HIF1α抑制可促进来氟米特-AHR-CRP信号传导，减轻CRP异常类风湿性关节

　　我们回顾了250例RA患者使用来氟米特治疗的X线资料(补充表)。1)。来氟米特能明显减轻130例RA患者的进行性骨侵蚀，但对其余120例RA患者疗效有限(图1)。1A，b)。然而，PBE?和PBE+患者对DHODH活性的抑制和免疫细胞(T、B淋巴细胞和巨噬细胞)的增殖具有可比性。免疫细胞和滑膜成纤维细胞产生的细胞因子包括白细胞介素-17(IL-17)、白细胞介素-6(IL-6)和核因子受体激活因子κ-Β配体(RANKL)。18两组间也无明显差异(图二)。1C和补充图。1A)。我们测定了PBE阳性患者血清中类风湿因子(IGM、IGG和IGA)、CRP、抗环瓜氨酸肽(抗CCP)抗体和血沉(ESR)与血清基线血指标的相关性。19..血清CRP对PBE+RA患者具有较高的特异性和敏感性，诊断准确率在92%以上。1D，补充图。1B和补充表2)。PBE阳性患者血清CRP水平较高。H)和骨吸收标记物(抗酒石酸酸性磷酸酶5b，TRAP5b)20，而PBE?患者的CRP相对较低。L)和TRAP5b(图1)。1E)。在来氟米特治疗过程中，CRP和TRAP5b水平均受到显著抑制。L但在CRP中没有H病人(如图所示)1F)。血清CRP，而不是其他指标，与CRP中的TRAP5b呈正相关。HRA患者(图1.1g和补充图。1C)。CRP在破骨发生中的作用是构象性和RANKL依赖性.循环的天然CRP由五个完全相同的亚基组成，进入局部病变后分解为单体构象。21..单体CRP在无RANKL的情况下促进破骨细胞分化，但通过中和RANKL抑制RANKL诱导的破骨细胞分化。11..我们量化了RA患者滑膜液中CRP和RANKL的基线水平。单体CRP的摩尔浓度是RANKL的10，000倍以上。L和CRPHRA患者(附图)1D)，提示两组RA患者的CRP单体足以中和RANKL，多余的游离单体CRP将主导RA的破骨细胞活动。

　　我们建立了CIA大鼠模型，并给CIA大鼠注射来氟米特28天(补充图)。2A)。根据微CT分析，将CIA大鼠分为PBE+组和PBE?亚组。2A)。经来氟米特治疗后，我们观察到PBE+大鼠(而非?大鼠)的骨微结构逐渐恶化，骨量减少。2A和补充图。2B)。抑制DHODH活性和免疫细胞(T、B淋巴细胞和巨噬细胞)增殖以及细胞因子(IL-17、IL-6和RANKL)的降低与PBE?和PBE+大鼠相似(图1)。2B和补充图。2C)。来氟米特对PBE、?和PBE+大鼠滑膜增生均有抑制作用(附图)。二维空间)。PBE+大鼠血清CRP水平升高H，91.24±10.12毫克升?1)和TRAP5b，而PBE?患者的CRP相对较低。L，52.45±7.54mg L?1)和TRAP5b(图1)。2C)。来氟米特降低CRP和TRAP5b水平，抑制CRP骨吸收和破骨活性L大鼠而不是CRPH老鼠(图1.2D，e，补充图。二维空间)。我们研究了两组RA个体之间不同CRP水平的机制。IL-6轴是肝细胞CRP表达的主要诱导剂。22..我们发现血清IL-6与CRP相当。L和CRPH老鼠(附图)2C肝脏IL-6受体(IL-6R)在两组间差异表达(补充图)。2E).

　　CRPHCIA大鼠关节内注射PBS(Vehicle)、IgG对照或抗CRP抗体(补充图).3A)。抗CRP抗体可减轻CRP骨侵蚀和骨吸收，防止CRP骨丢失。H大鼠与IgG或PBS(补充图)比较。3B-d)。我们还使用一种基于rna干扰的策略来抑制crp的肝crp表达。H中情局的老鼠。脂质纳米粒(Lnps)已被证实为体内siRNAs的肝靶向传递系统。23,24..CRPHCIA大鼠静脉注射pbs(Vehicle)、LNPs、LNPs包封阴性对照siRNA(LNPs-NC siRNA)或LNPs包裹阴性siRNA(LNPs-NC siRNA)。CRPsiRNA(LNPS-CRP siRNA)(补充图)。3E)。约90%的lnps-siRNA在肝脏中发现(补充表)。3)。LNPs-CRPsiRNA降低肝细胞CRP表达，减轻骨侵蚀和骨吸收，防止CRP骨丢失H大鼠与PBS、LNPs或LNPs-NC siRNA比较(附图)。3F-I)。我们研究了lnp-siRNA基因敲除rp是否能消除rp之间对来氟米特的差异反应。H和CRPL中情局的老鼠。结果表明，来氟米特与lnps-siRNA联合应用能有效地减轻CRP的骨侵蚀。H中情局的老鼠。联合治疗CRP的疗效观察HCIA大鼠CRP水平与来氟米特相当。LCIA大鼠(附图)4A-d)。我们还检测了抗CRP抗体在CRP中的作用。L中情局的老鼠。抗CRP抗体部分模拟来氟米特减轻骨侵蚀的疗效(补充图)。4e-h).

　　摘要AHR基因信号在控制肝CRP的产生中起着重要的作用。13..经激动剂刺激后，AHR与ARNT结合，抑制CRP的表达13,14,25..越来越多的证据表明来氟米特，而不是它的代谢物A77 1726，可能是一种AHR激动剂。26..为证实来氟米特与AHR的直接相互作用，我们分别与DMSO(Vehicle)、来氟米特(Leflunomide)和A771726共同孵育标号标记的AHR(FLAG-AHR)。在拉下实验后，我们检测到AHR与来氟米特而不是A771726发生了相互作用。3A)。为了确定来氟米特-AHR相互作用中的关键残基，我们对AHR、PAS-A和PAS-B结构域进行了同源建模，这是与arnt二聚和与激动剂相互作用所必需的。14..选择了与来氟米特进行分子对接的最佳结构。5A)。预测了6种结合模式(附图)。5B)。选择了H 291、K 303和V 381两种最佳结合模式的关键残基进行突变(补充表)。4)。H 291或K 303突变可降低来氟米特与AHR的结合，而V 381突变不影响来氟米特与AHR的相互作用。H 291和K 303基因突变导致来氟米特-AHR相互作用显著减少(图1)。3B)。我们进一步进行了药物亲和力反应靶标稳定性(DATS)测定，以确定AHR与来氟米特之间的结合。DARTS试验依赖于与小分子药物相互作用所产生的靶蛋白对蛋白质的保护作用。27..分别与来氟米特(Leflunomide)和DMSO(Vehicle)孵育，再用蛋白酶(Subtilisin)消化(补充图)。6A)。H 291或K 303而非V 381的突变显著降低了与来氟米特相互作用所引起的AHR的稳定性，说明H 291和K 303参与了来氟米特与AHR的相互作用。H 291和K 303的突变导致了与来氟米特相互作用所赋予的AHR稳定性的协同降低(附图)。6B).

　　人正常肝细胞株(THLE-2)分别与DMSO、来氟米特和A771726共同孵育。免疫沉淀分析表明，来氟米特(而不是A771726)以剂量依赖性的方式诱导AHR与Arnt结合。3C)。来氟米特可显著降低CRP的表达和释放，而A771726则无明显影响。三维空间)。AHR基因敲除后，来氟米特不能降低CRP的表达和释放(附图)。6C，d)。来氟米特主要由细胞色素P4501A2酶(CYP1A2)代谢至A771726。28..呋喃菲林是CYP1A2的特异性抑制剂，可抑制来氟米特的代谢。28..我们用来氟米特孵育人正常原代肝细胞。来氟米特诱导AHR与Arnt结合，降低CRP的表达和释放。呋喃菲碱通过抑制来氟米特的代谢而稳定来进一步增强AHR-Arnt的相互作用和CRP的抑制(补充图)。6E，f)。以上结果表明，来氟米特本身而非A771726诱导AHR基因信号抑制正常肝细胞CRP的表达。除了基因组信号外，AHR还通过非基因组途径发挥作用，这与AHR-Arnt相互作用无关。29..一些配体已经被报道触发AHR非基因组途径来调节某些蛋白质的活性，例如Src，Jund和cyclinA。29,30..来氟米特对THLE-2细胞表达Jund、CyclinA和Src激活(Src磷酸化)无影响(补充图)。6g)，提示来氟米特可诱导正常肝细胞AHR基因信号转导。为探讨来氟米特是否诱导aHR基因信号抑制肝细胞CRP过表达，用IL-6预处理THLE-2细胞，诱导CRP过表达。22..来氟米特对THLE-2细胞超表达CRP诱导AHR-Arnt相互作用能力弱.CRP的敲除恢复了来氟米特诱导AHR-Arnt相互作用的能力。3E)。来氟米特不能抑制过表达CRP的THLE-2细胞CRP的表达和释放。3F).

　　两种CRPL和CRPH中情局大鼠口服车辆，来氟米特和A771726，分别(补充图)。7A)。血清CRP和TRAP5b水平较低。L来氟米特治疗的大鼠比用A771726的大鼠(补充图)。7b)。来氟米特对骨吸收和骨丢失的抑制作用在CRP中更为显著。L大鼠与A771726(补充图)比较。7C，d)。相比之下，来氟米特不能显著降低CRP中CRP、骨吸收和骨丢失。H大鼠与A771726(补充图)比较。7e-g)。这些结果，加上上述数据，使我们推测来氟米特除了通过a771726具有众所周知的免疫调节作用外，还能激活aHR基因信号，抑制CRP的产生，进而减轻CRP的骨侵蚀。LRA，而来氟米特-AHR-CRP信号通路在CRP中功能失调。HRa(图1.第三代).

　　据报道，HIF1α与AHR竞争ARNT协会。31..我们检测了非免疫组肝细胞中HIF1α的水平。L和CRPH中情局的老鼠。CRPL与未免疫大鼠相比，大鼠HIF1α表达略高于未免疫大鼠，而hf 1α表达水平略高于未免疫大鼠。H大鼠数量明显增加(图1)。4A)。CRP与HIF1α在两种CRP中的表达L和CRPH老鼠(附图)8A)。此外，LNPs抑制CRP-CRPsiRNA降低肝细胞HIF1α表达H老鼠(附图)8B)。我们用siRNA或过表达载体在THLE-2细胞中对CRP进行了体外调控.C反应蛋白的敲除可降低HIF1α的表达，降低ARNT与HIF1α的结合(如图1所示)。4B，c，补充图。8C)。超表达CRP的THLE-2细胞HIF1α表达增加，ARNT与HIF1α结合增强(如图1所示)。4D，e，补充图。8D)。我们在转染CRP、siRNA或过表达载体的THLE-2细胞中检测了来氟米特刺激的AHR基因组信号。CRP的下调增强了AHR-Arnt的相互作用，而CRP的过表达降低了THLE-2细胞在来氟米特刺激下的ARNT与AHR的相互作用(图1)。4F，g)。AHR与ARNT的结合及来氟米特对肝细胞CRP表达的抑制作用LCIA大鼠在CRP肝细胞中的作用HCIA大鼠(附图)8E，f)。结论：rp的高表达可引起HIF1α的上调，并与aHR竞争，从而导致hp中来氟米特-aHR-CRP信号传导功能障碍。HRa(图1.4H)。我们研究了HIF1α的敲除是否能改善THLE-2细胞在体外过表达CRP的来氟米特-AHR-CRP信号。HIF1α的敲除降低了ARNT与HIF1α的结合(图1)。4I). HIF1α单用siRNA对AHR-Arnt相互作用和CRP水平无影响(图5).4J，k)。然而，HIF1αsiRNA联合来氟米特能有效地增强AHR的基因组信号和CRP的抑制作用。4J，k)，提示抑制HIF1α可促进来氟米特激活AHR，抑制CRP在肝细胞中的表达。H拉。

　　DBA/1CIA小鼠给予来氟米特28天(补充图)。9A)。在微CT分析的基础上，将小鼠分为PBE+组和PBE?亚组。来氟米特治疗后，观察到PBE+CIA小鼠的骨微结构恶化，而不是在PBE?CIA小鼠中(补充图)。9B)。对DHODH活性和免疫细胞(T、B淋巴细胞和巨噬细胞)增殖的抑制以及细胞因子(IL-17、IL-6和RANKL)的降低在PBE?和PBE+小鼠中具有可比性(附图)。9C)。PBE+小鼠血清CRP水平升高H，34.67±5.41mg L?1)和TRAP5b，而PBE-小鼠的CRP相对较低。L，17.70±3.25mg L?1)和TRAP5b(附图)。9d)。来氟米特降低血清CRP和TRAP5b水平并抑制CRP骨吸收L小鼠而非CRPH小鼠(附图)9E，f).

　　HIF1α氧氟沙星/氧氟沙星小鼠阿尔布-克雷小鼠产生肝细胞特异性HIF1α击倒HIF1α-HKO)小鼠(附图)10a，b)。血清CRP水平与HIF1α-香港天文台及管制(HIF1α氧氟沙星/氧氟沙星)小鼠(附图。10C提示HIF1α不影响肝细胞CRP的表达。中情局是在HIF1α-HKO及对照小鼠。根据上述确定的CRP参考范围，将他们分为分组。L(17.70±3.25)mg L?1)和CRPHCIA小鼠(34.67±5.41mg L)?1)。来氟米特治疗后，观察CRP的骨侵蚀减轻情况。L但在CRP中没有H控制老鼠。然而，这两种CRPL和CRPHHIF1α-HKO小鼠对来氟米特抑制骨侵蚀反应满意(附图)。10d，e)。来氟米特对CRP炎性滑膜增生的抑制作用L和CRPH子组在控制和HIF1α-香港中央情报局老鼠(附图)10F)。来氟米特降低CRP和TRAP5b，抑制CRP破骨细胞活性和骨吸收L但在CRP中没有H对照组小鼠CRP、TRAP5b降低，来氟米特对破骨细胞活性和骨吸收的抑制作用显著。L和CRPH HIF1α-香港中央情报局老鼠(附图)10g-i)。以上结果提示肝细胞中HIF1α是重新激活来氟米特抑制rp和骨侵蚀的分子靶点。H拉。

　　dmso(Vehicle)或HIF1α抑制剂acf对THLE-2细胞高表达CRP的影响32..ACF降低了Arnt与HIF1α的结合，下调了HIF1α-Arnt信号转导最经典的靶基因，即血管内皮生长因子(VEGF)。血管内皮生长因子)33(无花果)5A)。将高表达CRP的THLE-2细胞分别与DMSO(Vehicle)、来氟米特(Leflunomide)、ACF和来氟米特(Leflunomide)与ACF联合孵育。与来氟米特或单用ACF相比，来氟米特和ACF联合应用增强了ARNT与AHR的结合，降低了CRP的表达和释放(图1)。c.)。我们收集上述处理组的条件培养液，并在巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)存在下与条件培养液共同孵育单核细胞。5D)。用来氟米特和ACF联合处理的单核细胞对破骨细胞的分化有抑制作用，而以来氟米特或ACF单独处理的条件培养液处理的细胞则不受抑制。5E-g)。这些结果表明，ACF促进来氟米特激活AHR，抑制CRP的表达，减少破骨细胞的体外分化。

　　ACF是否促进来氟米特降低CRP生成和减轻CRP骨侵蚀HCIA大鼠H大鼠分别给予车辆、来氟米特、ACF和来氟米特与ACF联合用药(图1)。6A)。CRPH来氟米特联合ACF大鼠血清CRP降低，骨侵蚀减轻，骨吸收减轻，骨丢失减少，CRP无明显降低，骨侵蚀无明显变化。H大鼠单用来氟米特或ACF(图1)。6B-E和补充图。11)。来氟米特或来氟米特与ACF联合治疗CRP炎性滑膜增生HCIA大鼠(附图)11)。CRP中丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、肾功能参数尿素氮(BUN)和血液学参数(包括总蛋白(TP)、血红蛋白、白细胞(WBC)、红细胞(RBC)和血小板(PLT)无明显变化。H来氟米特联合ACF治疗CIA大鼠与来氟米特或单用ACF比较(补充表)5).