MEBT／MEBO对慢性难愈合创面组织中CK14及CK19表达水平的影响

　　点击“蓝字”关注我们更多！基金项目：国家自然科学基金面上项目（81774327）；“广西特聘专家”专项经费资助项目（桂人才通字[2019] 13号）；广西 医学高层次骨干人才培养“139”计划项目资助（桂卫科教发[2018]22号）作者单位：533000  广西  百色，右江民族医学院/桂西高发病防治重点实验室（唐乾利，单云龙，李利青，唐强，岑小宁，唐 习强）；570100  海南  海口，海南省肿瘤医院普外科（舒清峰）；530001  广西  南宁，广西中医药大学研究生院2018级中医外科学专业（许彦，黄丽芳）通讯作者：唐乾利，Email：htmgx@163.com慢性难愈合创面通常是指规范治疗1个月仍未正常愈合，也无愈合趋势的创面，发病机制十分复杂，目前尚未完全明确。部分研究指出，表皮干细胞在创面修复过程中发挥着关键作用，且细胞角蛋白（CK）在表皮干细胞参与创面修复过程中的作用显著。如，早在20年前徐荣祥教授就证实了CK19型干细胞参与创面的再生修复，且其创立的皮肤再生医疗技术（MEBT/MEBO）的核心药物湿润烧伤膏（MEBO）能够激活CK19型干细胞是该药物促进烧伤创面愈合的主要作用机制。近年来，唐乾利等将MEBT/MEBO应用于慢性难愈合创面的治疗，并在开展的大量临床及实验研究中证实了其显著的临床疗效。本研究为进一步探讨MEBT/MEBO促进慢性难愈合创面修复的部分分子生物学作用机制，对比分析了MEBT/MEBO对大鼠慢性难愈合创面组织中CK14及CK19表达水平的影响。1  材料与方法

　　1.1  实验动物

　　健康12周龄SPF级Wistar雄性大鼠90只，体重（220±20）g，均由长沙市天勤生物技术有限公司提供，饲养环境及运输与实验过程严格按照SPF级要求执行，环境湿度控制在（60±10）%、温度控制在（25±2）℃，空气流通良好，卫生条件达标。本实验经右江民族医学院动物伦理委员会批准，符合动物实验的伦理学要求。1.2  主要试剂

　　MEBO：汕头市美宝制药有限公司生产，国药准字Z20000004；重组牛碱性成纤维细胞生长因子（rb-bFGF）凝胶：珠海亿胜生物制药有限公司生产，国药准字S19991021；水合氯醛：泰兴市豪申化工贸易有限公司生产，CAS登记号302-17-0；醋酸氢化可的松注射液：上海通用药业股份有限公司生产，国药准字H31021400；一抗稀释液、二抗稀释液：上海碧云天生物技术有限公司生产，货号P0023A、P0265；Anti-CK14-Antibody：英国Abcam公司生产，货号LS-C210317；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔（100 μL）、β-actin（100 μL）：北京中杉金桥生物技术有限公司生产，货号ZB-2301、TA-09。1.3  实验方法

　　1.3.1  实验分组与造模

　　大鼠于SPF级动物实验室饲养1周后，按照随机数表法将其随机分为空白组、急创组、慢创组、rb-bFGF组及MEBO组，每组18只，空白组大鼠仅做背部3.0 cm×3.0 cm的备皮处理；急创组大鼠予以4 mL/kg 7%水合氯醛腹腔注射麻醉后，背部行3.0 cm×3.0 cm的备皮处理，并于备皮处做直径1.5 cm深达筋膜的圆形全层皮肤及皮下组织缺损创面；慢创组、rb-bFGF组及MEBO组大鼠在急创组处理的基础上，肌肉注射醋酸氢化可的松注射液（80 mg/kg）建立慢性创面模型。1.3.2  换药方法

　　空白组大鼠备皮处皮肤及急创组与慢创组大鼠创面常规消毒3次后，依次覆盖生理盐水纱布及清洁敷料，胶带固定，每天换药2次；rb-bFGF组大鼠创面常规消毒3次后，均匀涂抹rb-bFGF凝胶（60 U/cm2），并依次覆盖生理盐水纱布及清洁敷料，胶带固定，每天换药2次；MEBO组大鼠创面常规消毒3次后，均匀涂抹MEBO（0.2 g/cm2），并依次覆盖生理盐水纱布及清洁敷料，胶带固定，每天换药2次。1.3.3  标本采集

　　分别于局部处理第3、7、14天，每组随机选取6只大鼠进行腹腔注射麻醉后，于备皮处皮肤及去痂后的创面边缘0.5 cm处切取创面组织并均分为2份，1份置于装有10%甲醛的EP管中固定并进行石蜡包埋；1份置于冻存管中存放于液氮中，-80 ℃冰箱内保存备用。1.3.4  病理检查

　　取石蜡包埋组织切片后行Masson染色，并于电子显微镜下观察各组大鼠皮肤或创面组织中炎性细胞分布、成纤维细胞分布、新生血管排列及皮肤附属器形成等组织形态学变化情况。1.3.5  Western blotting技术检测CK14及CK19蛋白表达水平取冷冻组织用匀浆器磨碎后，于低温环境中加入组织裂解液，提取总蛋白，并用紫外分光光度计测定总蛋白浓度，绘制蛋白浓度标准曲线；取蛋白上样与SDS-PAGE蛋白上样缓冲液混匀后在100 ℃下加热5 min进行蛋白变性，并置于-20 ℃冰箱中保存；SDS-PAGE凝胶制作后加入等体积蛋白上样于100 V恒压电泳、250 mA恒流转膜、封闭后，置于4 ℃环境下孵育一抗过夜；一抗孵育后，PBST洗膜3次，然后加入二抗，室温下孵育60 min；二抗孵育后，PBST洗膜3次，并曝光显影；最后，通过Image J图像分析软件分析蛋白条带灰度值。1.3.6  RT-PCR技术检测CK14及CK19 mRNA转录水平

　　取备用组织样本采用Trizol法提取RNA，并分别检测其在260 nm及280 nm波长的吸光度值，A260/A280值在1.8～2.0之间视为RNA提取合格；然后，严格按照TIANScript RT KIT试剂盒说明书逆转录合成cDNA，并采用Real Time PCR反应体系，以cDNA为模板进行PCR扩增。引物序列：CK14上游为5’-GCAGCCGTCAGTTCCTCCT-3’，下游为5’-CCCCACCATAGCCACTTCCAA-3’；CK19上游为5’-GGTGGAAGTTTTAGTGGGGC-3’，下游为5’-CAAGTAGGAGGCGAGGCGAT-3’；β-actin上游为5’-GGCACCACACCTTCTAC-3’，下游为5’-CTGGGTCATCTTTTCAC-3’。采用2-△△Ct法计算目的基因的相对表达量。1.4  统计学处理

　　应用SPSS 22.0统计软件对所得数据进行统计学分析，计量资料以均数±标准差表示，多个样本间比较采用单因素方差分析（方差齐采用LSD法，方差不齐采用Games-Howell法），均以P＜0.05为差异具有统计学意义。2  结果

　　2.1  Masson染色结果分析

　　空白组大鼠各时间点皮肤组织细胞分布情况无明显差异。局部处理第3天，急创组、慢创组、rb-bFGF组及MEBO组大鼠创面组织中均可见组织明显水肿及炎性细胞广泛浸润，且仅可见少量新生血管，4组间无明显差异。局部处理第7天，急创组、rb-bFGF组及MEBO组大鼠创面组织形态学差异不明显，均可见大量新生血管及部分不完整毛囊结构，炎性细胞均明显减少，而慢创组大鼠创面组织中新生血管相对较少，组织水肿及炎性细胞浸润情况无明显改善，且未见皮肤附属器形成。局部处理第14天，急创组、rb-bFGF组及MEBO组大鼠创面组织中均可见排列整齐的新生血管及毛囊、皮脂腺等皮肤附属器，组织形态接近正常，而慢创组大鼠创面组织中仍可见少量炎性细胞浸润，部分区域可见大量成纤维细胞，逐渐形成瘢痕组织形态（图1）。

　　2.2  CK14、CK19蛋白表达及其mRNA转录水平对比

　　局部处理第3、7、14天，急创组、慢创组、rb-bFGF组及MEBO组大鼠创面组织中CK14蛋白表达及其mRNA转录水平均呈逐渐升高的趋势，且局部处理第3天均低于空白组（P均＜0.05），而4组间无明显差异（P均＞0.05）；局部处理第7天4组仍低于空白组（P均＜0.05），而急创组、rb-bFGF组及MEBO组均高于慢创组（P均＜0.05），但3组间无明显差异（P均＞0.05）；局部处理第14天急创组、rb-bFGF组及MEBO组均升高至空白组水平（P均＞0.05），而慢创组仍低于其它各组（P均＜0.05），详见表1、图2。

　　局部处理第3、7、14天，急创组、慢创组、rb-bFGF组及MEBO组大鼠创面组织中CK19蛋白表达及其mRNA转录水平均呈先升高后降低的趋势，且局部处理第3、7天4组均高于空白组（P均＜0.05），而急创组、rb-bFGF组及MEBO组又均高于慢创组（P均＜0.05），但3组间无明显差异（P均＞0.05）；局部处理第14天急创组、rb-bFGF组及MEBO组均降低至空白组水平（P均＞0.05），而慢创组仍高于其它各组（P均＜0.05），详见表2、图3。

　　

　　3  讨论

　　慢性难愈合创面是机体正常微结构被破坏后正常修复程序停滞而导致的创面经久不愈。近年来部分研究证实，表皮干细胞具有强大的增殖及多向分化能力，能够根据机体需要进行增殖分化，以满足表皮自我更新的需求，在创面修复过程中发挥着关键作用，且CK在表皮干细胞参与创面修复过程中的作用显著。如舒清峰等的研究显示，MEBT/MEBO可通过调节慢性难愈合创面组织中CK10的表达水平而促进创面的再生修复。鉴于此，笔者为进一步探讨MEBT/MEBO促进慢性难愈合创面修复的部分分子生物学作用机制，于本研究中对比分析了MEBT/MEBO对大鼠慢性难愈合创面组织中CK14和CK19表达水平的影响。相关研究显示，CK14表达于基底层细胞并随着基底层干细胞不断增殖分化为基底上层细胞，且其表达水平也随之不断升高；CK19在创面修复过程中与瘢痕组织的形成密切相关。本研究结果显示，在正常皮肤组织中CK14及CK19的表达水平较为稳定，而在急性创面组织中CK14的表达水平呈现出逐渐升高并趋于正常的趋势，CK19的表达水平呈现出先升高后降低至正常的趋势。可见，CK14及CK19均参与了创面的修复。另外，本研究结果显示，创面修复过程中急创组、rb-bFGF组及MEBO组大鼠创面组织中CK14表达水平始终高于慢创组，而CK19表达水平则是在创伤修复早期高于慢创组而晚期又低于慢创组。分析其原因可能与CK14参与干细胞的增殖分化而CK19参与瘢痕组织的形成，且慢创组创面更易形成瘢痕组织有关。此外，CK14及CK19在各组大鼠创面组织中的变化规律及创面组织的形态学改变也足以证明，MEBT/MEBO对慢性难愈合创面具有促愈合作用，对创面组织中CK14、CK19具有调控作用，且其作用效果与已证实的对慢性难愈合创面具有促愈合作用的rb-bFGF凝胶相似。综上所述，MEBT/MEBO能够促进慢性难愈合创面愈合，且调控创面组织中CK14及CK19的表达水平可能是其部分作用机制。值得注意的是，已证实在创面修复过程中起到重要作用的PTEN/AKT信号通路是否能够影响CK14及CK19的表达，以及角蛋白家族其他成员是否也参与了创面的修复过程仍需深入研究探讨。（参考文献略）

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