论著／黄一勇 基于生物信息学分析的先天性胫骨假关节血清来源外泌体蛋白质组学研究

　　作者：黄一勇 杨戈 刘尧喜 谭谦 刘昆 朱光辉 唐进 梅海波

　　作者单位：湖南省儿童医院骨科，长沙 410007

　　通信作者：梅海波，Email：meihaibo@sohu.com

　　基金项目：湖南省重点研发计划（2020SK2113）；湖南省儿童肢体畸形临床医学研究中心（2019SK4006）；湖南省出生缺陷协同防治科技重大专项（2019SK1010）

　　摘 要

　　目的  比较先天性胫骨假关节（congenital pseudarthrosis of tibia，CPT）和正常儿童血清外泌体中蛋白的表达差异，寻找CPT的可能致病机制。

　　方法  收集湖南省儿童医院6例CPT患儿和4例正常儿童的静脉血，通过分离出静脉血清、提取血清外泌体，使用串联质谱标签（tandem mass tag，TMT）标记定量蛋白组学技术，确定CPT患儿和正常儿童血清外泌体中的差异表达蛋白，并对差异蛋白进行GO分析、KEGG分析、DisGeNET富集分析及PPI分析。

　　结果  与正常儿童血清中外泌体蛋白相比，CPT来源的血清外泌体中表达上调的蛋白共121个，表达下调的蛋白共289个。KEGG分析结果显示，差异蛋白在补体系统富集最为显著；糖代谢在GO分类中的生物进程中富集；DisGeNET富集分析结果显示，排名前五的疾病中有3种和骨质疏松症有关；PPI富集分析结果显示糖代谢为差异蛋白富集模块之一。

　　结论  补体系统紊乱和细胞能量代谢异常可能是CPT的潜在致病机制。本研究为探索先天性胫骨假关节的病因及发病机制提供了新的思路。

　　关键词  先天性胫骨假关节；胫骨/畸形；假关节/先天性；蛋白质组学/分类；蛋白质组学/方法；外泌体

　　先天性胫骨假关节（congenital pseudarthrosis of tibia，CPT）是一种罕见的小儿骨科疾病，发病率为1/250 000~1/140 000。主要临床特征为：出生时即有胫骨缺损，形成假关节；或出生时伴有先天性胫骨前弓畸形，外伤后骨折不愈合而形成假关节。自1891年Paget首次报道CPT以来，距今已有100余年的历史，但其病因及发病机制仍不明确。CPT由于病灶假关节处难以实现骨性愈合而成为临床治疗的难点，通常骨的发育和骨折的愈合与间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）的成骨分化以及成骨细胞、破骨细胞的活性密切相关。有研究表明，CPT患儿假关节部位骨髓中MSCs的成骨能力比正常人差，且其假关节部位破骨细胞活性增强，提示CPT的发生可能与假关节局部骨代谢异常有关。

　　外泌体是细胞分泌的一种直径30~00 nm的小囊泡，其中包含多种蛋白质，这些蛋白质在免疫调节、细胞迁移以及介导细胞分化等方面起着重要的作用。近年来血清来源的外泌体（serum-derived exosomes，SDEs）在骨重建领域引起了广泛关注，并证明其与一些骨骼系统疾病的发生有关，如骨质疏松症或成骨不全。本团队前期研究发现，CPT患儿血清来源外泌体具有抑制成骨、促进破骨代谢的能力，提示CPT血清外泌体中包含的蛋白分子与正常儿童存在差异。

　　虽然SDEs对骨代谢的影响越来越受到重视，但至今尚没有关于CPT患儿和正常儿童SDEs蛋白质组学的研究。本研究使用液相色谱串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）结合TMT标记定量技术，进行CPT患儿和正常儿童的SDEs蛋白质谱分析，寻找CPT和正常儿童SDEs之间的差异蛋白，并使用生物信息学方法对差异蛋白进行分析，以期为CPT的病理生物学机制研究奠定基础。

　　材料与方法

　　一、研究对象和样品处理

　　采集湖南省儿童医院2017年6月至2019年8月收住院的6例合并I型神经纤维瘤病（neurofibromatosis type 1，NF1）的Crawford Ⅳ型CPT患儿（男3例，女3例，平均年龄18.5个月）和4例正常儿童（男3例，女1例，平均年龄37.5个月）静脉血。CPT的诊断基于临床表现和影像学特征［14］。将获取的静脉血即刻在4℃离心机中以5 000 rpm/min离心5min，取上清液于冻存管中放于-80℃冻存以备后续研究。本研究经湖南省儿童医院伦理委员会批准（编号：HCHLL-2019-36），且获得患儿父母知情同意。

　　二、血清中外泌体分离

　　先将全血样品离心（4℃，3 000xg，30 min），取上清液（即血清）。然后使用等体积的PBS（phosphate buffered saline）稀释血清，并用0.22 μm筛网过滤后再次离心（4℃，25 000 xg，90 min），取上清液，之后加入ExoQuick-TC agentia（System Biosciences，Palo Alto，CA，USA），于4℃环境下过夜后离心（4℃，1 500 xg，30 min），去除上清液后即可获得外泌体。用200 μL的PBS重悬后，将所有外泌体储存在-80℃环境下或用于进一步的研究。

　　三、外泌体中蛋白提取、酶解及TMT标记

　　将外泌体从-80℃冰箱取出，离心（4℃，12 000 xg，15 min）后取上清液，并用0.22 μm微孔滤膜过滤上清液，再用PTM公司生产的PTM-EVs试剂盒分离外泌体。加入终浓度为8 mol/L的Urea以及蛋白酶抑制剂超声裂解，使用BCA 试剂盒测定蛋白浓度。加二硫苏糖醇调节蛋白浓度为5 mmol/L，并还原30 min（56℃）。再加入碘代乙酰胺调节蛋白浓度至11 mmol/L并孵育15 min（室温、避光），再将样品的尿素浓度稀释至2 mol/L以下。蛋白溶液中加入胰酶（胰酶与蛋白的质量比为1∶50）后，37℃酶解过夜。再按1∶100的胰酶与蛋白质量加入胰酶，37 ℃酶解4 h。酶解之后的肽段用Strata X C18 （Phenomenex） 除盐、真空冷冻干燥，再以0.5 mol/L TEAB溶解肽段，然后按照TMT试剂盒操作说明标记肽段（标记试剂解冻后用乙腈溶解，与肽段混合后室温孵育2 h，标记后的肽段混合后除盐，真空冷冻干燥）。肽段用Agilent 300Extend C18进行反向浓缩、真空冷冻干燥，并用液相色谱流动相A相（0.1%甲酸和2%乙腈的水溶液）溶解后使用EASY-nLC 1200超高效液相系统进行分离。

　　四、Q Exactive HF-X质谱分析

　　分离后的肽段被注入NSI离子源中电离，然后使用Q Exactive HF-X质谱分析仪进行分析。设置离子源电压为2.0 kV，并使用高分辨Orbitrap检测和分析肽段母离子及其二级碎片。设置扫描范围（一级质谱为350~1 600 m/z，二级质谱则固定起点为100 m/z）和扫描分辨率（一级质谱为120 000，二级质谱为30 000）。使用数据依赖型扫描（DDA）程序采集质谱数据。

　　五、生物信息学分析

　　本研究使用Maxquant （v1.5.2.8）处理质谱数据，并在Homo_sapiens_9606_SP_20190513（20422条序列）数据库中进行检索。以1.3倍为差异表达变化阈值，以统计学检验P<0.05为显著性阈值，得到差异表达蛋白，并对差异蛋白进行以下分析。

　　（一）GO注释及富集分析

　　Gene Ontology（GO）即基因本论，主要从生物进程（biological process）、细胞组成（cellular component）和分子功能（molecular function）三个不同角度对差异蛋白进行分析。本研究运用GO分析从上述3个方面对差异蛋白进行注释，并行GO富集分析。

　　（二）KEGG通路富集分析

　　KEGG是连接已知分子间相互作用的信息网络，如代谢通路、复合物、生化反应。KEGG途径主要包括：代谢、遗传信息处理、环境信息处理、细胞过程、人类疾病、药物开发等。为确定最明显的差异途径，本研究对差异蛋白进行KEGG通路富集分析。

　　（三）DisGeNET富集分析

　　DisGeNET（即疾病相关的基因与突变位点数据库）是一个收集人类疾病相关基因的数据库，可用于分析人类疾病的分子基础、疾病基因的性质分析、疾病候选基因的验证等。本研究对差异蛋白进行DisGeNET富集分析，识别差异蛋白与其他疾病的关系。

　　（四）蛋白互作网络分析

　　蛋白互作网络（protein interaction network，PPI network）分析有助于从系统的整体的角度研究生物分子机制、原理和预测蛋白质相互间功能影响。本研究采用Metascape对差异蛋白进行分析，并使用MCODE算法识别密集连接的网络聚类。

　　结果

　　一、血清外泌体的蛋白质组学概况

　　本研究一共鉴定到1 417.0个可定量蛋白（至少一个比较组有定量信息）。以1.3倍为差异表达变化阈值，以统计学检验P<0.05为显著性阈值，共得到410个差异蛋白。CPT患儿与正常儿童相比，有121个蛋白表达发生上调，289个蛋白表达发生下调。

　　二、GO注释

　　GO注释结果表明，差异蛋白涉及的生物进程包括细胞过程、单生物过程及生物调节等。在细胞组成中，差异蛋白主要存在于细胞、细胞器及胞外区等。在分子功能上，差异蛋白明显集中在分子结合和分子催化活性2个区域。见图1。

　　

　　三、KEGG通路富集分析

　　KEGG通路富集分析表明，补体系统、阿尔茨海默病、氧化磷酸化是富集最明显的3个途径。图2列出了最显著富集的前20个分类的结果。

　　

　　四、DisGeNET富集分析

　　DisGeNET富集分析结果表明，在排名前五的疾病中，有3种疾病与骨质疏松症有关。进一步研究发现，差异蛋白中与骨质疏松有关的蛋白共有22个。表1列出了所有与骨质疏松相关的差异蛋白及差异蛋白所对应的基因名称和注释。

　　

　　五、蛋白互作网络分析

　　本研究使用Cytoscape软件制作了差异蛋白PPI图，并对参与糖酵解/糖异生模块的差异蛋白进行了分析（图3）。根据MCODE分析显示，有11种MCODE组分蛋白质密集连接（表2），糖酵解/糖异生模块为差异蛋白富集模块之一。

　　

　　

　　讨论

　　本研究对CPT患儿和正常儿童的血清来源外泌体内蛋白质进行鉴定，共得到410个差异表达蛋白。与正常儿童相比，CPT患儿有121个蛋白表达上调，有289个蛋白表达下调。差异蛋白的KEGG富集分析结果表明，补体系统是差异蛋白富集最明显的通路。补体主要在肝脏合成，然后释放入血。一些肝外的组织和细胞（如成纤维细胞、内皮细胞、免疫细胞）也可以在相应部位产生补体成分。补体在骨骼的生长、修复过程中起着重要的作用。有研究表明，在骨的生长发育过程中，生长板中的C3、C5、C9在生长板的软骨骨化过程中起重要作用。动物研究表明，缺乏C3和C5会导致骨的生长板变厚，使软骨骨化延迟。补体除对软骨细胞有影响外，还影响间充质干细胞的募集和增殖分化，进而影响骨的发育和修复。本研究中发现差异蛋白中有C3、C5、C9等补体的存在，表明补体系统紊乱可能与CPT的发生有关。

　　PPI富集分析显示，糖酵解和糖异生（即MCODE 5）为差异蛋白富集过程之一，糖酵解和糖异生是细胞获得能量的两个重要途径，提示CPT可能存在能量代谢异常。在生物体中，糖的氧化分解主要有3条途径：糖的有氧氧化、糖酵解和磷酸戊糖途径，其中糖酵解是所有生物体进行葡萄糖分解代谢所必须经过的共同阶段。最近有研究表明，间充质干细胞的能量代谢异常会影响其增殖及分化，进而导致成骨细胞减少，造成骨质疏松。已有研究表明CPT病变骨膜中干细胞的增殖分化异常。本研究发现糖酵解和糖异生均为差异蛋白的PPI富集过程，提示CPT可能存在间充质干细胞的能量代谢异常。

　　DisGeNET分析发现，DisGeNET富集的前5种疾病中，有3种疾病与骨质疏松症有关。骨质疏松的原因复杂，其中干细胞的增殖分化减弱是其机制之一。2008年，Cho等对7例先天性胫骨假关节合并NF1患儿的病变骨膜和3例对照组患儿的正常胫骨骨膜进行了研究，发现病变骨膜中的细胞在一定程度上保持间质细胞系细胞表型，但是没有在BMP诱导下产生成骨分化。2016年，Madhuri等研究发现CPT患儿病变骨膜中的MSCs分化潜能及成骨潜能较正常儿童差。2018年，Dilogo等通过对6例CPT患儿髂骨骨髓及假关节病变部位 MSCs进行对比研究发现，与髂骨骨髓相比，CPT病变部位的MSCs更容易衰老。由于CPT病变骨膜中MSCs的成骨能力较正常儿童差，Tikkanen等在2010年将含有MSCs的培养液置于假关节局部来治疗CPT，并取得了成功。因此，CPT病变骨膜中干细胞的增殖分化异常可能是其发病机制之一。

　　综上所述，补体系统紊乱和细胞能量代谢异常可能是CPT的潜在发病机制。本研究为探索CPT的发病机制提供了新的思路，但仍存在一定的局限性。首先，本研究不仅鉴定出补体和能量代谢的相关差异蛋白，还发现许多其他差异蛋白（如氨基酸代谢相关蛋白），这些蛋白也可能与CPT的发生有着重要的关系；另外，本研究选择的研究对象是血清外泌体，如选择组织外泌体可能更具有实际意义；第三，本研究采用初级的生物信息学分析方法，且未进行组织学验证，研究结论可能存在一定的偏差。对于上述不足，我们将在下一步的研究中去弥补。

　　利益冲突  所有作者均声明不存在利益冲突

　　作者贡献声明  文献检索为黄一勇、刘尧喜，论文调查设计为黄一勇、杨戈、朱光辉、梅海波，数据收集与分析黄一勇、刘尧喜，论文结果撰写为黄一勇、杨戈，论文讨论分析为黄一勇、刘尧喜、谭谦、刘昆、朱光辉、唐进、杨戈、梅海波

　　参考文献略本文引用格式

　　黄一勇，杨戈，刘尧喜，等.基于生物信息学分析的先天性胫骨假关节血清来源外泌体蛋白质组学研究[J].临床小儿外科杂志，2022，21(6)：551—557.DOI：10.3760/cma.j.cn101785—202102043—010.

　　Huang YY，Yang G，Liu YX，et al.Proteomic analysis of serum-derived exosomes from congenital pseudarthrosis of tibia[J].J Clin Ped Sur，2022，21(6)：551—557.DOI：10.3760/cma.j.cn101785—202102043—010.欢迎关注 留言 转发

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