【原】血液RT-qPCR内参怎么选？没人知道

　　

　　常记溪亭日暮，沉醉不知归路。

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　　前言

　　无言！

　　01 精华

　　

　　02 

　　首先，通过系统的文献检索，选择了14个候选参考基因。使用人类多阶段人类肝细胞癌（HCC）转录组数据（数据集GSE114564）评估这些基因（ACTB、B2M、GAPDH、GUSB、HMBS、HPRT1、PGK1、PPIA、RPLP0、RPL13A、SDHA、TBP、TFRC和YWHAZ）的表达水平，该数据集包括正常肝脏（n=15）、慢性肝炎（n=20）、肝硬化（n=10）以及早期（n=18）和晚期HCC（n=45）。从14个选定的基因中，使用RT-qPCR在40个组织（20个配对健康组织和20个HCC患者组织）和40个血液样本（20个健康对照和20个肝癌患者样本）中进一步评估了在所有肝病状态下表达水平稳定的5个基因（ACTB、GAPDH、HMBS、PPIA和RPLP0）。

　　使用BestKeeper统计算法来识别最稳定的参考基因，其中HMBS在HCC组织和血液样本中都是最稳定的。因此，本研究的结果表明，HMBS是HCC相关研究中相对定量RT-qPCR技术标准化的一个有前途的参考基因。

　　Ahn HR, Baek GO, Yoon MG, et al. HMBS is the most suitable reference gene for RT-qPCR in human HCC tissues and blood samples. Oncol Lett. 2021;22(5):791. doi:10.3892/ol.2021.13052

　　03 

　　结果：由ACTB和PPIB组成的标准化因子可以对不同胎龄组的新生儿样本进行比较表达分析。当比较早产和足月新生儿和成人的样本时，由GAPDH和PPIB或ACTB和GAPDH组成的归一化因子是合适的。然而，除RPLP0外，所有候选参考基因都表现出显著的组间基因表达差异和较高的基因表达，这导致了较小但具有统计学意义的系统偏差。RNA-seq数据的系统分析揭示了具有潜在优越稳定性的新的参考基因候选者。

　　结论：目前的研究确定了合适的标准化因子，并建议使用额外的单基因RPLP0来避免系统性偏倚。这种组合不仅可以在不同胎龄的新生儿之间进行比较分析，还可以在新生儿和成年人之间进行比较研究，因为它有助于对发育基因表达变化进行更详细的研究。软件算法的使用并没有防止意外的系统性偏见。

　　Hieronymus K, Dorschner B, Schulze F, et al. Validation of reference genes for whole blood gene expression analysis in cord blood of preterm and full-term neonates and peripheral blood of healthy adults. BMC Genomics. 2021;22(1):489. Published 2021 Jun 30. doi:10.1186/s12864-021-07801-0

　　04

　　方法：从526名2至78岁的男性和女性样本中检测全基因组Affymetrix Human 2.0 Plus阵列，包括对照受试者和患有抽动秽语综合征、中风、偏头痛、肌营养不良和自闭症的患者。确定了具有广泛表达水平的前100个最稳定表达的基因。为了验证最佳候选基因，我们对10个基因（TRAP1、DECR1、FPGS、FARP1、MAPRE2、PEX16、GINS2、CRY2、CSNK1G2和A4GALT）、4个常用参考基因（GAPDH、ACTB、B2M和HMBS）和PPIB的子集进行了定量RT-PCR，这些基因先前被报道在血液中稳定表达。使用GeNorm和NormFinder算法进行表达稳定性和排名分析。

　　结果：根据参考基因的表达稳定性对其进行排序，使用GeNorm计算的标准化所需的最小基因数表明，在人类全血RNA表达研究中，精确标准化所需要的最少、最稳定表达的基因是TRAP1、FPGS、DECR1和PPIB的组合。我们通过使用替代算法（NormFinder）确认了最佳候选控制基因的排名。

　　结论：本研究中鉴定的参考基因在患有多种疾病的性别和2至78岁的人类全血中稳定表达。重要的是，它们在细胞内也具有不同的功能，因此应该相互独立地表达。这些基因应作为标准化基因，用于人类生理、代谢和疾病的微阵列和RT-PCR全血研究。

　　Stamova BS, Apperson M, Walker WL, et al. Identification and validation of suitable endogenous reference genes for gene expression studies in human peripheral blood. BMC Med Genomics. 2009;2:49. Published 2009 Aug 5. doi:10.1186/1755-8794-2-49

　　05 

　　白细胞动态影响全血中内参基因的稳定性:数据驱动的qRT-PCR标准化是测量转录生物标志物的有力选择。

　　O'Connell GC, Treadway MB, Petrone AB, et al. Leukocyte Dynamics Influence Reference Gene Stability in Whole Blood: Data-Driven qRT-PCR Normalization Is a Robust Alternative for Measurement of Transcriptional Biomarkers. Lab Med. 2017;48(4):346-356. doi:10.1093/labmed/lmx035

　　06 

　　在此，我们旨在评估先前报道在几种疾病患者的外周血中稳定表达的五个管家基因的表达行为——肽基丙基异构酶B（PPIB）、TNF受体相关蛋白1（TRAP1）、β-2-微球蛋白（B2M）、2,4-二烯基-CoA还原酶1（DECR1）和folyl聚谷氨酸合成酶（FPGS）。这五个基因的表达水平通过qPCR在来自MJD受试者（滑行前和患者）和匹配对照的血液中进行评估。虽然本文研究的所有管家基因都在我们的样本组中稳定表达，但NormFinder和BestKeeper显示TRAP1是最稳定的基因。因此，我们得出结论，这些基因中的任何一个都可以在未来的qPCR研究中用作参考基因，该研究使用了MJD受试者的血液样本。

　　Ferreira AF, Raposo M, Vasconcelos J, Costa MDC, Lima M. Selection of Reference Genes for Normalization of Gene Expression Data in Blood of Machado-Joseph Disease/Spinocerebellar Ataxia Type 3 (MJD/SCA3) Subjects. J Mol Neurosci. 2019;69(3):450-455. doi:10.1007/s12031-019-01374-0

　　07 

　　研究结果：文献综述和对我们未发表的微阵列数据的分析被用于将候选参考基因库缩小到6个。我们分析了来自Tempus管和细胞制备管（CPT）的全血RNA——从46名受试者中收集的PBMC RNA，并使用geNorm和NormFinder算法来选择最稳定的参考基因。磷酸甘油酸激酶1（PGK1）是全血和PBMC RNA的最佳标准化基因之一，然而，两种样本类型的额外基因不同；核糖体蛋白大，P0（RPLP0）用于PBMC RNA，PPIB（PPIB）用于全血RNA。我们还表明，当使用最稳定的候选基因时，使用单个参考基因就足以进行标准化。

　　结论：我们已经确定PGK1是一个稳定的参考基因，可用于全血RNA和来自PBMC的RNA。当选择稳定的基因时，可以使用单个基因进行正常化，而不是两个或三个。最佳标准化将提高PBMC RNA的结果与全血RNA的结果进行比较的能力，并可能允许比较通过不同方法收集和处理的血液RNA的基因表达结果，以发现生物标志物。这项研究的结果应该有助于利用血液RNA作为定量基因表达测量的靶点进行大规模分子流行病学研究。

　　Falkenberg VR, Whistler T, Murray JR, Unger ER, Rajeevan MS. Identification of Phosphoglycerate Kinase 1 (PGK1) as a reference gene for quantitative gene expression measurements in human blood RNA. BMC Res Notes. 2011;4:324. Published 2011 Sep 6. doi:10.1186/1756-0500-4-324

　　08 

　　背景：定量聚合酶链式反应（qPCR）分析是研究外周血单核细胞（PBMC）研究领域中mRNA表达的一种精确有效的方法。然而，使用合适的参考基因进行数据归一化对于获得有意义和可重复的结果至关重要。本研究旨在为慢性乙型肝炎（CHB）患者PBMC的进一步研究确定最大的参考基因。

　　方法：我们评估了四种常用参考基因（β-肌动蛋白、β-微管蛋白、18S rRNA、GAPDH）在慢性乙型肝炎患者PBMC中的表达稳定性。然后我们使用geNorm、BestKeeper和Normfinder来评估这些参考基因的表达稳定性。

　　结果：除了β-肌动蛋白外，所有四个基因在患者组和对照组之间都没有显示出显著差异，因此在所讨论的实验设置中，β-肌动蛋白不应被用作正常化基因。GAPDH和β-微管蛋白根据三种算法组成了最佳的一对参考基因，用于未来CHB患者PBMC基因表达的标准化研究。

　　结论：GAPDH和β-微管蛋白（beta-tubulin）是本研究RT-qPCR分析中两个参考基因的最佳组合。

　　Zhang H, Guan ZS, Guan SH, et al. Identification of Suitable Candidate Reference Genes for Gene Expression Analysis by RT-qPCR in Peripheral Blood Mononuclear Cells of CHB Patients. Clin Lab. 2016;62(1-2):227-234. doi:10.7754/clin.lab.2015.150805

　　09 

　　定量实时RT-PCR是一种在mRNA水平上测量基因表达的非常强大的技术。为了比较不同实验或临床条件下的mRNA表达，靶基因的表达必须标准化为适当的内标，该内标通常是管家基因。在我们的研究中，我们在健康志愿者和患有炎症性疾病的患者的外周全血中测试了几种管家基因。对91个样本的首次分析表明，编码亲环素B蛋白的肽基丙基异构酶B（PPIB）的mRNA表达比通常被选为内标的β-肌动蛋白和甘油醛-3-磷酸脱氢酶更稳定。在测试的三个基因中，β-肌动蛋白表现出最高的样本间表达变异。另外214个样本进一步证实了PPIB mRNA表达的恒定性。总之，我们发现PPIB与β-肌动蛋白和甘油醛-3-磷酸脱氢酶相比，是人类外周血中合适的管家基因（housekeeping gene）。

　　Pachot A, Blond JL, Mougin B, Miossec P. Peptidylpropyl isomerase B (PPIB): a suitable reference gene for mRNA quantification in peripheral whole blood. J Biotechnol. 2004;114(1-2):121-124. doi:10.1016/j.jbiotec.2004.07.001

　　               杨柳岸，晓风残月。

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