生产类红血球及／或红血球之方法与流程

　　1.本揭示是关于红血球生产之领域。特定言之，包含至少一个存活基因之工程化干细胞用于产生类红血球及/或红血球。2.相关申请的交叉引用3.本技术要求于2020年5月13日提交的美国临时申请案第63/024,176号的优先权，该申请的全部内容用于所有目的通过引用并入本文。背景技术：4.尽管输血广泛用于各种临床疗法，但临床血源有限，且输血用血的供应依赖于志愿者献血。生育率之逐步下降导致符合供体条件之人口逐渐减少，且预计全球将缺少血源供应(transfusion 2010；50:584-588)。此外，输血传染性疾病仍为重要问题。幸运的是，由于用于扩增细胞之培养基可自动更换，因此有可能获得超出实验室水平之大量目标细胞。5.发现活体外大规模生产红血球(rbc)之技术对于生产rbc之替代来源而言重要。生物反应器系统中之无饲养层培育使制造商能够为大规模活体外细胞生成开发无异种、有成本效益的培养方案，其将为临床应用提供巨大优势(tissue engineering.part c methods 2011；17:1131-1137,biomaterials 2005；26:7481-7503)。然而，未阐明去白血球过程后成熟红细胞之总数或最终rbc去核率。在实际应用之前，应证明此等结果之再现性及可行性。6.因此，治疗应用非常需要大规模生产红血球之方法。技术实现要素：7.本揭示关于提供适当微环境及基质，诸如间叶干细胞(mesenchymal stemcell，msc)，以诱导红血球生成及rbc去核。8.在一个态样中，本揭示提供一种生产类红血球及/或红血球之方法，其包含将造血干细胞或类红血球与永生化间叶干细胞(msc)之群体或获自永生化msc之条件培养基一起培养，其中永生化msc经存活基因遗传工程化。9.在一些实施例中，hsc或类红血球之细胞计数比永生化msc之细胞计数在以下范围内：约100:1至约1:100、约80:1至约1:80、约70:1至约1:70、约60:1至约1:60、约50:1至约1:50、约40:1至约1:40、约30:1至约1:30、约20:1至约1:20、约18:1至约1:18、约16:1至约1:16、约14:1至约1:14、约12:1至约1:12、约10:1至约1:10、约10:1至约1:8、约10:1至约1:6、约10:1至约1:4、约10:1至约1:2、约10:1至约1:1。10.在一些实施例中，hsc为cd34+hsc。在另一态样中，hsc优选源自人类脐带血。11.在一些实施例中，存活基因为akt基因或肝细胞生长因子(hgf)基因。优选地，存活基因为akt基因。12.在一些实施例中，永生化msc经人类端粒酶反转录酶(htert)永生化。13.在一个实施例中，本文所述之间叶干细胞为脐带间叶干细胞(umsc)、脂肪源性间叶干细胞(adsc)或骨髓间叶干细胞(bmsc)。14.在一些实施例中，永生化msc为cd146+igf1r+。15.在一些实施例中，永生化msc经低氧处理。16.在一个实施例中，本文所述之方法包含藉由将hsc与永生化msc或获自永生化msc之条件培养基一起培养来增强hsc增殖。在一些实施例中，将hsc与永生化msc或获自永生化msc之条件培养基一起培养以增强hsc增殖系进行0.5至8天，诸如0.5天、1天、1.5天、2天、2.5天、3天、3.5天、4天、4.5天、5天、5.5天、6天、6.5天、7天、7.5天或8天；优选2天至6天，诸如2天、2.5天、3天、3.5天、4天、4.5天、5天、5.5天或6天；更优选3天至5天，诸如3天、3.5天、4天、4.5天或5天。17.在一些实施例中，该方法进一步包含将hsc与以下中之至少一者一起培养：干细胞因子(scf)、fms样酪氨酸激酶3(flt-3)、介白素3(il-3)、维生素c及地塞米松。18.在一个实施例中，本文所述之方法包含藉由将hsc与永生化msc或获自永生化msc之条件培养基一起培养来诱导hsc分化为类红血球。在一些实施例中，将hsc与永生化msc或获自永生化msc之条件培养基一起培养以诱导hsc分化为类红血球系进行5天至20天，诸如5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天或20天；优选8天至16天，诸如8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天或16天；更优选10天至15天，诸如10天、11天、12天、13天、14天或15天。19.在一些实施例中，该方法进一步包含将hsc与以下中之至少一者一起培养：scf、红血球生成素(epo)、颗粒球-巨噬细胞群落刺激因子(gm-csf)、flt-3、地塞米松、il-3、维生素c及富血小板血浆(prp)。20.在一个实施例中，本文所述之方法包含藉由将类红血球与永生化msc或获自永生化msc之条件培养基一起培养来促进类红血球之分化及成熟。在一些实施例中，将类红血球与永生化msc或获自永生化msc之条件培养基一起培养以促进类红血球之分化及成熟系进行0.5至8天，诸如0.5天、1天、1.5天、2天、2.5天、3天、3.5天、4天、4.5天、5天、5.5天、6天、6.5天、7天、7.5天或8天；优选2天至6天，诸如2天、2.5天、3天、3.5天、4天、4.5天、5天、5.5天或6天；更优选2天至5天，诸如2天、3天、4天或5天。21.在一些实施例中，该方法进一步包含将类红血球与以下中之至少一者一起培养：肝素、运铁蛋白、scf、epo及维生素c。22.在一些实施例中，用于培养hsc或类红血球之培养基中scf之浓度在以下范围内：约10ng/ml至约1,000ng/ml；约20ng/ml至约800ng/ml；约30ng/ml至约600ng/ml；约40ng/ml至约400ng/ml；约50ng/ml至约300ng/ml；约60ng/ml至约250ng/ml；约80ng/ml至约200ng/ml；约80ng/ml至约150ng/ml。在一些实施例中，用于培养hsc或类红血球之培养基中flt3之浓度在以下范围内：约10ng/ml至约1,000ng/ml；约20ng/ml至约800ng/ml；约30ng/ml至约600ng/ml；约40ng/ml至约400ng/ml；约50ng/ml至约300ng/ml；约60ng/ml至约250ng/ml；约80ng/ml至约200ng/ml；约80ng/ml至约150ng/ml。在一些实施例中，用于培养hsc或类红血球之培养基中il-3之浓度在以下范围内：约1ng/ml至约100ng/ml；约2ng/ml至约80ng/ml；约4ng/ml至约60ng/ml；约6ng/ml至约40ng/ml；约8ng/ml至约35ng/ml；约10ng/ml至约30ng/ml；约12ng/ml至约25ng/ml；约15ng/ml至约25ng/ml。在一些实施例中，用于培养hsc或类红血球之培养基中维生素c之浓度在以下范围内：约5μm至约200μm；约8μm至约150μm；约10μm至约120μm；约15μm至约100μm；约20μm至约80μm；约25μm至约60μm；约25μm至约40μm；约25μm至约35μm。在一些实施例中，用于培养hsc或类红血球之培养基中地塞米松之浓度在以下范围内：约0.1μm至约10μm；约0.2μm至约8μm；约0.3μm至约6μm；约0.4μm至约4μm；约0.5μm至约3μm；约0.6μm至约2μm；约0.8μm至约1.5μm；约0.8μm至约1.2μm。在一些实施例中，用于培养hsc或类红血球之培养基中epo之浓度在以下范围内：约0.1iu/ml至约20iu/ml；约0.2iu/ml至约18iu/ml；约0.5iu/ml至约16iu/ml；约0.8iu/ml至约14iu/ml；约1iu/ml至约12iu/ml；约2iu/ml至约10iu/ml；约3iu/ml至约9iu/ml；约4iu/ml至约8iu/ml。在一些实施例中，用于培养hsc或类红血球之培养基中gm-csf之浓度在以下范围内：约1ng/ml至约50ng/ml；约2ng/ml至约45ng/ml；约4ng/ml至约40ng/ml；约6ng/ml至约35ng/ml；约8ng/ml至约30ng/ml；约10ng/ml至约25ng/ml；约12ng/ml至约25ng/ml；约13ng/ml至约20ng/ml。在一些实施例中，用于培养hsc或类红血球之培养基中prp之浓度在以下范围内：约1％至约100％；约2％至约80％；约3％至约60％；约4％至约40％；约5％至约35％；约6％至约30％；约7％至约20％；约8％至约15％。在一些实施例中，用于培养hsc或类红血球之培养基中肝素之浓度在以下范围内：约0.1u/ml至约20u/ml；约0.2u/ml至约18u/ml；约0.5u/ml至约16u/ml；约0.8u/ml至约14u/ml；约1u/ml至约12u/ml；约2u/ml至约10u/ml；约3u/ml至约9u/ml；约4u/ml至约8u/ml。在一些实施例中，用于培养hsc或类红血球之培养基中运铁蛋白之浓度在以下范围内：约10μg/ml至约2,000μg/ml；约50μg/ml至约1,800μg/ml；约100μg/ml至约1,600μg/ml；约200μg/ml至约1,400μg/ml；约300μg/ml至约1,300μg/ml；约40μg/ml至约1,200μg/ml；约500μg/ml至约1,000μg/ml；约600μg/ml至约900μg/ml。23.在一个实施例中，本文所述之方法包含藉由将hsc与永生化msc或获自永生化msc之条件培养基一起培养来增强hsc增殖；诱导hsc分化为类红血球，其包含将hsc与永生化msc或获自永生化msc之条件培养基一起培养；及藉由将类红血球与永生化msc或获自永生化msc之条件培养基一起培养来促进类红血球之分化及成熟。24.在一个态样中，本揭示提供一种制造用于输血之血液制品的方法，其包含藉由使用如本文所述之方法生产类红血球及/或红血球。25.在一个态样中，本揭示提供一种用于增加血红蛋白合成之方法，其包含藉由使用如本文所述之方法生产类红血球及/或红血球。26.在一些实施例中，血红蛋白为成人血红蛋白。27.图式简单说明28.图1a展示htert-adsc-akt及htert-adsc之脂肪细胞、软骨细胞及骨细胞分化的结果。29.图1b展示用于转导akt之质体构筑以及htert-adsc-akt及htert-adsc之西方墨点法、elisa及流动式细胞测量术分析的结果。30.图1c展示根据elisa，在24、48及72小时处，htert-adsc-akt、htert-adsc、经低氧(h)预处理之htert-adsc-akt、经低氧(h)预处理之htert-adsc的vegf分泌结果。31.图1d展示在第5天至第21天，在具有或不具有条件培养基之情况下培养之cd34+细胞的细胞增殖结果。32.图2a展示自cb cd34+细胞以工业规模离体产生红血球生成的结果。33.图2b展示根据流动式细胞测量术分析，细胞自干细胞增殖及分化为类红血球谱系的结果。34.图2c展示根据wright-giemsa细胞染色，细胞自干细胞增殖及分化为类红血球谱系的结果。35.图2d展示在第1天至第21天藉由wright-giemsa染色进行之细胞染色的结果。36.图3a展示自第18至21天，分化细胞之血红蛋白含量的结果。37.图3b展示自第18至21天之分化细胞的照片。38.图3c展示细胞活力之结果。39.图3d展示根据流动式细胞测量术之去核rbc率(cd235a+/nucred-)的结果。40.图4a展示藉由流动式细胞测量术检查血红蛋白亚型及经培养类红血球及pb之血红蛋白表现的结果。41.图4b展示经培养rbc之类红血球标记及血红蛋白含量的结果。42.图5展示当将经cfse标记之成人周边血液rbc(prbc)或crbc注射至经cl2mdp-脂质体治疗之nod/scid或裸小鼠中时，在共聚焦显微镜下观察之cfse+crbc百分比的结果。具体实施方式43.除非另外定义，否则本文中所使用之所有科学或技术术语具有与一般熟习本揭示所属技术者所理解相同的含义。一般熟习此项技术者可理解及使用类似或等效于本文中所描述之彼等的任何方法及材料来实践本揭示。44.除非另外指示，否则本说明书及申请专利范围中所用之表示成分数量、反应条件等之所有数字理解为在所有情况下皆经术语“约”修饰。因此，除非有相反指示，否则本揭示之说明书及申请专利范围中所阐述的数值参数为近似值且可视藉由本揭示寻求之所需特性而变化。45.术语“一(a/an)”应意谓本揭示中所述之目标中之一者或多于一者。术语“及/或”意谓替代方案中之一者或两者。术语“细胞(a cell)”或“细胞(the cell)”可包括复数个细胞。46.如本文所用，“类红血球”含有细胞核，直至细胞排出其细胞核且以无核红血球(red blood cell/erythrocyte)形式进入循环。47.术语“活体外”一般意谓活有机体外部，诸如在形成于有机体外部之人工环境中进行的实验。术语“活体外”一般描述在活有机体外部进行之程序、测试及实验。48.如本文所用之术语“永生化”是指诱导、促进或实现细胞活力、细胞存活及/或细胞增殖。49.如本文所用，术语“干细胞”是指呈未分化或部分分化状态之细胞，其具有自体更新特性且具有自然分化为更分化细胞类型之发育潜能，关于发育潜能无特定隐含含义(亦即，分化全能、多能、多潜能等)。自体更新意谓干细胞能够增殖且产生更多此类干细胞，同时维持其发育潜能。因此，术语“干细胞”是指在特定情况下具有分化为更特定或分化表型之发育潜能，且在某些情况下保留增殖而不实质上分化之能力的任何细胞亚群。50.如本文所用，术语“源自”应理解为指示特定样品或样品组来源于指定物种，但未必直接获自指定来源。51.在细胞个体发生之情形下，形容词“分化(differentiated)”或“分化(differentiating)”为相对术语。“分化细胞”为相比于比所比较之细胞，在发育途径中进一步发展的细胞。因此，干细胞可分化为谱系受限前驱体细胞(诸如hsc)，该等细胞转而可进一步分化为途径中之其他类型之前驱体细胞(诸如类红血球)，且接着分化为末期分化细胞，在某些组织类型中起特征性作用，且可或可不保留进一步增殖之能力。52.术语细胞之“遗传工程化(genetically engineered)”或“遗传工程化(genetic engineering)”意指使用遗传物质操纵基因以改变细胞中之基因复本及/或基因表现量。遗传物质可呈dna或rna形式。遗传物质可藉由包括病毒转导及非病毒转染之各种方式转移至细胞中。在遗传工程化之后，细胞中某些基因之表现量可永久或暂时改变。53.术语“转导(transduction)”或“转导(transduce)”意谓使用病毒将遗传物质递送至细胞中，其中病毒可为整合或非整合病毒。本揭示中所用之整合病毒可为慢病毒或反转录病毒。整合病毒允许将其编码基因整合至经病毒粒子感染之经转导细胞中。非整合病毒可为腺病毒或仙台病毒(sendai virus)。本揭示中亦可使用非病毒方法，诸如藉由将dna或rna物质转染至细胞中。dna物质可呈piggybac、微型环载体或附加型质体之形式。rna物质可呈mrna或mirna之形式。54.术语“表现载体”意谓将外源基因携带至细胞中以进行表现而不降解之试剂。本揭示中之表现载体可为质体、病毒载体及人工染色体。55.为诱导红血球生成及rbc去核，重要的是准备适当微环境。近来，藉由在异种(鼠类)基质细胞上共培养之cb源性cd34+细胞来大规模扩增rbc(nat biotechnol.2005；23:69-74)。然而，对于人类应用，应建立经人类基质细胞替换之动物源性细胞。相比于无饲养细胞之液体培养物，在htert基质共培养系统中观测到cd34+细胞扩增产率及红血球母细胞去核率显著增加(nat biotechnol.2006；24:1255-6)。56.本揭示使用经存活基因修饰之永生化msc来优化培养策略，以产生用于自cb cd34+细胞离体大规模产生人类红血球之连续三相共培养系统。因此，本揭示提供一种生产类红血球及/或红血球之方法，其包含将造血干细胞或类红血球与永生化间叶干细胞(msc)之群体或获自永生化msc之条件培养基一起培养，其中永生化msc经存活基因遗传工程化。57.本揭示中所用之间叶干细胞可获自不同来源，优选获自脐带、脂肪组织或骨髓。根据不同来源，间叶干细胞为脐带间叶干细胞(umsc)、脂肪源性间叶干细胞(adsc)或骨髓间叶干细胞(bmsc)。在本揭示之一些实施例中，msc自脐带分离及纯化，且称为“脐带msc”或“umsc”。在一些实施例中，已确定本揭示中之umsc表现与自其他本体分离之msc相同的表面标记选择，且展现可比活性。58.根据本揭示之永生化msc经修饰以表现akt或hgf。如本文所用，本揭示中之术语“经修饰以表现”是指将外源基因或基因片段转移至间叶干细胞中以使得其可表现外源基因或基因片段。优选地，此修饰不改变永生化msc之分化潜能。在另一态样中，此修饰优选为稳定修饰，且表现可为持续性或诱导性的。根据本揭示之永生化msc经修饰以表现akt或hgf且仍具有与无akt或hgf转导之常用永生化msc或正常msc相似的多能分化潜能，诸如但不限于脂肪生成、软骨生成、成骨及血管形成。59.蛋白激酶b(pkb)，亦称为akt，为丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶，其在多种细胞过程中起关键作用，诸如葡萄糖代谢、细胞凋亡、细胞增殖、转录及细胞迁移。akt藉由结合及调节许多下游效应子，例如核因子-κb、bcl-2家族蛋白、主溶酶体调节剂tfeb及鼠类双微体2(mdm2)来调节细胞存活及代谢。akt可直接及间接地促进生长因子介导之细胞存活。已发现移植细胞之低氧预处理(移植前短暂培育细胞)经由活化akt依赖性路径来保护人类脑内皮免于缺血性凋亡(am j transl res.2017；9:664-673)。60.肝细胞生长因子(hgf)或分散因子(sf)为旁分泌细胞生长、活动性及形态发生因子。其由间叶细胞分泌且主要靶向及作用于上皮细胞及内皮细胞，且亦作用于造血前驱细胞及t细胞。肝细胞生长因子藉由在结合于原致癌c-met受体之后活化酪氨酸激酶信号传导级联来调节细胞生长、细胞活动性及形态发生。肝细胞生长因子由间叶细胞分泌且在主要来源于上皮之细胞上充当多官能细胞介素。61.用akt或hgf修饰永生化msc之方式不受限制。优选地，akt或hgf经转座子或慢病毒转导；更优选地，转座子为piggybac转座子。结果展示piggybac转座子可有效且稳定地转染msc，且piggybac之基因修饰不改变msc之dna复本数或配置。62.在一些实施例中，本文所述之任何方法中所用之永生化干细胞包含诱导细胞永生性之试剂。63.在一些实施例中，永生化细胞系藉由用永生化试剂处理细胞来产生。在一些实施例中，永生化试剂包含表现或过度表现诱导细胞永生性之多肽的转殖基因。在一些实施例中，永生化试剂包含诱导细胞永生性之多肽。在一些实施例中，诱导细胞永生性之多肽为致癌肽。致癌肽为诱导细胞永生性之任何适合之类别。举例而言，在某些实施例中，诱导细胞永生性之适合之致癌肽为：生长因子及/或有丝分裂原(例如pdgf源性生长因子，诸如c-sis)；受体酪氨酸激酶，特定言之组成型活性受体酪氨酸激酶(例如表皮生长因子受体(egfr)、凝血细胞源性生长因子受体(pdgfr)、血管内皮生长因子受体(vegfr)及her2/neu)；细胞质酪氨酸激酶(例如酪氨酸激酶之src家族、syk-zap-70家族及btk家族)；细胞质丝氨酸/苏氨酸激酶及其调节次单位(例如raf激酶、细胞周期蛋白依赖性激酶、akt家族成员)；调节性gtp酶(例如ras蛋白)；转录因子(例如myc及hif-1a)；端粒酶反转录酶(例如tert或htert)；及/或活化其他致癌肽之因子(例如细胞周期蛋白，包括细胞周期蛋白a、b、d及/或e，诸如细胞周期蛋白d1及d3)。在某些实施例中，肿瘤肽为myc、hif-1a、notch-1、akt、htert或细胞周期蛋白。在一些实施例中，肿瘤肽为诱导细胞活力、细胞存活及/或细胞增殖之任何致癌肽的功能片段、同源物或类似物，例如myc、hif-1a、notch-1、akt,htert或细胞周期蛋白，优选htert之功能片段、同源物或类似物。64.本揭示之永生化msc含有包含akt或hgf基因之表现载体。除了akt或hgf之序列以外，本揭示之载体亦包含一或多个用于调节本揭示之多核苷酸之表现的控制序列。经分离多核苷酸在其插入至载体中之前的操纵可视所用表现载体而为所需或必需的。利用重组dna方法修饰多核苷酸及核酸序列之技术为此项技术中熟知的。在一些实施例中，控制序列尤其包括启动子、前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、信号肽序列及转录终止子。在一些实施例中，适合之启动子系基于宿主细胞选择来选择。65.本揭示之重组表现载体连同一或多个表现调节区，诸如启动子及终止子、复制起点等一起揭示，此视其欲引入至之宿主的类型而定。组成型启动子之非限制性实例包括sffv、cmv、pkg、mdnu3、sv40、ef1a、ubc及cagg。66.本文所述之各种核酸及控制序列接合在一起以产生重组表现载体，其包括一或多个方便的限制位点，允许在此类位点插入或取代本揭示之多核苷酸。或者，在一些实施例中，本揭示之多核苷酸藉由将多核苷酸或包含该序列之核酸构筑体插入至用于表现之适当载体中来表现。在涉及表现载体之产生的一些实施例中，编码序列位于载体中以使得编码序列与用于表现之适当控制序列可操作地连接。重组表现载体可为任何适合之载体(例如质体或病毒)，其可适宜地经受重组dna程序且引起本揭示之多核苷酸之表现。载体之选择将通常视载体与其中引入载体之宿主细胞的兼容性而定。载体可为线性或闭合环状质体。在一个实施例中，载体为病毒载体。病毒载体之实例包括反转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、α病毒载体及其类似物。在某一实施例中，病毒载体为慢病毒载体。慢病毒载体系基于或源自致癌反转录病毒(含有mlv之反转录病毒亚群)及慢病毒(含有hiv之反转录病毒亚群)。此类病毒之实例包括但不限于人类免疫缺乏病毒(hiv)、马感染性贫血病毒(eiav)、猿猴免疫缺乏病毒(siv)及猫免疫缺乏病毒(fiv)。或者，经考虑可使用其他反转录病毒作为载体主链之基础，诸如鼠类白血病病毒(mlv)。67.在一些实施例中，已在各种分化分析中测试本揭示之永生化msc以确定其与自哺乳动物身体之其他位置分离之习知msc的兼容性。分化分析包括生脂分化、成骨分化及软骨形成分化。在一些实施例中，分化分析进一步包括神经元细胞分化。68.在本揭示之一些实施例中，应用经akt修饰之htert-msc来优化培养策略，以产生具有htert-msc-akt之连续三相共培养系统，用于自cb cd34+细胞离体大规模产生人类红血球。为诱导红血球生成及rbc去核，重要的是准备具有足够细胞介素补充剂及基质(诸如间叶干细胞(msc))的适当微环境。69.优选地，如本揭示中所述之永生化msc经低氧处理。在本揭示之一个实施例中，相比于无akt之永生化msc，经akt修饰之永生化msc之低氧预处理在条件培养基中诱导更多vegf分泌。70.在本揭示之一个实施例中，经由与msc共培养系统或以脐带血源性cd34+hsc为起始物之衍生条件培养基的组合液体培养来离体扩增类红血球，在类红血球增殖及分化条件下培育超过25天，其在最佳条件下在25天内产生大于106-107倍扩增。均质类红血球系藉由细胞形态及流动式细胞测量术表征。此外，藉由添加条件培养基或与携有akt(htert-adsc-akt)之cd146+igf1r+永生化msc共培养来改良终末类红血球成熟。培养之类红血球经历多个成熟事件，包括大小减小、血型糖蛋白a(cd235a)表现增加及核浓缩，其导致多达80％或更多细胞中之固缩核被挤出。重要的是，其具有在进一步成熟后表现成人确定性β-血球蛋白链(hba)之能力。脐带血分化红血球(rbc)之氧平衡曲线与正常rbc相当。自脐带血产生之类红血球及rbc之高数目及纯度使得此方法适用于为未来生产可用于输血之rbc提供基础。71.在一个实施例中，类红血球来自活体外或离体扩增及分化之hsc。在一些实施例中，类红血球包含造血前驱体细胞，例如cd34+细胞。72.在一个实施例中，类红血球获自血液。获自血液或活体外或离体扩增及分化之hsc的类红血球均可应用于进一步生产红血球。73.在某些实施例中，永生化hsc作为永生化esc株成功地连续维持。74.在一个实施例中，本文所述之方法包含藉由将hsc与永生化msc或获自永生化msc之条件培养基一起培养来增强hsc增殖的第一阶段。在一些实施例中，方法之第一阶段进一步包含将hsc与以下中之至少一者一起培养：干细胞因子(scf)、fms样酪氨酸激酶3(flt-3)、介白素3(il-3)、维生素c及地塞米松。75.在一个实施例中，本文所述之方法包含藉由将hsc与永生化msc或获自永生化msc之条件培养基一起培养来诱导hsc分化为类红血球之第二阶段。在一些实施例中，方法之第二阶段进一步包含将hsc与以下中之至少一者一起培养：scf、红血球生成素(epo)、颗粒球-巨噬细胞群落刺激因子(gm-csf)、flt-3、地塞米松、il-3、维生素c及富血小板血浆(prp)。76.在一个实施例中，本文所述之方法包含藉由将类红血球与永生化msc或获自永生化msc之条件培养基一起培养来促进类红血球之分化及成熟之第三阶段。在一些实施例中，方法之第三阶段进一步包含将类红血球与以下中之至少一者一起培养：肝素、运铁蛋白、scf、epo及维生素c。77.在本揭示之一个实施例中，经由与msc共培养系统或以脐带血源性cd34+hsc为起始物之衍生条件培养基的组合液体培养来离体扩增类红血球，在类红血球增殖及分化条件下培育超过25天，其在最佳条件下在25天内产生大于106-107倍扩增。均质类红血球系藉由细胞形态及流动式细胞测量术表征。此外，藉由添加条件培养基或与携有akt(htert-adsc-akt)之cd146+igf1r+永生化msc共培养来改良终末类红血球成熟。培养之类红血球经历多个成熟事件，包括大小减小、血型糖蛋白a(cd235a)表现增加及核浓缩，其导致多达超过80％之细胞中之固缩核被挤出。重要的是，其具有在进一步成熟后表现成人确定性β-血球蛋白链(hba)之能力。脐带血分化红血球(rbc)之氧平衡曲线与正常rbc相当。自脐带血产生之类红血球及rbc之高数目及纯度使得此方法适用于为未来生产可用于输血之rbc提供基础。78.在一个实施例中，类红血球来自活体外或离体扩增及分化之hsc。在一些实施例中，类红血球包含造血前驱体细胞，例如cd34+细胞。79.在一个实施例中，类红血球获自血液。获自血液或活体外或离体扩增及分化之hsc的类红血球均可应用于进一步生产红血球。80.在某些实施例中，永生化hsc成功地连续维持，以成为建立永生化esc株。81.如本文所用之条件培养基是指以培养永生化msc为条件之培养基。此类条件培养基包含由永生化msc分泌之分子，包括独特基因产物。此类条件培养基及其中所包含之任何分子(尤其包括蛋白质或多肽)之组合可用于治疗疾病。其可用于补充永生化msc之活性，或替代永生化msc，例如出于生产类红血球及/或红血球之目的。82.在一个态样中，本揭示提供一种制造用于输血之血液制品的方法，其包含如本文所述之生产类红血球及/或红血球之方法。83.在一个态样中，本揭示提供一种用于增加血红蛋白合成之方法，其包含如本文所述之生产类红血球及/或红血球之方法。84.应理解，若在本文中引用任何先前技术公开案，则该引用不构成对该公开案形成此项技术中之公共常识之部分的承认。85.尽管已出于清楚理解之目的藉助于说明及实例相当详细地提供了揭示内容，但对于熟习此项技术者将显而易见，可在不脱离本揭示之精神或范畴的情况下实践各种改变及修改。因此，前述描述及实例不应视为限制性的。86.实例87.方法及材料：88.cd34+细胞之分离及收集89.在获得经中国台湾地区台湾中国医药大学机构审查委员会(中国台湾台中)批准之书面知情同意书之后，健康成年志愿者提供来自正常足月分娩的脐带血(cb)样品(o型)。为获得cb cd34+细胞，吾人藉由聚蔗糖-泛影钠离心自cb分离低密度单核细胞，且接着使用mini-macs管柱经由超磁微珠选择自单核细胞纯化cb cd34+细胞。分离之cd34+细胞之纯度在90％至99％范围内，如藉由流动式细胞测量术使用与藻红素(pe)结合之抗人类cd34 mab所测定。90.原代umsc之制备、分离及表征91.经中国台湾地区台湾中国医药大学医院机构审查委员会(irb)批准之所收集人类脐带组织用不含ca2+及mg2+之pbs(dpbs，life)洗涤三次。用剪刀沿中线方向对其进行机械切割，且脐动脉、静脉及轮廓膜(outlining membrane)之血管与花顿氏胶(wharton's jelly，wj)分离。接着将胶冻内容物广泛切成小于0.5cm3的小块，用1型胶原酶(st louis,usa)处理，且在37℃下在95％空气/5％ co2加湿氛围中培育3小时。接着在37℃下在95％空气/5％ co2加湿氛围中于含有10％胎牛血清(fcs)及抗生素之dmem中培养外植体。使其保持5-7天不受干扰以允许细胞自外植体迁移。脐带源性间叶干细胞(umsc)之细胞形态在4-8个继代后在培养物中变为均匀的纺锤形，且来自wj之细胞之特定表面分子由流式细胞分析表征。细胞用含2mm edta之pbs分离，用含有2％ bsa及0.1％迭氮化钠之pbs洗涤，且与结合于以下者之各别抗体一起培育：异硫氰酸荧光素(fitc)或藻红素(pe)，包括cd13、cd29、cd44、cd73、cd90、cd105、cd166、cd49b、cd1q、cd3、cd10、cd14、cd31、cd34、cd45、cd49d、cd56、cd 117、hla-abc及hla-dr此后，使用becton dickinson流式细胞仪分析细胞。92.质体构筑93.藉由特异性限制酶连接符(ecor1、nhe1、bamh1及not1)将来自akt质体之akt cdna(0.1μg)(pcmv6-myc-ddk-akt，)转移至pires或psf-cmv-cmv-sbfi(oxford)中，以构建为psf-akt-gfp之构筑体。94.用于稳定细胞株之piggybac转座子系统的构筑95.将含有多个选殖位点(mcs)、piggybac末端重复序列(pb-tr)、核心绝缘子(ci)及嘌呤霉素选择标记(bsd)(与人类ef1α驱动之rfp融合)之piggybac载体ppb-cmv-mcs-ef1α-redpuro用作基载体(system)。含有akt(来自psf-akt)之dna片段经pcr扩增且次选殖至ppb-cmv-mcs-ef1α-redpuro载体中，在ef1α之编码区前面。关于载体构筑体(ppb-akt)之详细信息展示于图1b中。为产生htert-adsc-akt稳定细胞，藉由电穿孔(amaxa nucleofectorlonza)用piggybac转座酶表现载体(system)将上述ppb-akt质体共转染至htert-adsc(scrc-4000tm，atcc)中。在嘌呤霉素存在下选择经稳定转染之细胞。96.总蛋白提取、西方墨点法及elisa97.将细胞溶解于含有320mm蔗糖、5mm hepes、1μg/ml抗纤维蛋白溶酶肽及1μg/ml抑肽酶之缓冲液中。溶解物以13,000g离心15分钟。将所得集结粒再悬浮于样品缓冲液(62.5mm tris-hcl、10％甘油、2％ sds、0.1％溴酚蓝及50mm dtt)中且进行sds-聚丙烯酰氨凝胶(4-12％)电泳。接着将凝胶转移至hybond-p耐纶膜。接着与经适当稀释之抗体:akt(1:200，novus)一起培育。根据制造商之方案，分别对各抗体进行膜封闭、一级及二级抗体培育以及化学发光反应。使用digital science 1d影像分析系统(eastman)来量测各带之强度。另外，根据制造商说明书量测培养基中vegf、hgf(quantikine elisa套组，r&)之总量。使用分光亮度计(molecular)量测光学密度，且用程序softmax(molecular)产生标准曲线。98.活体外分化分析99.对于脂肪细胞分化，将细胞在含有低葡萄糖dmem、1×its1mg/ml la-bsa1mm氢化可体松(sigma)、60mm吲哚美辛0.5mm异丁基甲基黄嘌呤及10％马血清之培养基中培养。为评估生脂分化，将细胞在室温下用0.3％油红o作为细胞内脂质累积之指示剂染色10分钟且用苏木精复染。对于软骨细胞分化，将细胞在含有90％高葡萄糖dmem、10％ fbs、1×its、1mg/ml labsa、50nm地塞米松及60pm转型生长因子-β1(tgf-b1)(r&d)之培养基中培养。藉由施加0.5％艾尔逊蓝(alcian blue)8gx用于富蛋白聚糖软骨基质及1％天狼星红(sirius red)f3b用于胶原基质来进行艾尔逊蓝/天狼星红染色在含有10％fcs、100u/ml青霉素、100mg/ml链霉素、50mg/ml l-抗坏血酸2-磷酸、10mm b-甘油磷酸及100nm地塞米松之高葡萄糖dmem中生长之apsc汇合单层培养物中进行成骨分化。使用茜素红s染色(1％)测定成骨以侦测钙矿化。100.制备msc源性条件培养基101.在培养烧瓶中使cd146+igf1r+htert-adsc-akt(1×106)生长至80-90％汇合度。接着用10ml无血清cellgenix scgm调节细胞。在24小时之后收集条件培养基，且用0.2mm针筒过滤器(thermo)灭菌。将制备之条件培养基保持在-80℃下直至使用。102.低氧程序103.将在37℃下在5％ co2加湿培育箱中培养之细胞在常氧(21％ o2)或各种低氧条件(1％、3％及5％ o2)在不同时间点(24小时、48小时或72小时)进行处理。在配备有o2探针以调节n2气体含量之双气体培育箱(jouan inc,winchester,virginia)中培养低氧培养物。使用锥虫蓝拒染(trypan blue exclusion)分析来评估细胞数目及活力。104.细胞介素数组105.使用补充有蛋白酶及磷酸酶抑制剂混合液(invitagen)之溶解缓冲液来提取全蛋白。使用人类细胞介素数组组(r&d)，根据制造商说明书测试100mg外泌体蛋白之细胞介素含量。简言之，将外泌体溶解物与侦测抗体混合液混合且与含有40种不同抗细胞介素捕捉抗体之膜一起在4℃下培育隔夜。在与抗生蛋白链菌素-hrp一起培育之后，将膜与化学发光受质一起培育且暴露于x射线膜。使用imagej 1.47软件定量蛋白质之像素密度。106.自脐带血(cb)收集及分离cd34+细胞107.在中国台湾地区台湾中国医药大学医院中收集脐带cb(cb)样品(o型)。该研究经医院之伦理委员会审查委员会(irb)批准。使用mini-macs管柱经由超磁微珠结合抗cd34 mab选择来进行自cb分离cd34+细胞。藉由流动式细胞测量术测定分离之cd34+细胞的纯度。108.cb cd34+细胞在无细胞系统或在htert-adsc-akt上之培育(第一阶段)109.为了在第一阶段培养(第1-4天)中自cb cd34+细胞扩增hsc，在37℃下在5％co2中将cb cd34+细胞(1×105个/毫升)接种于具有条件培养基之无细胞系统中，该条件培养基已涂铺于具有10ml无血清scgm之75cm2烧瓶中，该scgm含有白蛋白及胰岛素，补充有100ng/ml重组人类干细胞因子(scf，)、1μm地塞米松(dex，)、30μm维生素c(vit-c，)及1ng/ml重组人类介白素-3(il-3，)。每2天部分补充培养基。110.培育hsc以在htert-adsc-akt上扩增及分化类红血球(第二及第三阶段)111.在第8天，为进行红血球母细胞扩增，将细胞(1至2×106个细胞/毫升)在75cm2烧瓶或hyperflask中维持于cellgenix scgm中12-14天，cellgenix scgm具有/不具有htert-adsc-akt源性条件培养基且补充有100ng/ml重组人类干细胞因子(scf，)、6u/ml重组人类红血球生成素(epo，)、1ng/ml il-330μm维生素c(vit-c，)、5％富血小板血浆(prp，)、15ng/ml gm-csf100ng/ml flt3及1μm地塞米松(第二阶段)。随后，将分化及去核(第三阶段)之红血球母细胞接种于单层cd146+igf1r+htert-adsc-akt(1×106)上以在再新(一半)分化培养基中进行诱导，该分化培养基含有补充有epo(10u/ml)、scf(100ng/ml)、运铁蛋白(700μg/ml，)、30μm维生素c(vit-c，)及肝素(5u/ml，)之cellgenix scgm以进行3天分化。为进行白血球过滤，接着使用60ml去白血球过滤器(immuguard iii-rc，)纯化经培养细胞。过滤后，将过滤器洗涤2次且用25ml cellgenix scgm再悬浮。将细胞在1600rpm下离心5分钟以便获得压积的rbc。如先前所述，收集培养之细胞且在4℃下储存于基于柠檬酸磷酸右旋糖腺嘌呤(cpda-1)防腐剂的溶液中4周。112.流动式细胞测量术113.为分析细胞表面标记表现，细胞用含2mm edta之pbs分离，用含有bsa(2％)及迭氮化钠(0.1％)之pbs洗涤，且接着与结合于异硫氰酸荧光素(fitc)或藻红素(pe)之各别抗体一起培育直至分析。作为对照，细胞用小鼠igg1同型对照抗体染色。用于流动式细胞测量术之针对cd34、cd36、cd45、cd71、cd146、igf1r及cd235a之抗体系购自bd biosciences。使用facscan与cellquest analysis(bd)及flowjo软件v.8.8(treestar inc.)分析细胞。结果表示为阳性染色细胞相对于总细胞数目之百分比。为定量比较表面蛋白质表现，各样品之荧光强度呈现为中值荧光强度(mfi)。核用nucred live 647(nucred，)染色。在第18-21天自cd235a+/nucred-部分计算去核率。使用fac scan与cellquest analysis(bd)及flowjo v.8.8分析资料。114.经培养细胞之细胞计数及形态分析115.分别藉由自动细胞计数器z1(beckman)及wright-giemsa染色adsc，在htert-adsc-akt中注意到akt及p-akt之表现显著增加(图1b)。重要的是，htert-adsc-akt组中存在的cd146+igf1r+上之干性表面标记的水平增强(图1b)。一致地，根据elisa，相比于htert-adsc，htert-adsc-akt之低氧预处理在条件培养基中诱导更多vegf分泌(图1c)。129.为了证明条件培养基在步骤1(第1天至第4天)中增强了细胞增殖，将分离之cd34+细胞扩增4天以增加cd34+造血干细胞(hsc)之量。制备具有htert-adsc-akt条件培养基之cellgenix scgm以补充100ng/ml之scf、100ng/ml之flt3、20ng/ml之il-3、30μm之vit-c及1μm之dex，与无条件培养基之情况相比，其诱导了高约30±1.6倍之扩增(图1d)。130.为了在步骤2(第5天至第18天)中诱导扩增的hsc分化为类红血球谱系，吾人优化了生长因子之组合及浓度，具有或不具有htert-adsc-akt条件培养基，用于离体产生人类类红血球先驱细胞，其包括补充有100ng/ml之scf、6iu/ml之epo、10ng/ml之gm-csf、100ng/ml之flt3及1μm之地塞米松以及20ng/ml之il-3的cellgenix scgm用于类红血球分化(图1d)。重要的是，添加5％人类富血小板血浆(prp)显著提高细胞产量。131.为了在步骤3(第19天至第21天)中促进经培养类红血球进一步分化及成熟，将与htert-adsc-akt共培养之经培养类红血球在补充有肝素(5iu/ml)及运铁蛋白(700μg/ml)、scf(100ng/ml)及epo(10iu/ml)之cellgenix scgm中培育，以获得更高水平之总红血球数目(图1d)。scf、epo、gm-csf、flt3及il-3与5％ prp展现经培养类红血球之显著扩增。132.实例2：自cd34+细胞放大扩增人类红血球133.藉由上文所提及之优化策略在hyperflask培养系统中进行自cb cd34+细胞以工业规模离体产生红血球生成。藉由使用约100-120公升培养基，1×105个细胞/毫升cbcd34+能够以55.0％去核率产生2.9×1011个总红血球(rbc)。cd34+细胞之细胞计数与永生化msc之细胞计数之比为约10:1。在初始培养期(步骤1，第1天至第4天)内缓慢扩增之总细胞之离体放大倍数展示于成长曲线中(图2a)。接着，在步骤2(第5天至第18天)中，细胞维持高增殖率至指数生长期(图2a)。截至第12天及第15天，细胞分别可扩增至约2.9×106倍及8.9×107倍增加。最后，在步骤3中，总细胞产生得到缓慢扩增率且截至第21-22天达到约2×108倍(1.4-2.53 108倍)之平稳段。相比于无条件培养基之情况，在有htert-adsc-akt条件培养基之情况下投与之培养方案中展现细胞产量的更多扩增(图2a)。若维持培养，则细胞生长将关于自第22-23天观测到的细胞分化及死亡而减少(资料未示出)。134.藉由wright-giemsa细胞染色及流动式细胞分析对细胞自干细胞增殖及分化为类红血球谱系进行形态检查。最初，如所预期，cd71及cd235a之类红血球标记的表现较低，而高水平之hsc标记(cd34及cd45)由分离之cd34+细胞表现(第0天)(图2b-图2c)。逐渐地，cd34+之百分比在21天分化之后显著降低至约1％-2％(图2b-图2c)。相反，cd235a之表现逐渐增加且在细胞分化之后维持高水平(图2b-图2c)。在分化细胞中，cd71之表现在第8天快速增加至峰值，且随后在分化过程之后连续下调(图2b-图2c)。最后，完全分化细胞在第21天强烈表现cd235a(90.1％±6.2％)且微弱表现cd71(54.0％±7.2％)(图2b-图2c)。藉由wright-giemsa染色进行之细胞染色依次显示细胞形态自最初的前红血球母细胞变为去核rbc；在此群体中注意到类红血球表型(图2d)。135.实例3：类红血球增殖及成熟之增强136.分化细胞之血红蛋白含量自第18至21天逐渐增加(自17.6±2.2pg/细胞至30.3±1.8pg/细胞)，以达到大致正常人类rbc之含量(27-33pg/细胞)(图3a)。此外，细胞分化之后增加之血红蛋白合成使得细胞集结粒之颜色在离心之后自白色-淡粉色变为红色(图3b)。137.在未成熟阶段至第11天期间注意到良好细胞形态，但自第18天开始观测到死细胞。最终培养日之细胞活力展示完整细胞膜(图3c)。相比于无共培养，红血球与htert-adsc-akt共培养显著增加了根据流动式细胞测量术之去核rbc率(cd235a+/nucred-)，直至第21天之平均值为54-65％(图3d)。138.实例4：较高含量的携氧能力增强之成人血红蛋白139.为了藉由流动式细胞测量术检查血红蛋白亚型，尽管cb cd34+细胞主要表现胎儿血红蛋白(hb-f)及成人血红蛋白(hb-β)两者，但相比于htert-adsc，经培养rbc在htert-adsc-akt组中主要表现更多hb-β，在第21天高达84.3±5.2％，分别与正常成人周边血液(pb)相比(图4a)。发现极少hb-f阳性细胞且hb-β+hb-f-之平均比例自第21天开始增加(图4a)。140.为了长期储存经培养rbc，将其在第28天收集且在4℃下在防腐剂溶液(cpda-1)中保存4周。在储存期间，类红血球标记及血红蛋白含量保持不变(图4b)。141.实例5：nod/scid模型中之经培养红血球(crbc)之成熟142.为调查经培养红血球(crbc)是否将在活体内成熟，吾人将在第21-23天收集之经cfse标记之成人周边血液rbc(prbc)或crbc注射至经cl2mdp-脂质体治疗之nod/scid或裸小鼠中。在注射后3天内，在两个rbc组中之小鼠之周边血液中均侦测到cfse+细胞(图5)。在注射之后3天，根据共聚焦显微镜，cfse+crbc之百分比逐渐降低且在小鼠循环中维持与cfse+prbc相同的程度。143.虽然已结合上文所阐述之特定实施例来描述本揭示，但对其之许多替代方案及其修改及变化对于一般熟习此项技术者而言将显而易见。所有此等替代方案、修改及变化被视为属于本揭示之范畴内。