喜炎平与头孢唑啉联合应用对小鼠中性粒细胞功能影响的研究

　　喜炎平注射液为国家基本用药品种，主要成分为穿心莲内酯磺化物，属清热解毒、抗菌消炎药。临床上主要用于上呼吸道感染、病毒性肺炎、支气管炎、小儿腹泻、菌痢等治疗，临床上常见其与抗生素配伍使用。有研究发现，喜炎平与头孢菌素类[]、大环内酯类[-]抗生素联合应用，可显著提高对上呼吸道感染、小儿支原体肺炎等的疗效。本课题组[]和肖琪[]的研究也发现喜炎平可增强头孢类抗生素的抗菌作用。那么联合应用后，通过哪些机制提高疗效呢？本课题以喜炎平与头孢唑啉联合应用为例，对固有免疫细胞之一的中性粒细胞(polymorphonuclear,PMN)的相关功能进行了研究，为临床上进一步联合用药提供有力的理论支持。

　　异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)、HEPES为Solarbio公司产品；酵母多糖为Sigma公司产品；transwell小室为corning公司产品；小鼠中性粒细胞分离液、红细胞裂解液、台盼蓝、二甲基亚砜(DMSO)为天津灏洋生物制品有限公司产品，肝素为湖北康宝泰精细化工有限公司产品。

　　昆明种小鼠70只，雌雄各半，鼠龄6~8周，体重18~22 g(购自河北省实验动物中心，合格证编号：1311031)。

　　金黄色葡萄球菌敏感菌株26001-25、大肠埃希杆菌应用菌株 44102-3a7均购自北京市药品生物制品检定所。

　　秤取酵母多糖加入到新鲜人血清中(浓度为2 mg/mL)，37 ℃水浴保温30 min，3000 r/min，离心30 min，收集上清液，56 ℃、30 min加热处理，-30 ℃保存，备用。使用前，37 ℃预温10~20 min。

　　本文实验方案均经过河北工程大学医学院医学生物科研伦理委员会同意。

　　70只昆明种小鼠，雌雄各半。实验前用电子体温计测定小鼠直肠温度两次，两次间隔时间为1 h，选出两次体温相近的小鼠65只，其中随机选择10只作为空白组，其他55只小鼠每只均经腹腔注射浓度为9×108个/mL的金黄色葡萄球菌菌液0.2 mL，1 h后再测体温，选择有明显发热反应的小鼠40只，按发热之高低平均分配于4组，分别为模型组、喜炎平组、头孢唑啉组和喜炎平+头孢唑啉组(联合用药组)，每组10只。空白组和模型组经腹腔给予生理盐水(normal saline,NS)，70 mg/(kg·次)，每天2次；其他3组分别给予喜炎平，13 mg/(kg·次)，每天2次；头孢唑啉，70 mg/(kg·次)，每天2次；喜炎平+头孢唑啉，用量及用法同喜炎平及头孢唑啉组。连续给药7 d，于第7天给药后2 h小鼠球后静脉丛采血约0.8~1 mL，肝素抗凝。

　　(1)分离小鼠中性粒细胞取方法1.2.1中抗凝血0.6~0.8 mL，按小鼠中性粒细胞分离液说明书操作分离中性粒细胞，台盼蓝染色法检测分离率及细胞活力，分离率达到80%以上，细胞活力大于95%，用含HEPES的磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)调整浓度为2×105个/mL。

　　(2)transwell小室检测中性粒细胞趋化功能 取24孔transwell小室，每份中性粒细胞悬液做2个小室。在下室分别加入500 μL趋化因子和500 μL PBS,上室均加入200 μL中性粒细胞悬液，于37 ℃、 5% CO2、饱和湿度条件下培养1 h，弃去上室液体，PBS洗涤2遍，用棉签擦去上室膜上未趋化细胞，移去小室，倒置，风干，在下室加入500 μL、0.1%结晶紫染液，将小室置于其中，使膜浸没在染液中，37 ℃，孵育30 min，弃去结晶紫染液，用PBS洗涤2遍，在下室加入500 μL、33%醋酸溶液，将小室置于其中，使膜浸没在染液中，震荡10 min，充分溶解脱色，取出小室，酶标仪570 nm测OD值。计算趋化指数。

　　趋化指数=趋化因子OD值/PBS OD值

　　(1)FITC标记细胞[]取对数生长期(16~18 h培养)的大肠埃希菌，3 000 r/min离心15 min，用PBS洗涤2次，用碳酸盐缓冲液(carbonate buffer solution,CB,pH 9.5)配成浓度为0.5×109个/mL的细菌悬液，加入1 mg/mL FITC溶液，终浓度为5 μg/mL，37 ℃孵育2 h，3 000 r/min离心15 min，弃上清，PBS洗涤2次，PBS配成1×109个/mL悬液。

　　(2)流式细胞术检测中性粒细胞吞噬功能 在两个流式管中分别加入实验方法1.2.1 中的抗凝血100 μL，加入标记菌液20 μL，混匀，一支流式管放入37 ℃水浴15 min，另一支放入0 ℃环境15 min，迅速取出放入冰中10 min，加入冷PBS 2 mL，1 500 r/min离心10 min，弃上清，加入红细胞裂解液2 mL，室温放置5 min，1 500 r/min离心10 min，弃上清，加入冷PBS 2 mL洗涤2次，离心，弃上清，PBS重悬细胞(包含细胞数至少10 000个)，用流式细胞仪进行检测，计算吞噬率和吞噬指数。

　　吞噬率(%)=吞噬细菌的细胞数/总细胞数×100%

　　实际吞噬率(%)=37 ℃吞噬率-0 ℃吞噬率

　　吞噬指数=荧光强度/总细胞数

　　应用SPSS 16.0统计软件对所有数据进行统计学处理，结果以x±s表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，判定标准以P＜0.05为有统计学意义。

　　transwell小室法检测结果显示，空白组、模型组、喜炎平组、头孢唑啉组、喜炎平+头孢唑啉组的趋化指数分别为：2.039±0.52、1.97±0.66、2.06±0.75、1.91±0.70、1.85±0.53，各组之间差异无统计学意义(P＞0.05)。

　　各组37 ℃吞噬率结果，如所示。流式细胞术分析结果显示，空白组(6.83%±2.42%)、喜炎平组(5.45%±1.70%)、联合用药组(6.88%±3.84%)小鼠中性粒细胞的实际吞噬率明显高于模型组(3.54%±1.49%)及头孢唑啉组(2.66%±1.73%)(P＜0.01)。空白组、喜炎平组和联合用药组间实际吞噬率差异无统计学意义(P 1 各组小鼠外周血中性粒细胞37 ℃吞噬率结果 Phagocytotic rate of peripheral blood neutrophils under 37 ℃ in mice of all groups ＞0.05)，模型组和头孢唑啉组之间实际吞噬率差异亦无统计学意义(P＞0.05)。

　　空白组(3.28±1.04)、喜炎平组(2.95±0.93)、联合用药组(3.16±0.91)小鼠中性粒细胞的吞噬指数也明显高于模型组(1.15±0.86)和头孢唑啉组(1.47±0.43)(P＜0.01)。空白组、喜炎平组和联合用药组间吞噬指数差异无统计学意义(P＞0.05)；模型组和头孢唑啉组之间吞噬指数差异亦无统计学意义(P＞0.05)。

　　中性粒细胞来源于骨髓，占血液白细胞总数的60%~70%。它是宿主抵抗感染的主要防御细胞，以及炎症初期在损伤部位出现的主要白细胞，也是机体抗感染的第一道防线，具有趋化、吞噬、产生氧自由基及释放作用等生物学特性。在病原微生物感染过程中，中性粒细胞活化，与血管壁接触、滚动，紧密黏附于血管壁，在趋化因子的诱导下，中性粒细胞顺趋化因子浓度梯度移行，穿过内皮细胞进入血管间隙，再迁移至感染部位。机体的吞噬功能是一个主动而复杂的过程，当中性粒细胞到达炎症部位并与异物接触后，形成伪足，将异物包围，质膜内陷形成吞噬体，将入侵的病原微生物吞入胞内，由于中性粒细胞内含有大量溶酶体酶，进入胞内的吞噬体与溶酶体融合，溶酶体中的各种抗菌物质随即释放出来，将吞噬入细胞内的细菌和组织碎片分解。病原微生物在入侵的局部即被消灭，防止病原微生物在体内扩散[]。

　　在这一过程中，中性粒细胞迁移到感染灶是其发挥抗感染作用的第一步，这个过程是顺趋化因子浓度梯度进行的，即趋化性。在本实验中，我们用酵母多糖活化的新鲜血清作为趋化因子，通过transwell小室，利用中性粒细胞的这一特性，在体外模拟中性粒细胞顺趋化因子浓度梯度向感染灶趋化这一过程，对迁移至聚碳酸酯膜下层的中性粒细胞进行染色、脱色，通过测定趋化指数检测中性粒细胞的趋化能力。趋化指数越大，表明趋化能力越强。结果发现，各处理组中中性粒细胞趋化指数无显著性差异，说明喜炎平与头孢唑啉联合应用不会通过增强中性粒细胞的趋化作用来增强抗菌作用。

　　当中性粒细胞到达炎症部位后，可迅速吞噬入侵的病原微生物，是中性粒细胞细胞内杀伤、消化分解病原体的必须步骤。在本实验中，我们用FITC标记大肠杆菌，与中性粒细胞共同孵育后，通过流式细胞术测定具有荧光的中性粒细胞数量(即吞噬率)和平均荧光强度(吞噬指数)，分别代表吞噬细菌的中性粒细胞数量和中性粒细胞吞噬的细菌数量。从而来检测各组药物处理后中性粒细胞的吞噬功能。结果发现，小鼠感染金黄色葡萄球菌(模型组)后，吞噬率和吞噬指数明显低于正常小鼠；用头孢唑啉处理后，吞噬率和吞噬指数未见回升，仍低于正常小鼠；用喜炎平处理后，小鼠吞噬率吞噬指数升高，接近正常水平；两种药物联合处理后，吞噬率和吞噬指数回升，接近正常水平，且与喜炎平处理后的数值接近。由本部分结果可知，机体感染金黄色葡萄球菌后中性粒细胞吞噬功能受到一定程度的抑制，喜炎平治疗后可解除此抑制，使中性粒细胞吞噬功能达到正常水平；而头孢唑啉虽可杀伤金黄色葡萄球菌，但不能改善中性粒细胞的吞噬功能，当两种药物联合应用时，其药理作用可互相补充，增强抗菌疗效。

　　结合文献与本组结果，我们认为喜炎平与头孢唑啉联合应用不仅可通过增强头孢唑啉的抗菌活性来提高疗效，也可以通过增强中性粒细胞的吞噬功能来提高疗效。