局部应用辛伐他汀和机械预处理方法预防静脉移植物再狭窄的研究

　　冠状动脉旁路移植术是治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）的重要治疗手段，对于改善患者生活质量起到积极作用[]。但术后发生静脉移植物狭窄，进而引起多种不良心血管事件发生，仍是心外科医师所面临的棘手问题。据统计，冠状动脉旁路移植术后大隐静脉桥的 10 年通畅率为 60%，远低于乳内动脉桥[-]。在临床工作中，在大隐静脉获取后到用于进行吻合这段时间里，游离下来的大隐静脉通常被保存在含肝素的生理盐水中待用。在这个时间窗内，一方面可以尝试将这段血管暴露于含有某种特殊药物的溶液中，到目前为止有学者尝试用维拉帕米+硝酸甘油、罂粟碱等药物对移植物进行处理，也有人尝试在完成吻合的静脉移植物周围局部应用他汀药物，均取得了一定成果，但尚未见在血管内局部应用他汀药物对静脉移植物内膜影响的研究报道；另一方面可以对静脉移植物进行机械预处理使其提前适应动脉系统的高压高流量环境，避免其在接入动脉系统后所发生的血流动力学和生物力学的突然改变造成血管结构破坏。

　　因此，本研究使用辛伐他汀作为预处理药物在血管内局部应用，使用体外循环机滚压泵产生的搏动性血流作为机械预处理方法，在兔颈外静脉获取后到用于进行移植吻合前的这一时间窗内，对其进行预处理以期达到预防静脉桥血管狭窄的目的；与此同时，我们还检测了经辛伐他汀处理后移植物血管组织和体外培养细胞的 YAP 及其下游靶基因的表达情况，对其抑制新生内膜形成的机制进行初步探究。最终为解决冠状动脉旁路移植术后静脉桥血管再狭窄提供新的解决方案。

　　选用新西兰兔 12 只（由阜外医院动物实验中心动物合格供应商提供），雌雄不限。设空白对照组、辛伐他汀局部处理组、机械预处理组、药物机械联合预处理组（联合处理组）。利用随机数字表随机选择实验动物入组，每组 3 只。提前进入设施饲养隔离检疫，适应环境减少应激；术前检查，确保动物健康，术前如有异常行为学特征及异常症状和体征则排除出实验。

　　空白对照组：直接吻合至同侧颈动脉；辛伐他汀局部处理组：静脉两端结扎，一侧插入 22F 套管针，抽出血管内血液，注入辛伐他汀溶液（浓度 10 mg/mL），静置 15 min；机械预处理组：使用体外循环机小滚压泵 1 个、输液器 2 个、三通阀 2 个、压力换能器 1 个、22F 套管针 2 个组成的机械预处理装置。使用生理盐水 50 mL 预充管路，排除气泡。静脉两端结扎后插入 22F 套管针，将静脉接入管路，转机，每 5 min 提高 10 mm Hg 循环压力至 100 mm Hg，维持 10 min 后取下；联合处理组：将上述管路的预充液更换为辛伐他汀溶液（浓度 10 mg/mL），余处理方法同前。

　　术前称重，禁食水，并记录其健康状态。实验动物建立耳缘静脉通路行诱导麻醉，判断麻醉起效时机，气管插管接呼吸机辅助通气，异氟烷维持麻醉。实验动物固定于手术台，连接监护仪实时监测动物术中心电图、血压、体温情况。右侧颈部备皮，消毒手术部位和铺巾。选颈动脉搏动强烈处作一 5 cm 纵行手术切口，仔细分离皮下组织，显露颈外静脉。给予肝素 400 U/kg 静脉注射，5 min 后，静脉两端以 0 号丝线结扎后按上述预处理方案给予相应处理。继续钝性分离深部肌肉组织显露颈动脉，血管夹阻断两端，于中点处斜形剪开，生理盐水冲洗。将预处理后的静脉移植物远端与颈动脉近端以 7-0 Prolene 线行端-端连续缝合，静脉移植物近端与颈动脉远端以 7-0 Prolene 线行端-端连续缝合。吻合完成后，开放动脉夹，排气，打结，打水检查有无出血。反复确认无活动性出血后缝皮。术后给予镇痛、抗生素治疗以预防感染，常规护理。

　　于术后 7 d、14 d 和 21 d 对各组实验动物术侧进行血管超声检查。实验动物晨起禁食水，建立耳缘静脉通路，注入 1% 丙泊酚注射液 3 mL，待动物麻醉后左侧卧位置于检查台上行超声检查。检查项目包括：二维超声观察静脉移植物管腔有无异常回声、静脉移植物管壁改变情况，多普勒超声检测移植物血管内血流速度并记录数据。

　　术后 3 周，实验动物在符合动物实验伦理条件下进行安乐死并取材。剪开手术切口，剪下静脉移植物，4% 多聚甲醛溶液固定 24 h。然后 PBS缓冲液充分冲洗样品，全自动组织脱水机脱水，石蜡包埋，取血管横切面进行切片，厚度 3.5 μm。苏木精-伊红染色（HE 染色）后树脂封片。显微镜下观察并拍照，Photoshop 12.0 软件测量新生内膜厚度。

　　将冻存的人脐血管内皮细胞（HUVEC）复苏后加入含有 10% 胎牛血清及 1% 青霉素、链霉素溶液的 DMEM 培养基中，37℃、5% CO2 培养。每 48 h 更换新鲜培养基，待细胞汇合度至 80%～90% 时使用 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 消化，按 1∶3 比例传代。

　　将培养传至第 4 代的 HUVEC 以 3 000 个细胞/孔接种至 96 孔板。在 37℃、5% CO2 环境中培养 6～8 h，待细胞贴壁后进行实验。设置高浓度组（辛伐他汀溶液 5 mmol/L）、低浓度组（辛伐他汀溶液 2.5 mmol/L）、溶剂对照组（无水乙醇），分别处理。在处理后的第 3 h、第 11 h 和第 24 h 三个时间点分别检测细胞增殖情况。每孔加入 10 μL增强型 CCK-8 溶液（Enhanced Cell Counting Kit-8 试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司），在 37℃ 环境中孵育 1 h 后使用酶标仪测量 450 nm 吸光度，记录数据。

　　辛伐他汀（2.5 mmol/L）和溶剂处理 24 h 后，收集 HUVEC，进行 10% SDS-PAGE 胶电泳，转膜，5% TBST 配脱脂牛奶封闭 1 h 后裁剪对应大小条带，加入一抗 Yap（#14074）、p-YAPS127（#13008）、β-actin（AF5001）后置于 4℃ 环境中孵育过夜。次日回收一抗，使用 TBST 充分洗膜后加入对应种属二抗：HRP 标记山羊抗兔 IgG（A0277）、HRP 标记山羊抗小鼠 IgG（A0286），放入摇床内孵育 1 h，充分洗膜后显影并拍照记录。

　　在 NCBI 上检索人ccn1（cyr61）、ccn2（ctgf）、ccn3（fstl1）基因序列，使用 Integrated DNA Technologies 引物设计网站（https://sg.idtdna.com/pages）设计引物；见。

　　使用 Trizol 液收取剪碎的移植物血管组织和辛伐他汀（2.5 mmol/L）及乙醇溶剂处理 24 h 的 HUVEC，提取总 mRNA，反转录为 cDNA 后进行 RT-qPCR 检测 YAP 及其下游靶基因表达情况。

　　采用 IBM SPSS Statistic 24.0 软件对数据进行统计学分析。正态分布的计量资料采用均数±标准差（±s）表示，采用两独立样本 t 检验进行组间比较。P≤0.05 为差异有统计学意义。

　　本实验已通过中国医学科学院阜外医院实验动物管理和使用委员会实验动物福利伦理审批，伦理批号：0102-4-15-ZX（X）-18。

　　在实验动物实施安乐死术后对手术部位进行解剖，充分显露颈动脉-静脉移植物-颈动脉解剖结构，显示辛伐他汀局部处理组和机械预处理组的静脉移植物与周围粘连不重，管径变化不明显；联合处理组、空白对照组的静脉移植物与周围组织粘连较明显，管径有所增粗；见。

　　实验动物在术后 1 周、2 周、3 周分别接受术侧血管超声检查以评估移植部位血流和管壁结构变化。二维超声显示，到术后第 3 周末，4 组实验动物的静脉移植物管壁均有不同程度的增厚；见～。多普勒超声结果显示，血流速度测量标记放置在静脉移植物内的近端吻合口附近，通过对该位置血流速度变化的监测，间接反映移植物内膜增生情况。组内纵向对比显示，除辛伐他汀局部处理组外，空白对照组、机械预处理组、联合处理组的血流速度术后呈逐渐上升趋势，在术后第 3 周末分别达（0.94±0.05）m/s、（0.75±0.03）m/s、（0.88±0.08）m/s，较第 1 周末分别升高了 118%（P<0.001）、56%（P<0.001）、74%（P<0.01），辛伐他汀局部处理组的血流速度为（0.55±0.10）m/s，较前未见明显变化（P>0.05）；组间横向对比显示，与空白对照组术后第 3 周末的流速相比，辛伐他汀局部处理组和机械预处理组差异均具有统计学意义（P<0.01）；见。

　　各组实验动物在术后第 3 周处死取材，所有静脉移植物经脱水、包埋、切片、染色等标准石蜡切片制作程序处理后置于显微镜下观察，测量新生内膜厚度。结果显示：辛伐他汀局部处理组、机械预处理组、联合处理组、空白对照组的新生内膜厚度分别为：（45.56±4.11）μm、（201.28±16.71）μm、（143.57±7.82）μm、（249.45±13.33）μm。与空白对照组相比，局部应用辛伐他汀处理的静脉移植物内膜增生厚度降低了 81.7%，应用机械预处理方法的静脉移植物内膜增生厚度降低了 19.3%，应用机械预处理联合局部应用辛伐他汀方法降低了 42.4%。各组的新生内膜厚度与空白对照组差异均有统计学意义（P<0.05）；见。

　　将获得的静脉移植物置于预先加入 RNA 提取试剂 Trizol 的 Eppendorf 管中，剪碎并匀浆处理，用三氯甲烷-异丙醇法提取 mRNA。反转录获得 cDNA 后，行 RT-qPCR 检测 Hippo 通路经典下游靶基因 ccn1、ccn2、fstl2、ankrd1 表达量。结果显示：与空白对照组相比，辛伐他汀局部处理组的 ccn1 表达量明显降低（P<0.05），联合处理组的 ccn2 表达量明显降低（P<0.05），其余差异无统计学意义；见。

　　收取辛伐他汀（2.5 mmol/L）与溶剂对照处理 24 h 的 HUVEC 细胞，Western-blot 检测 Hippo 通路主要下游效应因子 YAP。结果显示辛伐他汀组较对照组的 YAP 蛋白总量不变，磷酸化 YAP 蛋白水平升高。RT-qPCR 检测 Hippo 通路经典下游靶基因 ccn1、ccn2、fstl1、 ankrd1，结果显示 ccn1 表达量在辛伐他汀处理组中显著下调（P<0.001），其余靶基因差异无统计学意义；见。

　　对辛伐他汀高浓度组（5 mmol/L）、低浓度组（2.5 mmol/L）和溶剂对照组各组细胞处理后各时间点细胞增殖情况进行检测，结果显示处理后第 3 h，高浓度组细胞数量减少，低浓度组和溶剂对照组细胞数量无明显差异；第 11 h，高浓度组细胞增殖受到明显抑制（P<0.001），低浓度组细胞增殖速度较溶剂对照组明显放缓（P<0.05）；第 24 h，镜下观察高浓度组细胞几乎全部死亡，低浓度组细胞增殖速度仍明显低于溶剂对照组（P<0.05）；见。

　　冠状动脉旁路移植术是治疗冠心病的有效手段，术后桥血管狭窄仍对远期疗效产生影响。尽管全动脉化搭桥已被证实有效[]，但目前大多数心脏中心还是采用胸廓内动脉+大隐静脉作为桥血管进行搭桥的手术策略，因此这些患者仍面临中远期桥血管再狭窄的问题。通常，将作为桥血管材料的大隐静脉在冠状动脉旁路移植术后所发生的一系列病理变化并最终导致桥血管狭窄甚至闭塞的情况称为静脉移植物病（vein graft disease，VGD）[]。主要表现为如下 3 个连续的过程：术后第 1 个月里血栓形成，这一过程可能与对静脉血管操作不当或动脉血流高剪切力导致的内皮损伤进而促进血小板黏附聚集有关；术后 1 年内内膜增生，Zhang 等[]的研究显示在静脉移植物新生内膜中约有 60% 的细胞来源于骨髓和循环中的母细胞；术后多年逐渐进展的类似动脉粥样硬化的过程是静脉移植物再狭窄的主要原因[]。针对上述病理过程进行干预，可能会对预防 VGD 的发生发展起到积极作用。

　　一方面，本研究选用了临床常用降脂药物辛伐他汀作为干预药物。在临床实践中人们发现，心血管疾病患者应用他汀类药物的实际获益高于单纯降脂治疗的预期获益。例如，他汀类药物对于改善心肌病变[]、改善心力衰竭预后[]有积极作用。这一系列非降脂相关的效应被称作他汀多效性（statin pleiotrophy）[]。血管生物学方面的研究[-]显示，他汀药物具有改善内皮细胞功能、抑制平滑肌细胞增殖的作用。截至目前，多项临床研究报道口服高剂量他汀药物能进一步降低不良心血管事件发生率，但也增加了药物安全性相关不良事件发生的潜在风险。然而，在血管内局部应用他汀类药物预防桥血管再狭窄的研究还未见报道。与全身用药相比，血管内局部给药具有不受药物浓度限制、作用直接、无需经机体代谢等优势。理论上这种方法能在安全浓度范围内最大程度地提高他汀药物的作用效率、避免对肝肾等器官的不良影响。本研究结果显示，在单独给予血管内局部给药处理后第 1 周、2 周、3 周的静脉移植物近心端血流速度无明显变化，相反空白对照组的血流速度逐渐升高，差异具有统计学意义，提示前者内膜增生情况没有造成血流动力学的改变；同时病理学检查证实单纯血管内给药处理的静脉移植物增生内膜厚度明显小于空白对照组（P<0.001）。既往研究表明辛伐他汀在改善血管重构方面的表现除与降脂作用相关外还涉及 eNOS 系统调节[]，Akt/PKB[]信号通路调控等多种分子机制。研究[]显示该药还可能通过调节 Hippo 信号通路下游的 YAP/TAZ 复合物发挥抑制新生内膜形成的作用。

　　Hippo 信号通路最早发现于果蝇细胞中[]，它通过细胞接触性抑制参与调节细胞增殖凋亡过程，以维持组织形态和内环境稳态[]。近年来，研究[]发现该通路在动脉粥样硬化、血管重塑等心血管疾病进程中也发挥着重要作用。YAP/TAZ 复合物作为 Hippo 通路调控细胞存活、增殖和凋亡的主要下游效应因子在激活后通过定位于核内并与 TEAD 结合，从而诱导靶基因（ccn1、ccn2、ankrd 等）转录发挥其作用。ccn1 基因表达的 CCN1 蛋白，也称 CYR61 蛋白，具有促进内皮细胞、平滑肌细胞增殖和迁移的作用，参与血管损伤修复过程[]。在本研究中，我们对动物实验获得的移植物血管中 YAP 下游靶基因的表达情况进行了分析，结果显示：辛伐他汀局部处理组的 ccn1 基因表达水平较空白对照组下调，差异具有统计学意义（P<0.05）；体外实验结果也显示辛伐他汀处理后细胞的 YAP 蛋白总量不变、磷酸化 YAP 的蛋白量增加、下游靶基因 ccn1 表达下调（P<0.001）。这些结果表明辛伐他汀通过增加 YAP 磷酸化、抑制 YAP 入核、降低下游靶基因 ccn1、ccn2 的表达从而发挥抑制新生内膜形成的作用也是他汀类药物调节血管重构的机制之一。此外，细胞增殖抑制实验结果显示：高浓度辛伐他汀局部应用能够造成细胞死亡，存在细胞毒性；低浓度辛伐他汀局部应用能明显减缓细胞增殖，具有抑制细胞增殖作用。这一结果说明局部应用辛伐他汀抑制内膜增生的效应存在剂量依赖性，提示该方法临床应用前需进行工作浓度的安全性评价，以确定高效安全的预处理液浓度。

　　另一方面，大隐静脉桥血管近远端吻合完毕开通的即刻，桥血管内皮细胞便暴露在动脉高血流量、高剪切力的环境中，血管内的流体状态发生了巨大变化[]。为了避免移植物血管内流体状态突然改变造成的损伤，本研究利用滚压泵产生的搏动性流体，调节血管内压力从生理状态下静脉压开始缓慢提高到动脉系统压力，从而达到预适应的目的。研究结果显示：在单独给予机械处理后第 1 周、2 周、3 周的静脉移植物近心端血流速度和空白对照组的血流速度都有升高，但升高程度显著低于后者（P<0.01）；同时病理切片证实，经这种干预方式处理的静脉移植物内膜存在增厚，但仍低于空白对照组的新生内膜厚度，差异具有统计学意义（P<0.05）。这说明机械预处理方式能够起到延缓新生内膜形成的作用。随后，本研究将机械预处理管路的预充液更换为辛伐他汀溶液对静脉移植物进行预处理，研究结果显示：经该方式处理的静脉移植物在术后第 3 周时有新生内膜形成，但厚度显著小于空白对照组（P<0.001）。此前有研究显示，在暴露于高速湍流的血管内皮细胞中，YAP/TAZ 复合物被激活，转移进入细胞核内，随后伴有促进内皮细胞增殖活跃和凋亡抑制的相关靶基因的上调。反之，在内皮细胞中抑制 YAP/TAZ 能够抑制 JNK 信号传导，下调炎性基因表达，减少单核细胞粘附及渗透[]；在平滑肌细胞中敲除 YAP/TAZ 复合物能够缓解损伤介导的平滑肌细胞表型转化为增殖型，进而减轻小鼠新生内膜的形成。同样地，通过 RNAi 技术或维替泊芬抑制 YAP/TAZ 复合物功能可显著降低血管平滑肌细胞的增殖[-]。我们的研究结果显示，联合处理组的静脉移植物中 YAP 下游靶基因 ccn2 的表达下调。 ccn2 基因表达的 CCN2 蛋白，也称结缔组织生长因子，该蛋白可引起多种细胞反应，包括减少细胞粘附，增强细胞迁移和增殖。由此可见，采用辛伐他汀与机械预处理相结合的方式能够使在静脉移植物提前适应动脉血流环境的同时抑制 YAP/TAZ 效应因子入核，降低下游靶基因 ccn2 的表达，从而发挥减轻血流状态改变对静脉移植物新生内膜增殖的促进作用。

　　综上所述，本研究得出如下结论：血管内局部应用辛伐他汀和机械预处理方法单用或联用均能抑制静脉移植物内膜增生；高浓度的辛伐他汀有细胞毒性，低浓度的辛伐他汀有抑制细胞增殖的作用；辛伐他汀通过抑制 YAP 入核、降低细胞增殖相关靶基因 ccn1 的转录发挥抑制新生内膜形成的作用。本研究为解决冠状动脉旁路移植术后静脉桥血管再狭窄提供了新的解决方案。

　　利益冲突：无。

　　作者贡献：赵晨宇负责课题设计，动物实验，论文撰写；潘予韦负责分子生物学实验，数据分析整理；贾六军负责实验动物模型建立；段亚冰、丁力负责数据分析整理；张岩、孙寒松负责论文审阅与修改。