基因治疗范文

　　基因治疗篇1

　　关键词基因治疗;治疗方式;发展前景

　　中图分类号r459.9文献标识码a文章编号 1007-5739(2010)01-0025-01

　　美国是世界上最早开展基因治疗的国家,也是目前开展基因治疗最多的国家。我国在1991年7月开始基因治疗的临床研究,最早的工作是对b型血友病的基因治疗及利用抑癌基因对癌症的基因治疗[1]。基因治疗目前主要用于治疗对人类健康威胁严重的疾病,包括遗传病、恶性肿瘤、心血管疾病、感染性疾病等[2]。

　　1基因治疗的方式

　　1.1体内基因治疗

　　体内基因治疗是指将具有治疗功能的基因直接转入病人的某一特定组织中。利用反转录病毒载体已成功地将真核基因转入动物细胞,但通过质粒dna的直接操作,将更加省时而且产量较高;采用温和病毒载体的体内基因治疗主要是通过腺病毒和单纯疱疹病毒来完成的,即将载有矫正基因的载体直接注射入需要这些基因的组织。以腺病毒为载体的体内疗法在遗传性疾病方面,目前主要见于囊性纤维变性的基因治疗研究。多数研究表明,基因治疗纠正了呼吸道上皮的氯离子转运缺陷,使跨上皮基础电位下降,肺功能有所改善[3]。

　　1.2反义疗法

　　反义疗法主要是通过阻遏或降低目的基因的表达而达到治疗的目的。反义疗法是通过引入目的基因的rna的反义序列而达到上述目的。当引入的反义rna与mrna相配比后,用于翻译的mrna的量就大大减少,因而合成的蛋白的量也相应大大减少。引入的反义序列也可能与基因组dna互补配对,从而阻遏mrna的转录。这2种情况都会使细胞中靶基因编码的蛋白合成大大减少,以达到基因治疗的目的。

　　1.3通过核酶的基因治疗

　　20世纪80年代初,美国科学家cech和altman发现了核酶,核酶是指由rna组成的酶,能够序列特异性地抑制靶mrna。近年来,核酶在抑制癌基因的表达[4]、增强肿瘤对药物的敏感性及抑制肿瘤血管的生成等方面的应用得到了广泛的研究。

　　1.4自杀基因疗法

　　自杀基因疗法是恶性肿瘤基因治疗领域最有希望的方法之一,已广泛用于各种恶性肿瘤的基础研究和临床试验性治疗。它是用药物敏感基因转染肿瘤细胞,其基因表达的产物可以将无毒性的药物前体转化为有毒性的药物,影响细胞的dna合成,从而引起该肿瘤细胞的死亡。

　　2基因治疗存在的问题

　　2.1基因治疗的社会和伦理问题

　　基因治疗不仅仅是一种医疗方法,它还涉及很多其他问题。因为当人们试图“纠正”人类自身“不正常”的基因时,这种纠正的后果是无法预料的。由于人类的遗传信息非常复杂,转基因也可能带来不可预料的后果,没有人能保证这种基因结构的改变绝对不会造成人类某一未知功能的缺失。另外,当人们试图把基因治疗引入生殖细胞时,又涉及后代基因结构的改变问题,且改变将直接影响这个“未来人”,这是一个很难解决的伦理问题。

　　2.2基因治疗的技术问题

　　目前,基因治疗的对象是单基因的缺陷,但许多疾病涉及多个基因之间复杂的调控和表达关系。对这类疾病的基因治疗难度很大,因为向细胞中导入多个基因后,使几个基因之间能保持正常的调控关系几乎是不可能的。即使是单基因缺陷症,使导入细胞的基因能正常表达也是一个较复杂的问题。将基因导入细胞后,其表达量的多少是直接影响能否达到治疗的目的和有无副作用的关键。但这个问题将会在人类基因组计划完成的基础上,对人类后基因组计划的开展,弄清了人类基因之间复杂的调控联系后而最终得到解决。只有这样,才能在基因治疗中尽量做到使导入的基因处于正确的调控下,取得治疗效果,消除副作用。

　　3展望

　　以基因转移为基础的基因治疗要在临床上很好地应用,还有待理论和各种技术的进一步发展。过去20~30年基因治疗的发展已取得了巨大成就,已被看成是对先天和后天基因疾病的潜在有效的治疗方法,不过其依然存在缺少高效的传递系统、缺少持续稳定的表达和宿主产生免疫反应等问题。今后基因治疗研究将向2个方向发展:一是基础研究更加深入,以解决在临床应用中遇到的一些困难及基因治疗本身需要解决的一些难点;二是临床试用项目增多,实施方案更加优化,判断标准更加客观,评价效果更加精确。总之,随着分子生物学、分子遗传学以及临床医学的发展,基因治疗也会不断发展,日趋成熟,很多难题会得到解决,并在临床上得到广泛应用。 编辑整理

　　4参考文献

　　[1] 李立家,肖庚富.基因工程[m].北京:科学出版社,2004.

　　[2] anderson w.human genetherapy[j].nature,1998(392):25.

　　[3] alton e w,geddes d m,gill d r,et al.towards gene therapy for cystic fibrosis[j].gene ther,1998,5(3):291-292.

　　基因治疗篇2

　　吴祖泽 我国实验血液学学科的学术带头人、中国科学院院士、博士生导师、少将军衔。1935年10月19日生于浙江省镇海县。1957年9月毕业于山东大学。历任军事医学科学院实习研究员、助理研究员、副研究员、研究员、副所长、所长、军事医学科学院院长等职。现任《国家重点基础研究发展规划》专家顾问组成员、《中国科学》、《科学通报》副主编、中国病理生理学会实验血液学专业委员会主任委员。

　　1973年赴英国帕脱森肿瘤研究所进修实验血液学，完成题为《连续照射下造血于细胞动力学》的科学论文。1978年撰写出版30多万字的《造血细胞动力学概论》，是我国第一本介绍血细胞生成动力学与造血干细胞研究的专著，成为国内许多年青的实验血液学专家成长与成才道路上的一本启蒙性著作。1988年主编出版了《造血干细胞移植基础》一书，对于普及和推进我国造血干细胞移植作出了有益的贡献。2000年，主编出版了《造血调控》一书，推进了我国实验血液学的发展。

　　与同事们采用天然的性染色体和性别决定基因作为遗传学标志，结合单个脾结节转移技术，证实了骨髓细胞在照射小鼠脾脏上生成的脾结节是起源于单一细胞增殖与分化的结果。这类细胞不仅具有重建髓系细胞的功能，而且具有重建淋巴细胞的功能，澄清了多年来文献中有关脾结节生成细胞性质的争论。在此基础上，进一步提出了造血干细胞群的不均一性的科学依据。他领导的《造血干细胞群的不均一性与动力学研究》，1987年获国家自然科学二等奖。

　　在动物和人胎肝细胞性能与移植的实验研究中，比较完整地提出胚胎发育中肝脏造血和造血干细胞的动态变化规律，发现4－5月龄胎肝中含有最丰富的造血干细胞，以此为理论依据，合作完成世界上首例胎肝移植对急性重度骨髓型放射病人的成功冶疗。进而，深入研究胎肝中刺激造血、刺激肝细胞生长以及低分子制瘤物等三类因子的纯化及物理学特性。首先发现分子量为15KD的人源性肝细胞生成素，1995年获美国专利（A novel hepatokine and methods for its use. No,5440022.1995.8.）。1999年《人肝细胞生成素的发现及其分子生物学系列研究》获国家科技进步二等奖。首次发现邻苯二甲酸正丁酯具有诱导肿瘤细胞凋亡、净化白血病人骨髓中残存白血病细胞的药理功能。

　　深入研究造血干细胞的辐射损伤与恢复规律，较全面地阐明了在低剂量率γ线连续照射下，造血干细胞的辐射损伤程度与累积照射剂量之间存在的双相特征的机理，首次系统地提示了“低剂量率χ或γ线连续照射下，引起动物辐射死亡所需要的累积剂量，要比较大剂量一次急性照射高许多倍”这一现象的机理。从造血干细胞与造血微环境的辐射损伤研究中，推测了对造血系统的远后效应，这些动物观察结果，已为以后的几起急性或慢性照射引起的事故性放射病人的病程中所证实。一些代表性论文在国外杂志发表后，已被不少国内外学者引用。1988年被选为国际辐射研究协会首任中国理事。

　　1996年以后，领导开展了基因治疗研究，构建了携带人肝细胞生长因子(HGF)的重组质粒和腺病毒，研究了HGF刺激内皮细胞增殖和血管生成的机理，进而用以治疗肢体和心肌缺血，临床前的研究结果表明这一基因治疗方案安全有效，同时证明它们具有促进创伤愈合和减轻疤痕形成的功效，为发展一类新的基因药物打下了坚实的基础。

　　1990年国家人事部批准为“有突出贡献中青年专家”。1990年7月起享受国家政府特殊津贴。1999年中央军委批准授予“中国人民解放军专业技术重大贡献奖”。

　　吴祖泽以求实、创新、献身的精神为中国实验血液学做出了突出的贡献。

　　基因治疗药物研究

　　1990年美国NIH正式批准首例基因治疗方案的临床试验以来，全球已有五百多个基因治疗方案陆续进入临床试验，受试人数超过3000人，其中有5个肿瘤基因治疗产品已进入临床III期。国内已批准转导IX因子基因的体细胞治疗血友病B，腺病毒介导的P53基因或IL-2基因、HSV-TK用于肿瘤的基因治疗及VEGF基因用于肢体动脉闭塞症的特殊临床试验或新药研发。多数试验研究表明，基因治疗是安全、有效和易于操作的，基因治疗正逐步走向临床。与基因工程药物相比，基因治疗研究的历史尚短，但是从临床治疗的需要出发，加上技术的不断成熟，基因治疗从治疗方案逐步发展成为治疗药物的前景是乐观的。

　　基因治疗的成功取决于采用的治疗基因、携带基因的载体以及选择适当的适应症。根据近年来基因治疗研究中暴露出来的问题，在发挥基因治疗优势的同时，应充分重视和避免可能影响人体安全的风险，扬长避短，稳步推进基因治疗药物的研究。

　　基因治疗主要分为两类：一类是基因置换（Gene Replacement），重点是对先天性遗传疾病中缺陷基因换入正常基因后达到治疗的目的。例如，早期采用逆转录病毒为载体携带腺苷脱氢酶（Adenosine deaminase, ADA）基因治疗联合免疫缺陷病等。由于目前的基因置换是正常基因在染色体上随机整合的过程，因此在治疗安全性上有一定的风险；另一类是基因过渡（Gene Transit），即选择一些载体（例如，腺病毒、质粒等）携带治疗基因后转导正常或变异细胞，利用细胞的转录和翻译系统，将生成的目的产物释放到细胞外，或者改变细胞的某些性能等，起到对局部或整体的治疗效果。基因过渡的有效治疗时间比较短，但安全性较高，对治疗某些获得性疾病有一定的用途。

　　下面介绍几个获得性疾病采用基因过渡策略的治疗实例。

　　治疗肢体动脉闭塞病

　　通过肌肉注射或基因枪转移途径导入肝细胞生长因子（Hepatocyte growth factor，HGF）基因至局部缺血部位，治疗肢体动脉闭塞病。

　　肢体动脉闭塞病是一类严重威胁人类健康的血管疾病，目前尚无较好的药物治疗方法，主要借助外科手术重建功能动脉，但危险较大，并发症多，预后差，对弥漫性动脉闭塞者更无法进行手术，病情常常进行性恶化，最终发展为截肢或全身衰竭。因此，当前国内外迫切需要研究探索治疗肢体动脉闭塞病的新策略。HGF具有很强的促进血管新生和建立侧支循环的作用，可防止组织缺血坏死；HGF还可刺激体内骨骼肌的再生，防止肌萎缩和肌纤维化发生，从而有利于肢体功能的恢复。以pUDK质粒为载体携带HGF基因，将HGF基因以裸露DNA的形式用肌肉注射或基因枪转移的途径转移至肢体缺血部位，在缺血局部形成侧支循环，建立“分子搭桥”机制，对肢体动脉闭塞病患者是可行、简便、安全、有效的生物药物治疗方法。

　　治疗心肌缺血

　　缺血性心脏病是流行性广且危害严重的疾病，在西方国家是成年人的首位死亡病因。相对而言，我国目前尚属冠心病的低发病国家，然而患病率正逐年上升。虽然冠心病的诊断手段已能对患病冠脉的病变部位及管腔狭窄程度作出准确判断，对管壁病变的程度也有所了解；并且已有各种有效的治疗手段，如抗凝、溶栓、经皮腔内冠脉成形术和冠脉搭桥术等。但对一部分弥散性心肌缺血和术后再狭窄的病人来说，就不适宜手术治疗；且突然供血会引起再灌注损伤。所以，基因治疗提供了一种新的思路，虽然还处于试验阶段，但已经开发出多种载体，并开展了应用不同的促血管生长因子如血管内皮细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、HGF等的临床前研究。

　　治疗病理性瘢痕

　　病理性瘢痕是创伤修复过程中的一种重要并发症，见于深度灼伤，某些手术切口及其它损伤的创伤愈合后，除外观畸形、疼痛难忍外，亦可因瘢痕挛缩导致生理功能障碍。目前人们对瘢痕增生后的治疗主要靠手术、加压、冷冻等方法，均不是理想的手段，探索预防瘢痕过度形成和治疗已增生瘢痕的新途径具有重要的意义。HGF是一多功能的生长因子，不仅刺激皮肤微血管内皮细胞增殖、运动，而且可促进皮肤角质细胞的迁移运动，能够明显地抑制TGF-b的产生和增强胶原酶的活性。因而，HGF对于促进伤口愈合、预防创伤愈合过程中瘢痕的过度形成和治疗己增生瘢痕会有一定的效果,在整形外科中具有一定的应用前景。

　　治疗恶性肿瘤

　　恶性肿瘤已经成为威胁人类健康的主要疾病，全球每年病死人数达700万。在手术切除、化疗、放疗基础上，肿瘤的基因治疗已经成为一个新的治疗或辅助治疗的发展领域。治疗策略包括肿瘤抑制基因治疗、肿瘤免疫基因治疗、肿瘤自杀基因治疗等。

　　P53基因有诱导肿瘤细胞凋亡和杀死肿瘤细胞以及降低耐药肿瘤细胞的耐药性的作用。GM-CSF和B7-1有增强机体抗肿瘤免疫反应、进而杀死残留或转移的癌细胞的作用。因些，构建一个以复制缺陷型腺病毒为载体，携带肿瘤抑制基因P53以及肿瘤免疫相关基因GM-CSF和B7-1的重组腺病毒(Ad-p53、GM-CSF、B7-1)，有可能起到肿瘤免疫基因和抑制基因的联合治疗作用.

　　基因治疗篇3

　　关键词：基因治疗；靶向治疗；体细胞治疗；进展

　　1、前言

　　基因治疗研究是采用基因工程技术，将正常基因导入靶细胞，从而对基因缺陷引起的疾病而进行的治疗。基因治疗是针对疾病的根源，即基因所进行的治疗，现广泛应用于肿瘤及心血管疾病的治疗研究[1]。在遗传性疾病或是肿瘤的治疗中，传统的药物治疗不能够完全控制疾病的恶化，肿瘤疾病的手术治疗能够缓解病症，但是会造成组织不能够恢复重建，影响患者的正常生活。基因治疗针对遗传性疾病、心血管疾病、感染性疾病以及恶性肿瘤等相关的治疗方面具有防范的应用，而且不影响患病组织重建以及生长。基因治疗是随着细胞生物学、免疫生物学以及分子生物学的发展而发展起来的，本文将对基因研究的发展进展进行综述研究，同时指出基因研究的发展方向。

　　2、基因治疗技术

　　2.1 基因治疗技术的发展现状

　　在生物医学领域，人类的疾病的根源是基因发生缺陷，包括遗传缺陷或是外界环境造成的生理缺陷。在基因学中，人类的疾病主要可以分为三大类：（1）单基因病，即其中一个基因发生缺陷而导致的疾病；（2）多基因病，病症的诱因既表型都呈现多样性；（3）获得性基因病，由于病原的侵入而产生的疾病。基因治疗技术是随着对基因的不断认识而发展起来的，最初的基因治疗技术是将具有正常功能的细胞导入具有缺陷的靶细胞内从而对疾病进行治疗的技术。随着对基因的研究不断加深，以及细胞生物学、免疫生物学和分子生物学的而不断发展，基因治疗技术已经发展成为将遗传物质导入到人体细胞，从而进行治疗的技术，其中基因治疗技术包括核酸治疗、反义基因治疗以及DNA疫苗的治疗技术。

　　2.2 基因技术的形式

　　根据基因的治疗方式，可以采用体细胞基因治疗和生殖细胞基因治疗。

　　2.2.1 生殖细胞基因治疗

　　通过在生殖细胞中将正常基因导入，然后在外界将其培养生成正常的个体，从而采用移植等技术对患者进行治疗。但是这种治疗方法涉及到人类伦理的问题，所以现阶段的生殖细胞基因治疗主要是针对动物使用。这种靶细胞的治疗方法的成功率并不高，整体发展较为缓慢。

　　2.2.2 体细胞基因治疗

　　体细胞基因治疗是将具有正常功能的细胞转移到具有基因缺陷的靶细胞内，在正常基因细胞的增值过程中，取代具有基因缺陷的细胞，从而达到治疗的作用。这种基因治疗方法主要是对基因的缺陷进行补偿，并且在治疗的过程中只需要针对某一种类型的细胞中集中表达，采取少量的基因控制就可以达到治疗的目的。目前这种基因治疗的方法广泛的应用于疾病的基因治疗中。

　　2.2.3 基因治疗的载体

　　在基因技术中，基因治疗的疗效受到基因的的载体的影响。在进行治疗中，常用的有病毒性载体以及非病毒性载体两类[2]。现在最常使用的病毒性载体主要有：（1）牛痘苗病毒，牛痘苗病毒分子量大可以用于短期的基因表达，是一种可用于多种基因表达的高效病毒性基因，但是容易引起免疫反应；（2）逆转录病毒载体，逆转录病毒具有转染范围广、感染率高并且不易发生病变的优点，是现阶段应用得最为广泛的载体；（3）腺病毒载体是一种没有包膜结构的病毒，在复制增值的过程中不依赖于宿主细胞的分裂，且不与宿主的基因组发生整合，因此相对安全，并且可以直接作用于体内。

　　非病毒性载体主要使用的有：（1）脂质体，脂质体在人体内可以长期稳定的存在，并且对人体的正常细胞影响较小；（2）线粒体载体，这种载体可以在生物体内共存并且不产生免疫反应；（3）噬菌体载体，这种载体增值，容量大，在基因治理中具有靶向性强的优点。

　　3、基因治疗技术最新进展

　　3.1 恶性肿瘤的基因治疗

　　恶性肿瘤的基因治疗的种类很多，在进行肿瘤的治疗中，主要采用的是肿瘤抑制基因治疗、免疫基因治疗以及药物敏感性基因治疗等方面。

　　3.1.1 肿瘤抑制基因治疗

　　肿瘤细胞的最大特点是能够在人体内进行增值，因此在进行肿瘤的治疗中，采用合适的方法抑制肿瘤病毒的增值，使肿瘤的情况得到控制甚至所有改善。在肿瘤抑制基因治疗研究的早期，采用原激活物抑制剂I型基因腺病毒载体、鸡贫血病毒（CAV）等能够对肿瘤基因进行有效的抑制，同时对人体的正常细胞的影响较小。现阶段对肿瘤抑制基因治疗中应用得最为广泛的是P53腺病毒，在进行治疗的过程中，采用P53腺病毒载体，对在人体内产生肿瘤抑制的作用。在医学临床实践中，该方法已经用于肺癌、乳腺癌、喉癌等实体性肿瘤的治疗。

　　3.1.2 免疫基因治疗

　　免疫基因治疗的原理是通过将细胞基因注入到人体内，从而增强机体对肿瘤细胞的免疫能力，常用的方法主要有（1）肿瘤抗原基因的免疫治疗，将肿瘤的抗原基因导入到患者体内，使患者的肿瘤细胞的免疫原性增强；（2）利用细胞因子进行基因治疗，通过将B7-1，GM-CSF等细胞因子对肿瘤细胞进行转染，增强了对肿瘤细胞的免疫反应；（3）利用反义核酸的作用，作为信息药物对肿瘤基因进行治疗。

　　3.1.3 药物敏感性基因治疗

　　通过单纯孢疹病毒胸苷激酶基因治疗，可以有效的治疗肿瘤细胞。这种治疗方式，是将“自杀”基因导入到肿瘤细胞中，通过与肿瘤细胞相互作用，从而产生出能够杀死肿瘤细胞的药物，这种药物对人体的正常细胞没有明显的作用，但是可以有效的杀死肿瘤细胞。这种药物敏感型基因治疗的方法可以有效的应用于脑恶性胶质细胞瘤的治疗，与化疗相结合，能够有效的提升治疗的效果。

　　3.2 传染性疾病基因治疗

　　3.2.1 AIDS基因治疗

　　AIDS的基因治疗，主要采用基因技术抑制HIV的繁殖。（1）采用反义核酸能够有效的阻断HIV繁殖中所需的Tat的增值，从而抑制AIDS的增值；（2）基因被动免疫疗法，利用具有单抗的2F5的H与L链作用于腺体从而产生2F5型抗体，该抗体能够对HIV分离株进行处理，从而阻止HIV的复制。

　　3.2.2 乙肝基因治疗

　　乙型病毒性肝炎是一种传染性疾病，容易引起肝细胞炎症、纤维化。采用基因治疗方法，可以对乙型肝炎病毒进行控制。最初采用HBV核酸疫苗进行治疗，利用基因枪将DNA疫苗质粒打入人体，但是由于DNA疫苗会诱发免疫反应，所以得到的结果并不理想。在随后的基因治疗中，采用表面抗原的乙肝DNA疫苗进行接种处理，产生了较强的CTL反应。pCMV-S2. S DNA 疫苗已经在实验中证明了有良好的临床效果，通过DNA疫苗接种后，接受试验的慢性乙肝患者的HBV DNA水平下降，其中一名体内的HBV得到全部清除。采用基因疗法治疗乙肝，主要是诱导HBV的CTL反应，从而对乙肝病毒的复制进行抑制。

　　4、基因治疗前景

　　基因治疗的研究需要以基因诊断为基础，但是在现阶段，对于人类基因组的运转还没有充分的了解的情况下，采用基因治疗会导致不可预期的后果。在现阶段的基因治疗中，靶向治疗是一种重要的治疗方法，但是在进行靶向治疗的过程中，病毒携带基因会对有缺陷的靶细胞以及正常细胞同时产生作用，所以导致正常细胞产生病变的可能[3]。采用脂质体进行传递，可能会使外来基因发生过分表达，从而造成蛋白质的免疫反应。

　　基因治疗能够治疗多种疾病，而且前几年的临床治疗也取了的巨大的进展，但是基因治疗还存在着很多问题尚未解决。随着基因技术的不断发展，基因治疗会在疾病防御和临床治疗过程发挥更加重大的作用。

　　参考文献：

　　[1]于剑.原发性肝癌的基因治疗.山东大学[硕士论文]. 2012.

　　[2]王浩.靶向IL-1和RANKL的联合基因治疗磨损颗粒导致的无菌性假体松动的研究.山东大学[博士论文] 2012.

　　[3]曹志平.基因诊断和治疗技术中的医学道德.中国高等医学教育 ，2007，（8）：12一l3.

　　基因治疗篇4

　　肿瘤直径小于3厘米的小肝癌通常以手术切除为主，对于不能切除的肝癌可以采用化疗、放疗、介入的方法进行治疗。比起手术来，介入治疗属于微创手术，其治疗过程较为简单、安全，病人痛苦小，出血少、恢复快等多种优点，因此也受到了患者的认可。肝移植虽是肝癌患者获得根治性治愈的唯一希望，但根据米兰标准，如果肝癌患者的单个肿瘤直径超过3厘米，多个肿瘤累积直径超过5厘米时，不建议患者实施肝移植。

　　手术、化疗、放疗、介入和肝移植，这些方法虽有其优点，但又存在各自的局限性，不能完全满足患者的需要。为此，无数医学专家又开始寻求新的理想的治疗方法。

　　现在已知许多疾病是由于基因结构与功能发生改变所引起的。癌症实际上也是一种与基因有关的疾病，癌症的发生和发展与基因的改变有着密切的关系，基因治疗针对的就是肿瘤发生的根源。因此，基因治疗作为肿瘤治疗的新方法已逐渐进入人们的视野，并且正在逐渐进入临床。但大多数人对基因治疗的概念还不是十分了解，听上去好像还有点深奥。那么，什么是基因治疗，它的作用机理是什么，能治疗哪些疾病，效果如何，与其他治疗相比有什么优势，它今后的发展趋势和临床应用前景会是什么样的?

　　什么是基因治疗

　　基因治疗简单说就是用基因治病。癌症就是某些基因的突变造成的。应用正常的或野生型病毒的基因，校正或者替换人体细胞或组织内有缺陷的或致病的基因，使人体细胞依旧发挥正常的功能，来达到防治肿瘤的目的。专业上将所用的这种正常的或野生型病毒的基因称为目的基因，把人体内的细胞基因称为宿主细胞基因，肿瘤细胞叫靶细胞。将目的基因导入靶细胞以后，目的基因与宿主有缺陷的或致病的基因整合在一起，使目的基因成为宿主细胞遗传物质的一部分。这种方法又叫病毒载体方法。

　　肿瘤的基因治疗

　　肿瘤基因治疗技术目前分为两大类：一类称之为替代技术或添加技术，另一类是基因的封闭技术。临床上选用的方法主要有肿瘤自杀基因治疗和P53基因治疗两种。

　　肿瘤自杀基因就是将治疗基因用各种方法送入到肿瘤或异常细胞中，来抑制肿瘤生长或使肿瘤细胞死亡。治疗基因包括抑癌基因和诱使肿瘤死亡的基因。基因封闭技术是通过封闭或降解肿瘤基因达到治疗的目的，如P53肿瘤抑制基因。

　　治疗基因是怎样进入癌细胞的

　　将目的基因导入到靶细胞中的方法很多，大体上可分为物理学方法、化学方法，融合方法以及病毒载体方法四大类。目前绝大多数基因治疗采用的是病毒载体方法，因为病毒载体方法的基因转移效率很高，在合适条件下可达到100％，因而更受重视。

　　基因的导入方法有点像火箭发射，用一种经过改造的病毒作为火箭，把治疗基因“发射”到戒备森严的癌细胞内部，干扰其DNA的复制，从而让癌细胞自杀。基因药物对癌细胞有一种特殊的亲和力，进入人体后直接奔向癌细胞，与癌细胞亲密结合，把癌细胞杀死在萌芽状态。

　　下面我们通过肿瘤自杀基因的导入过程来了解病毒载体方法就更容易懂了。

　　肿瘤自杀基因

　　肿瘤自杀基因又称为TK基因。目前，经美国食品与药品管理局(FDA)批准的类似TK基因制剂临床试验在全球已经超过60个，用于多种肿瘤的治疗。自杀基因有很多种，北京佑安医院采用的是重组腺病毒一胸苷激酶基因制剂联合更昔洛韦的方法。重组腺病毒～胸苷激酶基因简称ADV-TK基因(这是一个专业术语，念起来有点绕口，知道就行了，下面还会多次提到，慢慢就熟悉了。)，胸苷激酶基因是从经过基因工程改造的单纯疱疹病毒里面抽出一个基因片段，经过改造后成为专门攻击癌症细胞的基因，这是要杀进肿瘤的炮弹，由“火箭”重组腺病毒将其运送到癌细胞中，有目标地直接插入到癌细胞的DNA中，破坏癌细胞的DNA，破坏后癌细胞的DNA是不完整的，不但不能再继续生长，而且会自杀死亡。

　　ADV-TK对肝癌、肺癌、胃癌、食管癌、上皮癌等14种肿瘤细胞均有明显的杀伤作用，抑瘤率可高达80％～90％。

　　基因治疗肝癌的给药途径

　　临床采用的给药途径主要有三种方法：瘤内注射、肝动脉灌注、门静脉注射。

　　瘤内注射是在B超的引导下，通过经皮穿刺将基因制品直接导入肿瘤局部。这种方法目的性强、操作简便、直观的优点，注射针头与身体的接触面积小，治疗所引起的免疫反应也很小。

　　肝动脉灌注，通过介入的方式进行动脉插管，将基因治疗药物直接注入肿瘤的供血动脉，药物随血流分布在整个肿瘤区域，使肿瘤区域和整个肝脏中的基因药物浓度增高，增加了肿瘤细胞的转染率。还可以用介入法经血管留置药盒，为基因治疗药物的多次导入提供了条件。

　　门静脉注射，由于胃肠道肿瘤主要通过门脉循环转移至肝脏，门静脉对少血供的肝癌、小肝癌、门静脉癌栓、转移瘤、卫星结节、大肝癌的周边包膜的供血起重要作用，因此经门静脉途径注射基因治疗药物也作为一种有效的给药途径。

　　治疗中的两个关键问题

　　高效性和靶向性是肿瘤基因治疗中存在的两个关键性问题。

　　问题一：国际上70％的抗肿瘤基因制剂采用了腺病毒负载的肿瘤自杀基因。实际上就是把重组的腺病毒和所携带的胸苷激酶基因片段打到癌细胞中。那么，打入多少病毒才够呢?多了，有可能使正常细胞也携带该基因制剂，其结果不但杀灭肿瘤细胞，也会杀死正常细胞，严重时可能导致患者死亡。少了，就不能杀灭肿瘤细胞。因此，每次治疗中使用的病毒量要根据肿瘤的大小来确定打入的基因量，过去规定基因治疗中每次使用剂量最大不得超过2×1013病毒颗粒。另外，一次基因治疗的有效时间约为20～30天，在此之后，未能杀灭的肿瘤细胞仍将继续生长，且人体还将对基因制剂产生抗体，每注射一次基因，其作用可能衰减25％，几次之后基因治疗就将无效。因此，剂量和疗程的准确关系到治疗的效果。

　　问题二：怎样做到既不影响正常的人体细胞，又要准确杀死肿瘤细胞。

　　就肝癌的基因治疗来说，肝癌自杀基因疗法采用的重组腺病毒载体较好地解决了这一问题，用重组腺病毒作为载体是经过多次试验和和多种病毒载体的选择后确认的。重组腺病毒载体能携带外源基因(如上面提到的胸苷激酶基因片段)靶向性地整合到靶细胞基因(肝癌的基因)组中，实现目的基因的持久稳定表达。

　　基因治疗的好处

　　经过肿瘤自杀基因瘤内治疗后，肿瘤的生长明显地受到了抑制，而且正常的肝脏组织不受影响。基因治疗属于微创治疗病人痛苦小，治疗过程用时短，治疗后卧床6～8小时后即可下床活动。一般说来，两个疗程即可见到疗效。就目前的治疗效果看来，基因治疗没有什么坏处，不会使注入基因的肿瘤细胞扩散，也不会影响肝脏的正常功能。由于腺病毒DNA不整合入宿主细胞基因组，所以对人体没有遗传性影响，而且作为基因载体，重组后的腺病毒具有感染效率高和安全的特点，成为药物敏感基因转导肝癌细胞的有效载体。

　　另外，它所特有的“旁观者效应”在治疗中也起到了非常好的作用。

　　基因治疗的应用前景

　　虽然基因治疗还没有完全应用于临床，但在临床的试验观察中，已让肝癌患者看到了希望，有些小肝癌患者，经过两个疗程的基因治疗后，经手术证实癌细胞完全坏死。虽然还有些弱点需要克服，但基因疗法与其他疗法、手术治疗，介入治疗、化疗，放疗以及肝移植的联合应用，可以互补其缺点，相互协调，增加抗肿瘤效果，这将成为今后肝癌治疗的发展方向。

　　基因治疗篇5

　　[关键词] 胰腺癌；基因治疗；研究

　　[中图分类号]R735.9 [文献标识码] B[文章编号] 1673-7210（2009）03（a）-156-02

　　胰腺癌是消化系统恶性肿瘤，占癌症死亡的第4位。由于胰腺位置隐蔽，临床症状多不典型， 不易被早期发现，同时其浸润性强并易发生转移，所以切除率低、预后差。近年来，胰腺癌的远期疗效和预后并未带来突破性进展，研究表明胰腺癌的发生发展为多基因参与、多步骤发生的复杂的生物学过程，因此基因治疗被认为是继手术、放疗和化疗等传统疗法之后肿瘤治疗的最有前景治疗方案之一，基因治疗中又以自杀基因体系和免疫基因体系方式最为引人关注，本文主要从这两种治疗方法方面论述近年来胰腺癌基因治疗状况。

　　1自杀基因治疗

　　自杀基因疗法又称基因定向酶药物前体疗法，是利用转基因的方法将药敏基因导入肿瘤细胞，从而增加肿瘤细胞对化疗的敏感性，使无毒的药物前体通过该基因表达的产物转化为对细胞有毒性作用的药物，干扰肿瘤细胞DNA的合成，抑制肿瘤细胞的生长，从而杀死肿瘤细胞，这种使肿瘤细胞自杀的基因称“自杀基因”。目前肿瘤基因治疗研究中常用的自杀基因主要为单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）基因，其治疗系统为HSV-TK/GCV，在体外及动物实验中均可抑制胰腺癌细胞的生长，因此在治疗研究中备受关注。

　　由于单纯疱疹病毒（HSV）1型或2型胸苷激酶（TK）基因编码的胸苷激酶能特异性地将核苷类似物等如羟甲基无环鸟苷（GCV）磷酸化，在胞内进一步代谢生成三磷酸GCV，可抑制细胞DNA聚合酶和作为DNA合成的终结者，使肿瘤细胞对GCV敏感性大大增高，从而明显提高对肿瘤细胞的杀伤率[1]。

　　Ritz等[2]在HSV-TK基因治疗肿瘤的体内实验中，观察到人端粒酶逆转录酶启动子调控的复制缺陷型腺病毒Ad-hTERT-TK具有良好的肿瘤细胞内特异性表达能力，它可以选择性在端粒酶阳性的肿瘤细胞中复制。Rosenfeld等[3]以腺病毒为载体介导HSV-TK在体外成功转染四株胰腺癌细胞系，观察到显著的原药转换作用和旁观者效应；体内实验结果表明转导TK基因的胰腺癌细胞成瘤时间延迟，给予原药GCV后肿瘤消退；给裸鼠腹腔内注入胰癌细胞诱发肿瘤形成，再注入表达HSV-TK基因的腺病毒载体，在注射GCV后，肿瘤明显退缩，伴有强大BSE出现。Block等[4]同样以腺病毒作为载体转导TK基因，在胰腺癌肝转移模型观察到HSV-TK/GCV有效抑制胰腺癌的肝转移，并利用重组腺病毒载体转染CD基因进入BALB-C小鼠和MC38肝转移模型小鼠，结果发现在肿瘤细胞中目的基因的表达水平比其他器官中的表达水平高上千倍。Yang等[5]将BxPC-3胰腺癌细胞注射到裸鼠胰尾，然后浓缩HSV-TK载体和GCV，结果HSV-TK治疗组转移性腹腔肿瘤明显低于对照组；在培养剂或是腹腔积液中转染HSV-TK载体，并用GCV处理所得结果无明显差别，提示浸浴腹水环境中载体能有效转导肿瘤细胞，腹腔内注射浓缩逆转录病毒HSV-TK载体是胰腺癌腹腔转移的有效治疗方法。在体内研究表明HSV-TK基因转化后继以GCV治疗的肿瘤逆转效应与肿瘤体积大小有关，在大肿瘤中，依赖于注射的病毒类型，因而联合应用ADV-TK+VPC-Rv-TK（VPC）继以4dGCV治疗可取得最佳效果。

　　2 免疫基因治疗

　　免疫基因治疗是将各类细胞因子基因转导入肿瘤或其他免疫效应细胞，使其在机体表达并分泌细胞因子，或利用其他基因增强肿瘤细胞的免疫原性和（或）免疫系统功能，加速肿瘤消退。如将细胞因子基因导入那些可定位于肿瘤的细胞，可在局部持续产生大量细胞因子，高效低毒地抗癌功能。或利用DNA重组技术，增强瘤细胞的免疫原性，使机体的免疫系统更好地发挥抗肿瘤作用。

　　GM-CSF基因是目前激活免疫系统的最有效基因之一，它能吸引免疫细胞聚集到表面存在抗原体的肿瘤细胞处。这些抗原体可以引导免疫系统找出并破坏残留在病人体内其他位置的癌细胞。

　　Jaffee等[6]使用分泌GM-CSF（粒-巨噬细胞集落刺激因子）的同种异体肿瘤细胞疫苗用于术后胰腺癌患者，患者平均生存期为13个月，较化疗放疗组（6～9个月）明显延长，证实这种疫苗对于胰腺腺癌患者是安全有效的。Yamaguchi[7]研究显示将鼠GM-CSF基因转导人胰腺癌细胞，体内实验结果表明GM-CSF基因表达产生显著的抑癌效应。

　　3 小结

　　胰腺癌的基因治疗目前仍处于试验研究阶段，尚无一项临床治疗方案获得批准。但基因治疗被认为是肿瘤治疗的最终方法，由于单一的自杀基因体系只能限制肿瘤的进一步生长和一定程度的肿瘤体积的减少，很难从根本上清除瘤块。要根除肿瘤，必须在限制肿瘤生长的基础上，依靠其他机制，如增强机体免疫能力来杀伤肿瘤细胞。因此可考虑从联合自杀基因和免疫基因治疗胰腺癌的思路入手，通过联合两者作用胰腺癌细胞，建立起单独和联合作用的动物模型，并通过动物实验来获得联合HSV-TK/GCV和GM-CSF进行胰腺癌治疗的一手资料，并对其疗效进行评估，为临床上应用联合基因疗法治疗胰腺癌提供实验及理论依据。

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　　基因治疗篇6

　　卵巢癌是女性生殖系统常见的三大肿瘤之一，仅次于宫颈癌和子宫内膜癌，但是因其早期无明显临床症状，致使等患者出现症状后再就医往往为时已晚，所以其死亡率是妇科恶性肿瘤的首位。近年来，随着分子生物学的发展, 基因治疗作为一种新的医学技术得以迅速发展，为肿瘤的治疗开创了新的领域。下面介绍几种具有应用前景的卵巢癌基因治疗策略。

　　1 诱导细胞凋亡基因疗法

　　诱导细胞凋亡基因疗法是一种通过选择性表达或导入某些外源基因诱导肿瘤细胞凋亡,增强对化疗的敏感性的有效基因疗法。Survivin是最近新发现的一种凋亡抑制基因,属于凋亡抑制蛋白(inhibition apop tosis p rotein, IAP) 家族的新成员，所有分化成熟的组织中均检测不到其表达，而大多数常见肿瘤组织内如肺癌、胃癌、宫颈癌、子宫内膜癌和卵巢癌中表达异常升高[1]，其与恶性肿瘤的发生、发展、血管生成、肿瘤的预后关系密切。

　　Wall等[2]应用细胞分子生物学技术通过抑制Survivin基因蛋白的磷酸化过程来提高肿瘤细胞的凋亡率,从而达到治疗肿瘤的目的。Survivin的多态序列中, 34位氨基酸为苏氨酸,是细胞周期素依赖蛋白激酶P34cdc22的磷酸化点,该位点的磷酸化对维持Survivin的凋亡抑制功能非常重要。以丙氨酸取代后的突变体(T34A)可以使凋亡抑制功能丧失,以此突变体转染Hela癌细胞,突变体的高度表达可以诱导转染细胞的自发性凋亡。经证实,新一类的抗癌药物GGTls中的GGTI-298 和GGTI-2166通过阻抑PBK/AKT和survivin途径来诱导顺铂敏感和耐药的人类卵巢上皮性癌细胞凋亡。在GGTI-298和GGTI-2166治疗后, PBK和AKT激酶水平降低,生存素表达明显减少。构成上活化的AKT2和/或生存素的异位表达能明显地复苏被GGTI-298诱导凋亡的人类癌细胞。其前的研究显示Akt调节生长因子诱导的生存素,而p53抑制生存素的表达。然而,构成上活化的AKT2却不能复苏GGTIs下调生存素,再进一步, GGTIs在野生型p53和p53不足的卵巢癌细胞株中均能抑制存活素的表达并诱导细胞程序性死亡。这些资料表明GGTI-298和GGTI -2166不依赖于p53而针对PBK/AKT和survivin 类似途径来诱导凋亡[3]。

　　2 抑制细胞信号传导通路疗法

　　研究表明,表皮生长因子受体(EGFR)在许多恶性肿瘤中呈高表达,并与肿瘤的发生、转移、预后等密切相关。Shih等在脑细胞瘤中发现了原癌基因neu，Padly等证实该癌基因编码的185kDa的蛋白质P185neu与EGFR的基因一样同CerbB具有同源序列，故将EGFR基因命名为CerbB-1（HER-1），neu基因命名为CerbB-2（HER-2）。近年来，又陆续发现了CerbB-3（HER-3）CerbB-4（HER-4），组成了EGFR家族。此家族成员均是具有酪氨酸蛋白激酶活性（TPK）的生长因子受体。

　　CerbB-2的过度表达与卵巢癌患者生存期、生存率及卵巢癌的耐药性的发生密切相关[4]。Herceptin作为人源性单克隆抗体, 与CerbB-2 的细胞外部分有高度亲和力, 能靶向结合于表达CerbB-2的卵巢癌细胞, 阻断配体介导的细胞信号传导，影响上皮细胞生长，也可通过诱导抗体介导的细胞毒作用杀伤肿瘤细胞。Mauricio等通过将Herceptin 与肿瘤坏死因子联合应用于阳性的CerbB-2卵巢癌细胞系,发现Herceptin能通过抑制酪氨酸激酶来增强肿瘤坏死因子引起的细胞凋亡效应。临床应用Herceptin治疗CerbB-2阳性卵巢癌已取得良好的治疗效果。

　　3 多重耐药基因疗法

　　卵巢癌化疗失败的根本原因是产生化疗药物耐药性。研究发现, 在对顺铂、阿霉素耐药的卵巢癌细胞株中72%的细胞出现了MDR1 基因的过度表达。抑制MDR1 基因的表达, 不仅使细胞内化疗药物浓度增加，也增强细胞对药物的敏感性[5]。

　　卵巢癌多细胞球体多药耐药糖蛋白Pgp表达的升高与细胞周期素依赖性激酶抑制剂p27呈正相关[6]。p27可使细胞周期蛋白E和细胞周期依赖性蛋白激酶2的活性受到抑制，使细胞周期停滞在G1期，对细胞周期进行负调控。Xing[7]将p27ASON经脂质体包裹转染人卵巢癌细胞A2780、CAOV3，用锥虫蓝排除实验法和流式细胞仪检测细胞凋亡率来分别比较单层细胞p27ASON转染前后培养的多细胞球体的紫杉醇敏感性，结果表明，p27ASON可以下调p27的表达，防止细胞间黏附并促进细胞增殖而下调Pgp的表达，从而一定程度逆转卵巢癌对紫杉醇化疗的耐药性。

　　4 突变补偿疗法

　　突变补偿是消除主要致肿瘤基因,取代改变的肿瘤抑制基因,或干扰某些生长因子及其受体的功能。将特异性基因导入肿瘤细胞,纠正肿瘤细胞的基因缺陷,使细胞周期停滞、诱导细胞程序性死亡或使肿瘤细胞对化疗和放疗敏感。编码人类免疫缺陷腺病毒与野生型P53 (SCH58500)重组体腹膜注射有良好疗效,既安全又可耐受,并且联合铂类化疗在复发性卵巢癌患者有更好的效果。

　　目前研究最为深入的抑癌基因为P53。在30%～79%卵巢癌中出现了P53异常。实验证明野生型P53基因转染到有P53 基因突变的卵巢癌细胞,既抑制肿瘤的生长,又具有旁观者效应[2]。2005年Ad-P53基因治疗获准进行Ⅲ期临床试验，现我国重组人P53腺病毒（今又生）广泛应用于临床卵巢癌的治疗并取得了良好的治疗效果。

　　5 反义基因疗法

　　它是利用反义技术设计与异常激活有害基因及其mRNA互补的反义寡核苷酸,特异性封闭这些基因使其不表达或低表达,从而达到减少基因产物,抑制细胞恶变的作用。由于该疗法是从核酸角度着眼,故而是一种最根本、最有前途的治疗方法。Fei R[8]针对CerbB-2基因和c-myc基因,联合抗基因治疗,靶向CerbB-2和c-myc,抑制卵巢癌细胞COC(1)细胞增殖和CerbB-2及c-myc基因表达。c-raf-1可被ras基因激活之外还存在独立的激活途径:可被酪氨酸激酶src与JAK1、蛋白激酶Cα、神经酰胺活化的蛋白激酶等激活。因而c-raf-1是EGFR介导的信号转导系统上的关系基因之一[9],c-raf-1是理想的基因治疗靶点。CerbB-2 ASODN 与CerbB-2 mRNA 5’端编码区互补,Craf-1 ASODN 与Craf-1 mRNA 3’端非编码区互补。Pirollo等针对raf-1、H-ras、CerbB-2基因设计合成的硫代ASO,不仅能抑制卵巢癌细胞生长,而且能增加对放疗的敏感性。

　　Zaffaroni等[10]在体外和体内的研究中利用针对Survivin的反义寡苷酸治疗肿瘤,发现肿瘤的生长速度减慢,并且可以提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,如紫杉醇、顺铂和鬼臼乙叉甙及对照射和免疫治疗的敏感性。研究表明靶向抑制survivin基因表达在肿瘤治疗中有巨大的潜在价值。

　　等针对端粒酶hTERT设计合成反义脱氧寡核苷酸,对卵巢癌细胞系SKOV3及ES-2进行反义基因治疗,能通过抑制端粒酶活性,增强细胞周期阻滞及诱导细胞凋亡等抑制卵巢癌细胞生长,与CDDP合用能增强对癌细胞的杀伤作用。

　　基因治疗为卵巢癌的治疗展现了一个极有希望的前景。学者们正针对卵巢癌的基因治疗中存在的一些问题,研究载体改良,增强目的基因靶向性等,迎接根治卵巢癌的挑战。相信随着人类基因组计划的完成,分子生物学等学科的进一步深入发展,人类将开辟卵巢癌基因治疗的新纪元。

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　　基因治疗篇7

　　关键词：RNA干扰；小干扰RNA；基因沉默；肿瘤

　　中图分类号：Q522文献标识码：A文章编号：1672-979X(2009)01-0054-04

　　RNA Interference and Tumor Gene Therapy

　　JU Ji-yu, LI Zai-lian

　　(Department of Immunology, Weifang Medical University; Key Laboratory of Immunology in Universities of Shandong, Weifang 261042, China)

　　Abstract：RNA interference is a mechanism for controlling normal gene expression, which has been employed as a potential technology for a wide range of disorders such as tumors, infectious diseases and metabolic disorders. This paper reviews the discovery, mechanism of RNA interference and its application in tumor diagnosis and prevention, as well as some challenges.

　　Key words：RNA interference; small interfering RNA; gene silencing; tumor

　　基因治疗是一种特异性的治疗方法，可用在疾病早期。基因治疗一般是通过一定的技术把遗传物质转入细胞并永久改变细胞表型，例如通过替换变异的肿瘤抑制基因（如p53）、抑制基因转录、引入能编码治疗物质（如scFv）的新基因或者使特定的靶基因沉默（如反义技术）等。RNA干扰（RNA interference，RNAi）是控制基因表达的特异有效方法。近年RNAi已成为研究根据基因功能合理设计药物的重要工具。本文现简要介绍RNAi的发展史和近来在肿瘤基因治疗中的应用。

　　1RNAi的发现及作用特点

　　1.1概述

　　RNAi是指小分子双链RNA抑制同源序列基因的表达，是生物进化过程中保留下来的机制。像反义技术一样，RNAi可以特异的抑制基因的表达。RNAi最早在秀丽新小杆线虫（C. elegans）中发现可以抵御外来基因的入侵。此后陆续在昆虫、植物、真菌和脊椎动物中也发现了该机制。

　　1.2干扰RNA的分类及作用特点

　　目前，已知具有功能作用的小分子干扰RNA主要包括小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）、微小RNA（microRNA，miRNA）和Piwi-interacting RNA（piRNA）3类。

　　1.2.1siRNA的发现及作用机制1993年学者们发现秀丽新小杆线虫中微小RNA和反义互补RNA抑制基因的表达。1995年Guo等[1]用反义RNA技术阻断秀丽新小杆线虫中par-1基因表达时发现，正义RNA和反义RNA均能阻抑基因功能表达，且两者的作用是相互独立的，机制也各不相同。1998年Fire等[2]首次发现双链RNA（dsRNA）能够特异性地抑制秀丽新小杆线虫的纹状肌细胞unc-22基因表达，dsRNA引起的基因沉默效应要比单用反义RNA或正义RNA强十几倍。注入秀丽新小杆线虫的性腺后，在其第一子代中也诱导出了同样基因的抑制现象，表明RNAi有可遗传性。此现象称为RNAi。因为RNAi作用发生在转录后水平，又称为转录后基因沉默（PTGS）。1999年Hamilton等[3]在植物基因沉默研究中首次发现，21~25 核苷酸（nt）的dsRNA出现对转基因导致基因沉默十分重要，同时指出RNAi作用是由部分纯化的核酸酶中所含siRNA介导的。2000年首次在果蝇中发现，通过核糖核酸酶可将长的dsRNA处理为21～23 nt的短片段[4]。2001年，首次报道了哺乳动物细胞中也有RNAi。2002年证明了用短的发夹结构RNA（shRNA）在哺乳动物细胞中可以诱导特异性的基因沉默[5]。2003年首次用RNAi技术对模型动物进行了治疗研究[6]。

　　哺乳动物体内RNAi的作用机制与植物及果蝇等RNAi的机制相似，体外研究证实，RNAi是一个ATP依赖性的过程。首先，dsRNA通过细胞膜进入细胞，在胞质内的Dicer（一种序列特异性的核酸内切酶，属RNA酶家族III成员）的作用下，分解成21～22 nt；3’端带有2～3个末端突出碱基的dsRNA分子，这种小的dsRNA分子称为siRNA[7]。siRNA与Agonaute2等蛋白酶结合，形成由RNA介导的沉默复合物（RNA-induced silenceing complex，RISC）。RISC大约500 kb，在ATP供能的条件下，RISC可以把其携带的双链siRNA分子变成单链siRNA。含单链siRNA的RISC有活性，可与目的mRNA结合，导致其断裂、降解，从而导致目的基因沉默[8]。

　　1.2.2miRNA的发现和作用特点miRNA是一种内源性的非编码RNA（noncoding RNA，ncRNA），由大约2l～23 nt组成单链RNA分子。miRNAs广泛存在于植物、线虫和人类细胞中，可能是一类进化上保守的、在生命中起重要调控作用的分子[9]。它们能有效地抑制相关蛋白质的合成，导致靶mRNA降解，或者以其他形式的调节机制抑制靶基因表达，产生基因沉默。Lin-4和Let-7是最早在秀丽新小杆线虫中发现的能时序性地调控胚胎后期发育的基因，这些基因编码一类长度约21 nt的小分子短暂RNA（small temporal RNA，stRNA）[10] 。后来，又相继在线虫、果蝇、HeLa细胞、拟南芥和水稻等许多真核模式生物和细胞中找到了几百个相似的小分子RNA，将其统称为miRNA，Lin-4和Let-7基因编码的stRNA则认为是miRNA的代表[11]。

　　与siRNA一样，miRNA也可以引发RNAi现象。在miRNA生成过程中，编码miRNA的基因首先转录产生几百至几千核苷酸的初级产物（pri-miRNA），在核内被核酸内切酶Drosha酶切割成约70 nt的发夹状前体（pre-miRNA）。pre-miRNA在Ran-GTP和转运蛋白Exportin-5的协同作用下转运出细胞核，经Dicer酶切割成约22 nt的成熟miRNA。成熟miRNA可通过两种机制调控靶基因表达：一种是和siRNA一样，与靶mRNA结合，促进其降解；另一种是结合到靶mRNA的3＇UTR部位抑制其翻译。如果miRNA与靶序列互补配对高则可能切割mRNA，配对低的可能只是抑制[12]。

　　1.2.3piRNA的发现2006年由4个独立的研究小组[13，14]在小鼠实验中分离得到一种能与piwi蛋白相互作用的小分子RNA，称为piRNA，由30 nt组成。piwi基因为Argonaute基因家族成员之一，科学家们推测，这类小分子RNA可能与动物体精子的发育和维持功能相关。实验结果表明，每个精母细胞或完整的精子细胞中大约含有100万个piRNA[13]。同时，经过克隆也观察到大量26～31 nt的小分子RNA。根据RNA的长度大小，piRNA可分为2种：第1种长29～31 nt，可以和MIWI蛋白连接；第2种长26～28 nt，可以率先与MILI蛋白结合。在成年小鼠体内，第1种比第2种含量高。但由于某些piRNA探针可以检测出30 nt和26 nt区带，所以2种piRNA均可形成相同的分化过程。利用cDNA末端快速扩增技术确定它们的5’端相同，而3’端相差2 nt。这2种piRNA是否发挥不同的作用有待进一步研究。

　　2在肿瘤学中的应用

　　最初RNAi在肿瘤学的应用主要是针对突变的肿瘤基因、增生、转位和病毒基因，阐明其功能以及和其它基因之间的相互联系。应用RNAi技术探索各种基因的功能及相互作用为筛选新的药物靶基因提供了便利。RNAi已用来加强现存药物如伊马替尼（imatinib）和雷帕霉素的作用，这是通过沉默抗性相关基因实现的[15]。当用siRNA抑制Prkdc基因（与DNA修复有关的基因）后，人成纤维细胞对射线的敏感性明显增强[16]。抗凋亡基因survivin被认为是诊断和治疗肿瘤的一个很有价值的基因，是RNAi治疗的候选基因[17]。融合癌基因BCR/ABL在人白血病细胞系中成功地被人工合成的siRNA抑制，不但减少了相应基因蛋白的表达，而且诱导靶细胞发生凋亡[18]。用RNAi方法抑制融合基因ALM1/MTG8可增强细胞因子驱动的淋巴母细胞在骨髓中分化。有趣的是，癌基因转录被抑制可以长达5 d。相似的情况是，用RNAi方法抑制培养的EWS/Fil肉瘤细胞癌基因表达可以使细胞生长减慢长达3周[19]。现在已有多种基因用于RNAi治疗肿瘤的研究，如bcl-2、fas、k-ras、myc、p53等。这一方法的前景依赖于siRNA或shRNA能否使癌基因转录沉默并带来相应的生物学效应[20]。

　　3RNAi所面临的问题

　　RNAi用于临床肿瘤治疗要解决两个问题，首先如何把有效的干扰RNA带到肿瘤细胞内，对特异性靶基因产生特异性的抑制作用；其次，如何避免RNAi带来的副作用。

　　3.1载体问题

　　以前的研究表明，血流中的siRNA或DNA很难通过细胞膜屏障和逃避内体溶酶体的降解作用[21]。为了提高siRNA的运载效率，学者们发展了很多病毒和非病毒运载体系，大大提高了运载siRNA的效率。如基于逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒的运载系统在体内外均实现了RNAi介导的基因沉默[22]。腺病毒由于基因在细胞内表达短暂，应用受到很大限制。逆转录病毒由于其复制过程中要经过DNA中间体过程，能把前病毒整合到宿主细胞基因组上，从而实现稳定表达。用表达siRNA的逆转录病毒加上一些调控元件可实现组织特异性基因沉默[23]。然而，逆转录病毒基因治疗的主要问题是插入变异的问题。腺相关病毒载体可以实现外源基因宿主基因组的定点整合，也可以实现外源基因的稳定表达，但纯化仍然是需要突破的一道障碍[24]。除了病毒载体以外，非病毒载体也用于肿瘤的基因治疗。如阳离子脂质体或聚乙醇胺均用作siRNA运载体。这些载体均已用作体内siRNA实验并在静脉给药或鼻内给药后实现了目的基因沉默。但是，这些载体在体内均表现出毒性和激发机体免疫应答的能力[25]。因此，需要改进这些载体和进一步寻找更加安全的载体。另外一种值得注意的载体是壳聚糖。壳聚糖是一种阳离子多糖，已广泛用于药物的运载，特别是DNA介导的基因治疗药物的运载。壳聚糖的胺带有正电荷，可与核酸上的磷酸形成聚合电解质络合物。而且，这种质子化的胺还有利于复合物与细胞膜结合并被内吞入细胞。现已证明，壳聚糖/siRNA微粒可在体内外介导基因沉默。而且，已证明壳聚糖是生物相容的、非致炎、非毒、可降解的材料。因此，壳聚糖/siRNA运载系统可能具有良好的发展前景[22]。

　　3.2脱靶效应

　　如果考虑将siRNA作为治疗药物，须考虑它的序列特异性和评估它的脱靶效应的危险性。例如，必需保证只有目的基因mRNA被降解而其它必需基因不受影响。siRNA产生脱靶效应主要基于以下3个方面：（1）由于shRNA和siRNA均含有dsRNA序列，因此它们可能会诱发机体的天然免疫应答，如干扰素应答。（2）转染或表达的siRNA可能会产生一些非特异性效应。（3）尽管设计的siRNA与目的基因互补，但也可能和非靶基因mRNA互补[26]。

　　研究表明，dsRNA的长度大于30 bp可以导致非特异性抑制基因表达，大部分是由于激活了dsRNA依赖性的蛋白激酶PRK和随后的磷酸化以及灭活eIF2a 所引起。RNA的长度（siRNA或shRNA）与此有关，即使11 bp的siRNA片段也可诱导微弱的干扰素应答。有些措施可以减轻干扰素应答，如减少转染siRNA的量，也可通过检测干扰素应答基因如寡腺苷合酶-1的方式预防干扰素应答发生[27]。除了干扰素应答外，另一个脱靶效应就是由于外源siRNA的导入使细胞内RNAi机制饱和，从而抑制内源性RNAi（miRNA）发挥作用，产生非特异性的毒性反应。这就要求在进行外源siRNA转染时尽可能减少外源siRNA的用量[27]。最近用基因芯片进行的研究表明，用RNAi方法抑制慢性髓性白血病细胞中BCR-ABL融合蛋白表达可启动细胞内其它沉默的癌基因、抗凋亡基因和细胞因子的表达[28]。因此，RNAi技术在真正应用到临床之前，需要更加严格的评估。

　　4展望

　　把RNAi技术从研究工具转变为治疗手段所遇到的主要问题是载体系统。我们需要更加特异、有效的运载系统，如可以特异性肿瘤靶向的载体或者带有肿瘤细胞特异性启动子的载体系统。由于RNAi主要与细胞胞浆成分作用，这是优于其它基因治疗方法之处。尽管摄取效率和稳定性是建立RNAi治疗方法所遇到的主要问题，但这一领域的飞速发展表明，也许在几年之后，我们就能找到较好的解决办法。

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　　基因治疗篇8

　　但是其在医学上的价值人类依旧不能过于乐观。

　　一直备受人关注的人类基因图谱最近再次迎来了“喜讯”：由中、美、英等国共同发起的大型国际合作项目“千人基因组计划”最新研究成果10月31日在《自然》在线发表。该协作组公布了1092个高分辨率人类基因组遗传变异整合图谱。

　　基因治疗采取极为谨慎态度

　　“千人基因组计划”从实施到现在，已经整整5年时间。

　　不过在中国科学院基因研究所医学博士甄二真看来，尽管在科学研究上，这样的测序有着比较大的价值和意义，但是实际应用到人类的健康和疾病治疗，依旧还有很长的路要走。

　　“就算能够将导致一些疾病发生的基因片段或者特定位置找出来，现在人类对它们实际上还是无能为力。”甄二真说。

　　随着基因科学和技术的发展，目前国内外的很多实验室已经可以通过敲除、关闭、替换具体基因片段或者特定位置的方式对老鼠等一些实验动物进行部分遗传性疾病的治疗实验，但是，这样的实验目前依旧停留在实验室阶段。

　　“基因领域中有很多东西对人类而言还十分陌生，尽管人类现在已经了解到人体的一些基因片段或者特定位置的变异是某类疾病的缘由，但是将其敲除、关闭或者替换，会出现什么样的结果，存在很大的不确定性。因此人类当前实施这样的手术在安全性上得不到充分的保证。”甄二真说。

　　国家人类基因组南方研究中心研究员韩泽广近些年来一直在基因方向上进行肝癌的研究，但现在还没有可靠的方法改造突变基因来治疗癌症。

　　韩泽广说，因为伦理上的一些风险和争议，目前世界各国对于人类基因工程治病一直采取的都是一种极为审慎的态度。

　　基因治疗存在炒作质疑

　　人类基因组计划从1990年正式启动、先后共有美国、英国、法国、德国、日本和中国共6个国家的众多科学家共同参与，其预算高达30亿美元。但是，最近国内外不少生物学家及医学专家也都开始质疑基因治疗技术的炒作。

　　2000年，美国总统克林顿与美两大人体基因研究组织的科学家在白宫联合宣布：有史以来的第一个人类基因组草图完成。

　　“利用这个新知，人类将获得巨大利益。它能彻底改变我们对大多数疾病的诊断、预防和治疗的方式。”克林顿当时如是说。另外他还预言，未来几年人类通过基因手段有望治愈阿尔茨海默症、帕金森氏症、糖尿病和癌症等。但是时至今日，这些疾病依旧还在严重威胁着人类的健康，人类基因图谱的公布对这些疾病的治疗并没有发挥实质性的作用。

　　广州中医药大学教授曾庆平认为，尽管现在高分辨率的人类基因组遗传变异整合图谱已经公布，但是其在医学上的价值人类依旧不能过于乐观。

　　曾庆平说，如果将人类基因组计划与千人基因组计划作一个比较，那么可以说人类基因组计划的完成是印刷了一部生命的“天书”，而千人基因组计划的完成就是把这部“天书”重印或再版一次，只不过其间作过重大修改。形象地说，这些基因图谱上的“基因序列恰如一本火星文小说，没有几个地球人能读懂”，另外现在将基因变异通译成疾病风险的“字典”也还没有完全编撰出来。

　　警惕“基因疗法”骗局

　　甄二真说，这些年来，更为严重的是，一些人开始借着全球人类基因组计划和千人基因组计划研究成果对患者进行忽悠和欺骗。

　　目前在国内，有不少医院都在利用“基因疗法”或“基因工程”治病。有的医院称自己能进行“基因疗法”，能以最新的科技治疗乙肝病人；有广告称，某医疗机构从研究人体基因入手，根据破译的人体糖尿病基因密码，独创了糖尿病“基因疗法”，成功研制出某种新药。甚至一些皮肤病医院也都开始打着“基因疗法”的招牌。

　　甄二真告诉记者，目前国内所有的医疗机构声称的“基因疗法”及“基因工程”根本就不靠谱，他们有很多人甚至自己也不知道“基因工程”是怎么回事，所谓的“基因疗法”也更不可靠。

　　“其实，现在进行宣传的大多是小型医院和民营医院。真正有实力的三甲医院几乎看不到这样的宣传。”甄二真说目前在世界上，还没有一个国家有过基因工程成功治病的案例，美国1999年曾经临床尝试利用基因操作的方式对一个囊肿性纤维化遗传病患者进行治疗，但是在治疗过程中，患者却意外发生了死亡。

　　“现在国内一些声称进行基因治疗的，他们的说法都比较模糊，只是患者不了解而已。” 甄二真说。

　　近些年，利用人类基因图谱，国内外有公司已经开始开发贮存个人基因组序列数据的“健康风险身份证”，在未来，也许我们只要花上不到万元甚至是更少的费用就可以拥有一张自己的“健康风险身份证”，通过该证，我们就可以了解到我们将来患某种疾病的风险，并提前实施积极的预防。

　　在曾庆平看来，开发者开发这样的“身份证”主要是出于巨大的商业利益考虑，用它来诊病或治病还不够，因为基因测序工作者根据基因图谱预测疾病风险只能把将来患病的可能性告诉被测试者，至于发不发病还说不定，这还取决于基因与环境的相互作用。