血浆tie 2是转移性结直肠癌中VEGF抑制剂的肿瘤血管反应生物标志物

　　Tie2而不是CK18的变化反映了肿瘤血管控制( Ktrans )。通过对Tie2轨迹( a )的无监督分层聚类，确定了两组(或多个)患者。在一个队列中，第二层有一个立即但短暂的减少(虚线)，而在另一个队列中有一个稍后但更持续的减少(实线)。两组的表现有显著差异( P = 1.8×106，Mann - Whitney U检验)。相似的患者组用Ktrans值( b )确定，这再次表现出明显不同( P = 0.003，Mann - Whitney U检验)。CK18的行为模式不同( c )，两组之间没有显著差异( P = 0.18，Mann - Whitney U检验)。这表明Tie2反映贝伐单抗对肿瘤血管系统的影响。误差条表示标准误差。d显示了一个Ktrans参数图的例子，它反映了两个群的肿瘤行为，如b所示。参数图中最大的差异可以在两个中间位置图中看到，这对应于两个群衍生曲线之间的最大差异。CK18；细胞角蛋白18；内皮转移常数

　　我们的数据11，12和其他2，3，6证明Tie2是VEGF抑制剂的泛肿瘤血管PD生物标记。由于ag2 - tie 2途径与介导16、18、19血管生成密切相关，我们假设那些在tie 2中VEGFi诱导的最大和最长时间减少的患者应该表现最好，反之亦然。

　　作为分析tie 2预后意义的第一步，我们测试了tie 2无监督聚类分析(图3a )中定义的两组患者与被确定为具有独立预后意义的治疗前临床和生物标记参数( VEGF - R2与Ktrans比率；第一部分结果)。尽管tie 2曲线(图3a )与治疗前临床预后因素无关，但与VEGF - R2与Ktrans比率( p = 0.014，Fisher精确测试，补充表1 )有显著关联，其中比率较高的患者tie 2减少较少。因此，有一组患者的PFS较短(图2b :中位PFS 248与348天，p = 0.0008，Log rank test )。进展小时: 3.01，p = 0.00014，Wald检验)。由于VEGF - R2最有可能来源于反映肿瘤微血管体积的内皮床，肿瘤Ktrans和Ang / Tie2轴是反映肿瘤对VEGF抑制剂敏感性的生物标志物，这意味着最差的预后组携带通过非VEGF依赖性途径实现血管生成的肿瘤。

　　在确定了更好和更差的预后组后，我们评估了每组对贝伐单抗的肿瘤体积反应。预后不良组WTV无变化，但预后较好的患者WTV显著降低( p = 0.029，Mann - Whitney U检验，图4a )。贝伐单抗单药治疗后4天内，这些差异明显。在为期两周的贝伐单抗治疗周期结束时，疗效良好的患者的WTV平均降低到治疗前水平的82 % ( 95 % CI : 47 - 143 % )。然后我们根据随机化和进展/检查日期之间经过的百分比时间( % PFS )分析肿瘤体积变化。这项分析显示，在贝伐单抗和细胞毒性化疗联合治疗的整个临床过程中，肿瘤反应存在显著差异( p = 0.012，Mann - Whitney U检验，图4b )。

　　血管生成生物标志物的预后价值。Tie2降低幅度较小与高erktrans : VEGFR 2比值之间的关联(图2b )确定了一个预后不良的组。将该预后不良组的DCI - MRI衍生的WTV (虚线)与预后较好组(实线)进行比较。a显示单剂贝伐单抗( 10毫克/千克)在治疗后15天内对两组WTV的不同影响，第4天出现影响( P = 0.029，Mann - Whitney U检验)。b容量分析显示，在细胞毒性化疗和贝伐单抗联合治疗的整个过程中，这种差异持续存在，使用相同组绘制的WTV变化与随机化和进展/检查日期之间经过的时间百分比( % PFS；p = 0.012，曼-惠特尼U检验)。误差条表示标准误差。世界电视；肿瘤体积；动态增强磁共振成像；血管内皮生长因子受体2，PFS；无进展存活

　　最后，我们评估了贝伐单抗随后加入细胞毒性化疗对新血管生物标志物网络的影响。细胞毒性化疗对循环生物标志物、成像生物标志物或循环与成像生物标志物之间的相关性没有进一步显著影响(补充图4 )。

　　我们以前的卵巢癌研究11、12提供了生物标记数据，表明血管和上皮细胞是抗癌治疗的附加靶点。因此，我们研究了与临床试验数据7、20、21、22、23、24相同关系的结直肠癌数据，这种模型将建议肿瘤血管和上皮组织隔室应针对通常用细胞毒性化疗和VEGFi治疗的血管敏感癌症的每一次临床复发。

　　数据显示贝伐单抗在tie 2、ang 2和肿瘤转移之间建立了关联，对tie 2的影响反映了肿瘤中的血管变化、体积反应和PFS。然后，我们确定上皮和血管间隔的变化是否相互独立。该分析基于生物标记数据中拐点的识别，其中，例如，诸如tie 2的参数随着时间的推移而减小，然后开始增大。这种贝叶斯分层建模方法允许评估用于计算拐点的不同数学规则，拐点被认为是推断生物学中的变化。在tie 2的情况下，拐点表示血管进展，而在CK18的情况下，拐点表示上皮进展。这种方法也产生了假定的规则，随后可用于临床决策。

　　我们将上述相关的两个时间点分析的评估扩展到对Tie2 (肿瘤转移)和上皮生物标志物CK18的更广泛和动态的分析。在这里，我们使用了无监督的层次聚类分析，以避免将患者任意分类为早期和晚期应答者。这项分析将患者分成两组，每组有不同的Tie2轨迹(图3a，p = 1.8×106，Mann - Whitney U检验)。对于相同的集群定义的群体，我们绘制了肿瘤Ktrans (图3b，p = 0.003，Mann - Whitney U检验)和CK18 (图3c，p = 0.18，Mann - Whitney U检验)的轨迹，显示tie 2 (图3a )的集群定义的行为与肿瘤Ktrans (图3b )非常相似，而不是CK18 (图3c )。因此，由于贝伐单抗在治疗开始后不久诱导Ktrans和tie 2之间的相关性，并且两个tie 2簇的轨迹反映了肿瘤Ktrans而不是CK18的变化，数据暗示tie 2反映了贝伐单抗诱导的肿瘤血管调节。这一点很重要，因为我们的数据11、12和其他2、3、6的PD数据表明，Tie2变化是血管源性的。这里，成像数据暗示Tie2信号源自肿瘤脉管系统或至少通过肿瘤脉管系统相关的细胞谱系。这一发现与文献记载的vessel 18中tie 2的表达及其由VEGF 4，5调节的已知数据一致。

　　用血浆CK18和Tie2水平预测疾病进展。该图显示了Tie2、细胞角蛋白18 ( CK18 )和两种生物标志物一起建模预测疾病进展的潜力。CK18单独的预测显示为浅灰色，tie 2单独的预测显示为中灰色，并且使用CK18和tie 2的组合显示为黑色。a基于实际数据显示预测，其中组合的生物标记预测了66 %的患者的进展，而54和41 %的患者实现了进展性疾病的单个生物标记预测。有趣的是，由于第二层生物标志物的增加早于第十八层生物标志物的增加，因此从CK18得出的预测比第二层生物标志物的预测晚，提前了50天( 14 % PFS )。b显示相同的计算，但使用模拟来填充任何缺失的数据。同样，当tie 2和CK18联合用于预测时，观察到预测的数量显著增加( p < 0.0001，Mann - Whitney U与任一单个抗原相比)，揭示了两种生物标志物在预测进行性疾病方面的可加性的明确证据。误差条表示标准误差。CK18；细胞角蛋白18，PFS；无进展存活

　　在复杂的临床数据集中，经常会有一些缺失的数据。贝叶斯分层建模方法允许插值来模拟丢失的数据并提供“完整”数据集。模拟数据显示，组合生物标志物能够预测77 %的患者的进展，这超过了缺少数据点的实际数据的结果。这一发现再次表明，tie 2和CK18组合生物标志物的预测结果提供了比单独的生物标志物更好的性能( p < 0.0001，Mann - Whitney U检验)。此外，我们发现了血管和上皮细胞的进展时间之间的时间脱节的证据。在整个队列中，tie 2预测CK18之前的进展，平均提前50天( p = 0.026，Mann - Whitney U检验)。

　　总之，这些数据表明，RECIST定义的PD可以通过反映血管进展和上皮进展的多峰生物标志物的组合得到最好的预测。因此，上皮和血管生物标记数据在一起考虑时改进了进行性疾病的建模，支持了两个组织区室可能是疾病复发患者的初始呈现和再治疗治疗的有效目标的假设(图6a )。

　　a生物标记数据显示，Tie2是VEGFi的肿瘤反应生物标记，血管生物标记数据的预测值增加了上皮生物标记数据，以改进进行性疾病的建模。结合我们以前在卵巢癌方面的资料，这些发现的含意是，血管和上皮隔室是治疗实体肿瘤每次复发的独特、有效和有用的概念。个别患者数据的示例显示在B- e中；x轴表示患者接受治疗直到他们发展到累及定义的进展(即肿瘤总负担)的天数，tie 2数据以实线显示，CK18以虚线显示。两种生物标志物的单位为pg / ml。b患者32经历了上皮反应、血管反应、上皮进展和血管进展。在c中，患者有上皮反应，但没有血管反应，因此患者在治疗约8周后可以停止贝伐单抗。患者随后出现上皮和血管进展。在d中，患者具有上皮和血管生物标记反应，然后发展成血管进展，而不是上皮生物标记进展。在e中，患者获得上皮和血管反应，随后上皮进展而不是血管进展，这表明脉管系统仍然被控制在复发进展点。CK18；细胞角蛋白18，血管内皮生长因子；血管内皮生长因子抑制剂；实体瘤的反应评价标准

　　综合这些数据，我们确定了一组PFS明显恶化的患者。患者肿瘤的特点是治疗前VEGF - R2 toKtrans比率高，单次服用贝伐单抗两周后肿瘤体积没有缩小，以及短暂的贝伐单抗诱导的血管控制，这反映在tie 2减少的深度和持久性较低。数据显示，预后不良组患者的肿瘤对VEGF信号依赖性较小。

　　从单个患者数据(图6b - e )来看，很明显，一些患者在血管、上皮或两个隔室中发生组织隔室进展，这是通过常规RECIST定义的疾病进展来实现的。tie 2带来的进步是，如果没有tie 2定义的反应或tie 2报告的进展发生，VEGFi可以比常规管理更早地停止。另一方面，通过CK18增加定义的上皮生物标记进展有时可以先于Tie2定义的血管生物标记进展。这样的患者可能受益于持续的VEGFi，超过了累及的进展，因为他们可能经历显著减缓的肿瘤生长，持续到Tie2定义的血管生物标志物进展发生。

　　抗血管生成的VEGFi在肿瘤学中被广泛使用，但由于缺乏生物标志物来优化其临床应用，其有效使用受到了影响。在此，我们研究了70名转移性结直肠癌患者在接受贝伐单抗治疗、随后接受细胞毒性化疗和贝伐单抗治疗期间的一组19种循环生物标志物和9种成像生物标志物。使用无监督统计方法分析数据，以避免多重比较的混杂，并避免生物标记模式的任意分类。虽然其他生物标记物发生了变化并具有潜在的意义，但我们注意到tie 2，因为单剂贝伐单抗诱导了Ang2、tie 2和ktrans之间的相关性，而其他几个生物标记物之间的关系没有改变或减弱。

　　这种方法使我们能够证明tie 2是转移性结直肠癌患者贝伐单抗的肿瘤血管反应生物标记。影像学资料显示，实体瘤Tie2生物标志物信号来源于肿瘤血管系统，具有临床意义。由于我们现在已经证明了循环tie 2在卵巢11、12和结肠直肠癌中的价值，当用贝伐单抗-细胞毒性化疗组合和其他方法治疗患者时，在VEGF RTKi、cediranib的试验中描述了结肠直肠癌3、胶质瘤2和胆囊腺癌6中的类似发现，tie 2是VEGF抑制剂的通用循环肿瘤血管反应生物标记物是可信的。因此，我们对tie 2作为VEGF抑制剂的一般反应生物标记物的信心因四种肿瘤类型中的这些发现而增强，在至少两个不同的实验室中使用两种不同类别的VEGF抑制剂2、3。

　　我们的发现也为支持tie 2分析的临床翻译提供了一些关键数据。Tie2治疗前浓度在患者体内的微小变化提供了分析精度的证据，增强了对该生物标志物潜在临床应用的信心。此外，我们已经显示，血管反应可以被定义为Tie2浓度的确认减少超过30 %，而血管进展的生化定义是血浆Tie2浓度在最低点以上增加超过40 %。现在可以在独立的数据集上正式测试这些标准对临床决策的适用性，以帮助制定用于解释临床认可的Tie2分析的指南。

　　接受tie 2的临床价值，下一个问题是tie 2定义的血管进展是否反映了ang 2 / tie 2在介导VEGF抑制剂抗性方面的功能作用4。这是至关重要的，因为虽然我们知道单个药物Ang / Tie2抑制剂在临床上是活性的8，但是大多数Ang / Tie2抑制剂的III期试验没有根据生物标志物选择患者，并且迄今为止的结果仅仅是适度阳性的10。生物标记导向试验可以检验这一假设。已经描述了几种抗VEGF的机制25，研究表明获得性抗VEGF抑制剂可能是由巨噬细胞介导的26、27、28。因此，关于Ang - tie 2轴在影响VEGFi抗性中的假定作用的另一个假设是，获得性VEGFi抗性是通过tie 2表达或调节的单核细胞/巨噬细胞介导的。这一替代假设与我们观察到的ag2和Tie2之间的相关性一致，这可能反映了血管进展点29处局部ag2介导的Tie2表达巨噬细胞的募集。此外，最近的一份出版物显示，巨噬细胞介导的对VEGFi的抗性可以通过在体内施用巨噬细胞CSF - 1受体30的抑制剂来逆转，这潜在地突出了当Tie2增加时克服对VEGFi抗性的策略。在某种程度上，关于不同细胞类型在介导VEGFi抗性中的功能作用的问题，只能通过对一系列肿瘤活检的详细和有根据的研究来回答。

　　根据这些生物标记定义的反应和进展规则，总结了循环CK18和tie 2预测的肿瘤进展，以确定整个队列水平的行为。至关重要的是，从这两种生物标志物获得的实际数据进行预测的性能( 66 % )优于单独使用两种生物标志物的性能；54 %和41 %，分别见图5a )。

　　进一步推断，癌症护理的“多隔室”模式可能在适当时候包括代表“癌症特征”的许多其他表型隔室，如Hanahan和Weinberg32所描述的，包括激活侵袭和转移以及避免免疫破坏。因此，就像我们的数据显示，在血管敏感癌症的每一次复发中，都应该考虑使用和重复使用VEGFi，使用tie 2来指导治疗一样，同样的原则最终也可能适用于癌症患者一生中的免疫治疗。

　　对治疗前患者内部变化的估计表明，Tie2和CK18的95 % CI分别为0.53和0.42 ( log2量表，补充图3 )。因此，在治疗的前3个周期中，当血浆浓度降低至少30 %时，可以推断出Tie2定义的血管反应。我在真理教的日子2 CK18报告的上皮反应可以在这段时间内，当血浆浓度降低至少25 %时推断出来。贝叶斯分层建模方法显示，血浆CK18和Tie2的最低浓度分别增加50 %和40 %，表明疾病进展(图6b - e；补充图5 )。

　　合格患者的表现状态为0 - 2岁，年龄在18岁以上，预期寿命在12周以上。需要足够的骨髓、肝和肾功能，包括尿检上的蛋白尿< 2 +。INR和APTT最大值是正常值上限的1.5倍。符合条件的患者必须患有可测量的疾病( 3厘米或更高)，并可接受扩散加权MRI ( DW - MRI )和动态增强磁共振成像( DCE - MRI )。影像学聚焦于直径在3到10厘米之间的肝转移。排除标准包括先前治疗转移性疾病(至少12个月前允许辅助治疗)、脑转移、脊髓压迫、不受控制的间期疾病、孕妇或哺乳期妇女以及手术、首次治疗前4周的严重损伤或放射治疗。以前用VEGF途径抑制剂治疗是不允许的，高血压患者被排除在外。排除前6个月内有临床显著心血管疾病或血栓栓塞的患者。出血性素质患者、每日服用阿司匹林325毫克或以上的患者以及前4周开始抗凝治疗的患者均不合格。其他排除标准包括过去5年中的另一种恶性肿瘤、二氢嘧啶脱氢酶缺乏症、伤口/骨折不愈合、先前存在的二级神经病和未控制的肠道疾病。

　　这项研究( EudraCT 2009 - 011377 - 33 )由克里斯蒂NHS信托基金赞助，NHS健康研究局国家研究伦理服务局、西北大曼彻斯特中央伦理委员会(参考09 / H1008 / 99 )批准了伦理。所有患者均提供书面知情同意书。

　　患者在首次服用贝伐单抗前两周接受了两次治疗前扫描，分别为DW - MRI和DCE - MRI。同时，抽取两个6毫升血样，对循环生物标志物的治疗前血浆浓度进行量化。这些样本用于建立成像和循环生物标记数据的可重复性，并产生95 %的置信区间，该置信区间将定义治疗是否对每个生物标记产生统计学上显著的影响34。

　　所有生物标记研究都是由对临床人口统计和结果数据不了解的工作人员进行的。进行DW - MRI和DCE - MRI，并在治疗前和治疗过程中抽吸血浆样品，直到诊断出进行性疾病(表1 )。生物标记时间表和方法在补充方法1中描述。

　　将用于测量血管生成相关分析物的血样直接抽取到6 ml乙二胺四乙酸( EDTA ) vacutainers中，并通过3000×g离心10分钟分离血浆。立即抽吸血浆，分离成等分试样，并在实验室中立即在最高20℃和80℃下冷冻。每次分析仅解冻样品一次，一式三份。酶联免疫吸附测定( ELISAs )是使用探照灯化学发光阵列和探照灯加电荷耦合器件成像系统(美国波士顿Aushon biosystem )进行的。这些多重分析允许在九十六孔板的每个孔中定量多达六种不同的蛋白质。所有分析均在英国曼彻斯特癌症研究所临床和实验药理学组实验室按照良好临床实践( GCP )标准进行，并如前所述进行了内部验证36。使用ag2、FGFb、HGF、PDGFbb、VEGF - 我在真理教的日子2和VEGF - C的6 - plex ELISAs和IL6、IL8、KGF、PlGF、VEGF - R1、VEGF - R2评估蛋白质浓度；Ang1和tie 2、E -选择素和VCAM - 1的双链体，以及VEGFD和sd1β的单链体。细胞角蛋白18的M65 ELISA ( Peviva，Bromma，瑞典)用于定量以前显示为结肠直肠癌肿瘤负荷生物标志物的上皮细胞死亡总数37。生物标志物一般遵循对数正态分布(补充图1 )。因此，他们的纵向变化以log2量表进行调查，以减少患者固有的生物标志物变化。这些蛋白质的技术变化和治疗前患者体内变化基于两次技术重复测量或两次连续治疗前测量的log2转化比率来估计。

　　我们的研究与上面引用的其他研究一起表明，tie 2是一种通用的VEGFi反应生物标记，但应该承认一些注意事项。tie 2变化的机制还没有在微观水平上确定，尽管鉴于从高级成像中获得的宏观证据，这不应减损生物标志物的潜在临床效用。迄今为止，只有数百名患者为这些检测提供了样本，这些患者都是从同时评估多种潜在生物标志物的临床试验中招募的。现在需要在更大的人群中进行真实世界的评估，以确定化验的临床价值。此外，虽然我们已经将血管反应定义为Tie2降低了30 %以上，但研究的持续时间尚不清楚，尽管现有数据显示，这种效应应该在开始治疗的9周内出现。

　　DCE - MRI数据使用内部软件曼彻斯特动态建模(英国曼彻斯特马迪姆)进行分析。使用Java图像软件( JIM version 5.0，新帕西系统有限公司，英国)并参考T1和T2加权图像以及DCE - MRI图像，为整个肿瘤体积手动定义感兴趣区域( ROIs )。动脉输入功能( AIF )使用应用于最近的供血动脉39的自动技术为每次患者就诊确定，并针对患者血细胞比容进行校正。使用个体患者治疗前血细胞比容读数。报告的参数包括整个肿瘤体积、增强体积、增强分数、造影剂浓度曲线下最初60秒内的肿瘤中值( IAU 6040 )、使用扩展Kety模型41导出的内皮转移系数( Ktrans )、血浆分数体积( VP )和细胞外血管外空间分数体积( ve )以及肿瘤预造影纵向弛豫时间T1。通过拟合数据来分析DW - MRI，以获得水表观扩散系数( ADC )。通过使用 ( { { S } } left ( b right ) = { { S } } _ 0 x e { - b x { ADC } } )对扩散加权图像数据进行体素拟合，计算每个ROI中ADC的体素估计。生成ADC图并计算肿瘤ADC中值，以总结每个肿瘤。

　　研究计划招募70名可评估患者，理由是，根据第70名和最后一名患者进入研究后一年累积的数据( 90 %事件率)，生物标记数据的分析将具有80 %的能力来检测无进展存活中危险比率至少为2的生物标记分层组，使用5 %显著水平的Cox比例危险回归分析。

　　所有生物标记物的网络分析在治疗前、联合治疗的前两周和长达6个月期间进行，以识别生物标记物之间相关性的药物诱导变化(“R 3.243中的qgraph”package 42 )，同时避免多重比较的混淆。这将注意力集中在tie 2上，然后对tie 2的时间历程进行聚类，并与基于相同聚类的其他生物标记数据进行比较，以确定tie 2信号的来源。比较两个第二层定义的患者群的PFS。在证明了Tie2信号的血管来源后，我们通过适当的比例和非线性检验，在Cox比例风险模型中检验了每个生物标记物的预后意义。确定的生物标志物确定了一组预后明显不良的患者。检查这些患者在治疗期间的肿瘤体积和Tie2轨迹。生物标记物的轨迹使用贝叶斯方法建模，以确定生物标记物的行为在治疗期间改变的拐点。然后，这被用来确定生物标记进展发生的时间，然后评估上皮和血管隔室模型与进展性疾病的相加值。

　　一线、二线和三线抗结直肠癌/铂卵巢癌设置7、20、21、22、23、24、31的随机试验显示，在细胞毒性治疗中加入VEGF途径抑制剂改善了pf1。问题是如何利用这里得到的信息来改进VEGF抑制剂的使用，从而将PFS中的这些改进转化为改进的操作系统。在这项研究中，我们已经证明了在癌症患者中建立上皮和血管隔室模型的独立和附加价值。临床试验结果和我们现在验证的模型强调了将血管系统作为以前用抗血管生成剂治疗的患者的再治疗目标的重要性。与其将抗血管生成剂限制在最初出现，还不如在血管敏感肿瘤中建立和维持这些药物，直到进展性疾病的每一期出现Tie2定义的血管进展。

　　相关性分析将注意力集中在第二层，因此我们使用无监督的层次聚类方法(基于相关性)来探索第二层轨迹之间的最大分离。聚类分析的无监督性质意味着没有使用预定义的阈值。这两组tie 2定义的患者的特征在于: ( 1 )用卡方检验研究他们( 1 )与治疗前的临床因素的关联；( 2 )治疗前生物标志物水平差异；( 3 )治疗期间循环生物标志物的轨迹差异；( 4 )影像学和上皮生物标志物的轨迹差异，以了解Tie2的生物学相关性。

　　这项研究于2009年6月15日获得曼彻斯特研究伦理委员会国家研究伦理服务局的批准( REC Reference 09 / H1008 / 99 )。这项研究已向欧盟委员会登记(编号2009 - 011377 - 33 )。这项研究是按照相关的伦理准则进行的，所有患者在参加这项研究之前都获得了书面知情同意。在这项前瞻性试验中，70名新诊断为转移性结直肠癌的患者接受贝伐单抗10毫克/千克的治疗，以确定药物特异性生物标记物特征，两周后，福尔福克斯- 6或XELOX接受贝伐单抗，剂量强度为2.5毫克/千克/周，直到进展性疾病发生；主要端点。所有患者接受贝伐单抗，剂量强度为2.5毫克/千克/周，同时接受奥沙利铂和氟嘧啶( 5 -氟尿嘧啶，5FU )的联合治疗，这是基于no . 16966试验区域33的FOLFOX - 6版本。简而言之，对于有中心静脉导管的患者，奥沙利铂85毫克/平方米、亚叶酸175毫克和贝伐单抗5毫克/公斤作为短期输注给药。然后给药5FU 400毫克/平方米，然后在46小时内给药5FU 2400毫克/平方米。这是按每周两次的时间表进行的。对于没有中心静脉导管的患者，奥沙利铂130毫克/平方米，贝伐单抗7.5毫克/公斤，每3周静脉注射一次，口服卡培他滨1000毫克/平方米BD，每21天注射14次。剂量调整是根据三级或四级不良事件通用毒性标准( CTC AE )的局部方案进行的。根据RECIST 1.0，每12周对肿瘤进行放射评估。如果奥沙利铂因毒性而停药，患者可以继续使用5FU和贝伐单抗治疗。患者在2009年至2012年期间被招募，并随访至2016年。

　　为了避免估计值受到少数具有极端生物标记测量的患者的过度影响，使用自举重采样方法验证了导出模型。该方法通过随机抽样具有替换的数据47来更真实地估计变量的分布。对于每个模型，生成1000个自举样本，并记录候选生物标记的显著性的相对频率。保留在最佳模型中的生物标志物的相对频率必须超过66 % (三分之二的情况下显著)；自举分析中使用的典型阈值。

　　tie 2轨迹的聚类分析确定了与更差PFS相关的tie 2模式。独立的Cox比例危险分析确定了其治疗前值与更差PFS相关的生物标志物。没有预先定义截止值，以避免数据过度拟合和多次比较。因此，这两项分析中PFS较差的患者分组是不同的。我在真理教的日子2卡方检验用于调查这两项分析是否确定了一组PFS更差的患者。

　　在第1天给予我在真理教的日子2第一剂贝伐单抗10毫克/千克，并在第3天、第8天(仅成像)和第15天收集进一步的成像和循环生物标记样本，这是在我们之前的工作35 (表2 )的指导下进行的。第15天，在生物标记物收集之后，开始奥沙利铂-氟嘧啶细胞毒性治疗，并在第22天(贝伐单抗联合细胞毒性治疗第一周期的7天)、第6周、第6个月和疾病进展时收集进一步的成像和循环生物标记物。

　　使用贝叶斯分层建模方法从实际数据而不是插值数据12来建模所选生物标记的轨迹。简而言之，生物标记浓度的变化被近似为与治疗时间具有分段线性关系，其中拐点将生物标记轨迹的减少部分与随后增加的成分分离。从临床角度来看，拐点被假设为反映肿瘤行为的变化，因此是肿瘤进展的最早迹象。这种贝叶斯建模方法允许估计个体患者和群组的肿瘤行为改变的时间点。它还提供了对缺失数据点的自然容忍。这将在下面进一步描述

　　对于每个生物标记物，通过对从两个治疗前样本计算的变异拟合正态分布来计算其患者内变异的95 %置信区间。这里，在三个治疗周期内，当假定反应生物标记物的减少超过95 % CI时，血管反应被认为已经发生。在治疗过程中，如果生物标记物的升高超过了记录最低点的指定界限，则认为发生了血管进展。通过伪试验的推理，利用所开发的贝叶斯模型确定最佳截止点。模型开发和数据推断的全部细节可以在下面找到。根据上述规则评估所选生物标志物预测肿瘤进展的潜力，然后我们计算进展性疾病被正确预测的患者百分比和预测时间。评估是通过( 1 )使用实际生物标记数据和( 2 )使用模拟贝叶斯模型中缺失数据点的数据来进行的。比较不同生物标记物的性能，以探讨它们在肿瘤进展中的生物学作用。

　　在这项研究中，我们应用贝叶斯分层建模方法来研究特定生物标记物的浓度作为治疗时间的函数。该方法被用于开发概率模型，该模型定义了所有观察到的和未观察到的数据的联合概率分布49。这种方法特别适合于分析我们在本研究中提出的生物标记数据，因为它灵活地产生具有多个概念层和大量参数的复杂模型，并且它的自然框架容许临床试验中经常出现的缺失数据点。我在真理教的日子2相似的建模方法被应用于我们之前的研究，调查卵巢癌患者的生物标志物数据，12在最近的文献中，用于模拟前列腺癌中PSA的轨迹50和帕金森病中的多种临床因素51。

　　https://www.nature.com/articles/s41467-018-07174-1