显著。因此药物?蛋白对接产物的能量变化差异应 归结于氢键和亲疏水性影响；其中，hif?1的氨基酸亲水性较强，亲水性作 用对结合能量的变化影响大于疏水作用，能量下降值增大。综上所述，药 物?蛋白对接后整体能量下降程度与结合作用成一定的正相关，表明药物和 蛋白结合产物能量变化可以作为评价其药物与蛋白结合的重要指标。[0170]细胞免疫组化[0171]1.预处理[0172]石蜡切片：按常规方法进行脱蜡，水合，将切片用二甲苯浸泡5min， 更换二甲苯后再浸泡5min。分别用无水乙醇中浸泡5min；95％乙醇中浸泡 5min；85％乙醇中浸泡5min；70％乙醇中浸泡5min，pbs浸洗3min×3次。[0173]2.实验步骤[0174]2.1抗原修复：将放有切片的耐高温塑料染色架放入盛有抗原修复缓冲液 的染色盒内，放至微波炉中，中高火档至加热10分钟，将染色盒取出浸入 流水中(不可将玻片从缓冲液中取出冷却)，自然冷却后用pbs浸洗3次[0175]2.2灭活酶：每张切片滴加2滴3％h2o2?甲醇溶液，室温(15?25℃)封 闭10min。。pbs浸洗3min×3次；[0176]2.3封闭:滴加1％bsa50?100ul,室温孵育20分钟。甩去，不洗。[0177]2.4抗原?抗体反应：滴加一抗50?100ul，4℃过夜。pbs浸洗3min×3次；[0178]2.5一抗二抗反应：滴加羊抗兔/鼠聚合物50ul，室温湿盒孵育20分钟。[0179]pbs浸洗3min×3次；[0180]2.6显色：每张片子加2滴新鲜配制的dab溶液；[0181]2.7终止显色：镜下观察染色深浅，染好立即终止,用自来水轻柔冲洗15 分钟用蒸馏水终止显色反应；[0182]2.8复染：将切片放入苏木素染液，染色10min，用蒸馏水冲洗干净。 如染色过深，可用0.1％hcl分化，自来水冲洗后返蓝；[0183]2.9脱水封片：分别用70％乙醇中浸泡5分钟；85％乙醇中浸泡5分钟； 95％乙醇中浸泡5分钟；无水乙醇乙醇中浸泡5分钟。用二甲苯浸泡10分 钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟。在切片上加中性树胶，加盖玻片；[0184]2.10观察：光学显微镜下观察组织细胞中蛋白的表达情况，取3个高表 达区域拍照保存(所有图片均400x拍摄)。[0185](四)将麻醉的裸鼠，解剖后摘取心脏、肝脏、肺脏、肾脏、脾脏、脑等 重要器官。[0186]重要器官垫上手术布后放入成像箱，轻轻关门。ivis acquisition controlpanel中选择成像模式：luminescent(生物发光)或fluorescent(荧光)。 选择曝光参数，默认值为auto(注：也可手动调节成像参数，包括exposuretime曝光时间，binning，f/stop光圈)。确保photograph和overlay选项 被勾选。选择成像视野大小：所有器官都能拍照。excitation filter默认为 block，emission filter默认为open，对于荧光成像，需依据目标荧光染料 或探针选择合适的激发(excitation filter)和发射(emission filter)滤光片。 点击acquire按钮获取成像图片，在自动弹出的image labels中对图片进行 命名和注释。获取图片后，点击tool palette中的image adjust，将individual 勾选框去掉，使得color scale可以显示出来，点击tool palette中的roitools，选取circle，square，free draw或grid进行roi圈选。点击measurerois，获取roi区域的定量数值，定量单位为radiance(photons)，对于 荧光成像，定量单位为radiant efficiency。