用于预防和治疗癌症的GREMLIN-1拮抗剂的制作方法

　　

　　发明领域

　　本发明涉及抗grem1拮抗剂用于癌症治疗方法中。所述癌症通常是具有基质的实体癌，通常具有基质grem1过表达。所述癌症可有上皮grem1过表达。本发明进一步涉及用grem1拮抗剂和另外的抗癌剂(如化学治疗剂)，以及相关的组合物的联合治疗。本发明还涉及基于基质grem1过表达的癌症的检测、预后预测和治疗选择。

　　发明背景

　　gremlin-1(也称为drm和cktsf1b1和grem1)是一种184个氨基酸的糖蛋白，是半胱氨酸结分泌蛋白(cystine-knotsecretedprotein)dan家族的一部分(与cerberus和dan等一起)。grem1结合bmp-2、4和7并抑制其信号传导能力，以及记载的可能通过vegfr2的激动作用发挥的促血管生成作用。grem1的主要作用是在发育过程中，其中在肾脏形成和肢芽(limbbud)形成过程中至关重要。这些重要的作用使得grem1纯合敲除在小鼠中是胚胎致死的。

　　在成人期，grem1水平的升高与特发性肺纤维化和肺动脉高压有关，其中bmp2、4和7信号传导降低，伴随tgfβ水平升高。在糖尿病和慢性同种异体移植肾病中，grem1表达与纤维化评分相关。

　　grem1水平升高还与硬皮病、糖尿病肾病、神经胶质瘤、头颈癌、前列腺癌和结肠直肠癌等尤其有关(sneddon等人；guan等人)。grem1已被证明在体外激活癌细胞侵袭和增殖，并被认为在子宫癌、宫颈癌、肺癌、卵巢癌、肾癌、乳腺癌、结肠癌、胰腺癌和肉瘤中起作用。

　　需要确定用于治疗和预防癌症的有效疗法。

　　发明概述

　　发明人惊奇地发现，grem1拮抗剂是，对抗伴有基质和/或上皮grem1过表达的肿瘤(包括结肠直肠癌和多发性骨髓瘤)的有效的治疗和预防试剂。基于这些结果，发明人设想grem1拮抗剂将在癌症的治疗和预防中具有普遍用途，包括具有基质grem1过表达的其他癌症。本文提供的体内结果说明了通过施用grem1拮抗剂长期预防各种小鼠肿瘤模型中瘤形成的诱导，以及通过施用grem1拮抗剂对已有肿瘤的显著治疗效果。因此，发明人的发现提供了预防和治疗癌症的新方法，包括对标准化学治疗剂有抗性的癌症。

　　因此，在本发明的第一方面，提供了用于治疗或预防癌症的方法中的抗grem1拮抗剂。

　　在本发明的另一方面，提供了用于治疗癌症的方法中的抗癌剂，其中该方法包括分别、顺序或同时施用抗grem1拮抗剂。

　　在本发明的另一方面，提供了治疗癌症的方法，包括给有需要的受试者施用治疗有效量的抗grem1拮抗剂。

　　在本发明的又一方面，提供了包含抗grem1拮抗剂和另外的抗癌剂的组合物或试剂盒。

　　在本发明的另一方面，提供了用于检测患者中癌症的方法，该方法包括测量患者中grem1的基质表达，其中grem1的基质过表达指示该患者患有癌症。

　　在本发明的又一方面，提供了用于对患者进行癌症预后的方法，该方法包括确定所述癌症是否包括grem1的基质过表达，其中癌症中grem1的基质过表达表明患者的预后比grem1的正常基质表达的情况更差。

　　在本发明的另一方面，提供了用于确定患有或疑似患有癌症或处于患癌症风险中的患者是否可能对化学治疗剂的治疗有应答的方法，该方法包括测量患者中grem1的基质表达，从而预测患者是否可能对化学治疗剂的治疗有应答。

　　在本发明的另一方面，提供了用于确定患有或疑似患有癌症或处于患癌症风险中的患者是否可能对grem1拮抗剂的治疗有应答的方法，该方法包括测量患者中grem1的基质表达，从而预测患者是否可能对grem1拮抗剂的治疗有应答。

　　附图简述

　　图1。hek-id1报告基因测定中免疫接种衍生抗体的信号恢复百分比。

　　图2。hek-id1报告基因测定中文库衍生抗体的信号恢复百分比。

　　图3。用人gremlin(图3a)和小鼠gremlin(图3b)滴定的hek-id1报告基因测定的结果，以及抗体7326(显示为抗体pb376)在恢复bmp的信号传导中的效果。

　　图4。gremlin-fab复合物的结构模型，突出显示了可能的bmp结合区和fab表位。

　　图5。接种后第0天和第7天来自小鼠肠隐窝的器官样培养物。培养基含有重组蛋白补充剂和/或测试抗grem1抗体。e＝表皮生长因子，g＝grem1，r＝rspo1。

　　图6。从vil1-grem1小鼠上皮提取的蛋白质的蛋白质印迹。以30mg/kg施用6周的抗体能够恢复上皮psmad1,5信号传导。

　　图7。用抗grem1抗体治疗6周后，用抗体治疗的vil1-grem1动物表型。抗体治疗使小肠表型正常化，并防止深度息肉病的发展。抗体治疗通过将ki67、sox9、ephb2和溶菌酶染色适当限制在肠隐窝的底部，并在小肠绒毛的分化细胞中分辨正常ck20染色，防止绒毛异位隐窝的形成并使细胞命运的决定正常化。

　　图8。长期抗grem1抗体治疗后grem1引发的息肉病小鼠品系的kaplan-meier存活图。

　　图9。apc驱动的肿瘤发生中的基质grem1。a.野生型和villin-creert2上的grem1ish；apcfl/fl小鼠对急性上皮apc缺失的反应显示基质grem1的深度上调。b.apcmin小鼠中基质grem1的转基因缺失减少了在285天时突变apc肿瘤的负荷。c.用抗grem1抗体延长治疗(30mg/kg/周)减少apcmin肿瘤负荷并延长动物寿命。

　　图10。在骨髓瘤患者的原代基质培养物中grem1表达升高。从来自年龄和性别匹配的健康供体和骨髓瘤患者的骨髓环锯衍生的基质细胞培养物中提取rna，并通过实时pcr分析grem1上的表达。与健康供体相比，骨髓瘤患者群中grem1的表达显著更高。数据表示为针对actb标准化的mrna表达。(平均值±标准差，＊＊p<0.001，t检验，正常；n＝17和mm；n＝15)。

　　图11。在健康c57bl6/kalwrij.hsd小鼠和注射5tgm1.bmx1mmpc、患有可通过bli检测到的疾病的小鼠的密质骨中分析了grem1的表达。(平均值±标准差，p＝0.1120，t检验，正常；n＝11且携带肿瘤；n＝9)。(b)从荷瘤小鼠后肢分离的bm基质中的grem1表达与如bli所检测的相应肢体中的肿瘤负荷相关(pearson相关；p<0.05，r2＝0.414)。

　　图12。在与以下共培养24、48和72小时后，分析小鼠骨髓来源的基质op9细胞系中的grem1表达：(a)5tgm1.bmx1细胞，共培养于上层3μm跨孔(transwell)；(b)5tgm1.亲本细胞，直接铺于贴壁基质细胞上。对于接触培养，op9.gfp+细胞通过流式细胞术从5tgm1.亲本mmpc中分选出来，用于通过实时pcr分析grem1的表达。共培养72小时后，在op9基质细胞中观察到grem1表达的显著增加。数据表示为相对于actb、并标准化到仅有培养基的对照的mrna表达。(3次重复实验的平均值±标准误，＊p<0.05，t检验)。

　　图13。在与各种人mm细胞系共培养72小时的正常人基质中分析gremlin1的表达。在收集以用于分析grem1表达之前，从基质中洗涤mm细胞。在kms-11(p＝0.0159)和u266(p＝0.0343)共培养条件下，gremlin1表达显著增加(anova)。数据以与三个单独的正常基质供体的共培养物的重复形式呈现，针对仅有培养基的对照进行了标准化。

　　图14。在op9-基质细胞中grem1转基因表达由(a)rt-pcr和(b)蛋白质印迹证实。如通过相对荧光素酶活性测定的，与仅用op9载体的对照的共培养物相比，5tgm1mmpc与经修饰而过表达grem1的op9-基质细胞在(c)细胞接触(d)跨孔共培养物中显示出升高的增殖率。(3个重复实验的平均值±sem，＊＊p<0.01，＊＊＊p<0.001，t检验)。

　　图15。(a)与用igg对照处理的小鼠相比，注射5tgm1.bmx1mmpc并随后用grem1中和抗体处理的c57bl6/kalwrij小鼠在4周后显示出总体肿瘤负荷的显著降低，如bli所示。平均值±sem，n＝每组13只小鼠＊＊＊＊p<0.0001，单向anova。(b)对注射肿瘤细胞后第4周放血的小鼠进行spep试验。相对于血清白蛋白的m-峰强度被用作疾病负荷的量度。与接受igg对照处理的小鼠相比，用抗grem1抗体处理的小鼠具有显著较低的m-峰强度。平均值±sd，＊＊p<0.01，t检验。(c)用igg对照和grem1中和抗体处理的小鼠的代表性的bli腹侧扫描图像。

　　图16。在op9-grem1过表达细胞或仅有载体的对照存在的情况下，在3μm跨孔中共培养5tgm1mm细胞72小时。通过蛋白质印迹分析来自5tgm1细胞的裂解物的smads1/5/9磷酸化。与仅有载体的对照相比，当在存在grem1过表达bm基质细胞的情况下培养时，5tgm1细胞显示smads1/5/9的磷酸化减少。hsp90用作上样对照。图像代表两次重复实验。

　　图17。在用20ng/ml重组il6处理72小时后，评估bm基质细胞系op9的grem1表达。在用il6刺激的op9细胞中观察到grem1表达显著增加。(3次重复实验的平均值±sem，＊＊p<0.01)。

　　图18。(a)与接受igg对照(ab101.4)处理的小鼠相比，在接种5tgm1.bmx1mmpc之前接受grem1中和抗体(ab7326)处理的c57bl6/kalwrij小鼠在细胞接种后4周显示出总体肿瘤负荷显著降低，如bli所示。平均值±标准误，n＝每组7-8只小鼠＊＊＊＊p<0.0001，单向方差分析。(b)对注射肿瘤细胞后第4周放血的小鼠进行spep试验。相对于血清白蛋白的m-峰强度被用作疾病负荷的量度。与接受igg对照处理的小鼠相比，用抗grem1抗体处理的小鼠具有显著更低的m-峰强度。平均值±标准差，＊＊p<0.0001，t检验。(c)接种肿瘤细胞后4周，用igg对照和grem1中和抗体处理的小鼠的代表性bli腹侧扫描图像。

　　图19。grem1mrna表达的定量rt-pcr分析。在常氧和低氧条件下培养48小时后，在(a)人mda-mb-231-txsa乳腺癌细胞和(b)人mf9乳腺成纤维细胞中分析grem1基因表达(n＝1)。表达水平通过rt-pcr测定，并针对β-肌动蛋白标准化。三个孔的平均值±标准差，＊p<0.05，＊＊p<0.005，学生不成对t检验。

　　图20。响应于grem1刺激的人乳腺癌细胞增殖。用不同浓度的rhgrem1刺激mda-mb-231-txsa细胞，并在常氧(每对的左侧柱)和低氧条件(每对的右侧柱)下培养(a)24小时和(b)48小时。数据是一式三份进行的三次独立实验的代表。平均值±标准差，＊p<0.05，＊＊p<0.005，＊＊＊p<0.0005，tukey多重比较检验的双向方差分析。

　　图21。响应于基质来源的grem1的鼠4t1乳腺癌细胞增殖。将4t1细胞与表达grem1的基质细胞或载体对照op9基质细胞共培养72小时。数据是一式三份进行的三次独立实验的代表。平均值±标准差，＊＊＊p<0.0005，student不配对t检验(双侧)。

　　图22。新型抗grem1抗体(ab7326)逆转了小鼠4t-1乳腺癌细胞中grem1介导的smad1/5/9磷酸化的抑制。用所示的联合处理刺激鼠4t1乳腺癌细胞2小时，并用对磷酸-smad1/5/9有反应性的抗体进行蛋白质印迹分析(上图)。β-肌动蛋白(下图)作为上样对照。

　　图23。单一疗法和联合疗法对vg/min小鼠的效果。

　　图24。多种实体肿瘤中的grem1表达。

　　图25。膀胱癌中grem1表达与存活指示的关系。顶线–grem1低；底线–grem1高。

　　图26。胰腺导管腺癌中grem1表达与存活指示的关系。顶线–grem1低；底线–grem1高。

　　图27。卵巢腺癌中grem1表达与存活指示的关系。顶线–grem1低；底线–grem1高。

　　图28。基底乳腺癌中grem1表达与存活指示的关系。顶线–grem1低；底线–grem1高。

　　图29。肺癌中grem1表达与存活指示的关系。顶线–grem1低；底线–grem1高。

　　图30。用抗grem1抗体处理6周后，经抗体处理的vil1-grem1肠表型。

　　图31。长期抗grem1抗体处理后grem1引发的息肉病小鼠品系的kaplan-meier存活图。(a)vil1-grem1小鼠。(b)vil1-grem1；apcmin小鼠。

　　图32。(a)kaplan-meier图显示，用抗grem1抗体(30mg/kg/周)进行长期处理可减少apcmin肿瘤负荷并延长动物寿命。(b)apcmin和grem1的原位杂交。

　　图33。与igg对照相比，当小鼠(a)接种肿瘤细胞后和(b)接种肿瘤细胞前用grem1中和抗体ab7326处理时，c57bl6/kalwrij小鼠后肢骨中的肿瘤负荷显著降低(如生物发光成像(bioluminescentimaging，bli)所示)。在(c)接种肿瘤细胞后或(d)接种肿瘤细胞前的情形下，在处理组之间观察到脾脏肿瘤负荷呈下降趋势。studentt检验，＊＊p<0.01，＊＊＊p<0.001。

　　图34。对(a)vil1-grem1小鼠和(b)apcmin小鼠中已建立的息肉病进行处理的kaplanmeier存活图。中位生存:apcmin:运载体：192天(n＝15)；apcmin抗grem1:264.5天(n＝10)；vil-grem1运载体:242天(n＝13)；和vil-grem1抗grem1:477天(n＝8)，两种情况下的对数秩p<0.01。箭头表示治疗组处理开始。

　　图35。显示四个处理组中的存活和结肠息肉负荷的图，即：(i)未处理的vil1-grem1小鼠(vg+无处理)；(ii)仅用偶氮甲烷处理的vil1-grem1小鼠(vg+aom+无处理)；(iii)仅用抗grem1抗体处理的vil1-grem1小鼠(vg+α-grem1)；和(iv)用偶氮甲烷和抗grem1抗体处理的vil1-grem1小鼠(vg+aom+α-grem1)。(a)kaplan-meier曲线表示小鼠的存活。(b)显示结肠息肉负荷的图。(c)显示结肠息肉大小的图。

　　图36。wt、未处理的vil1-grem1和抗grem1抗体处理的vil1-grem1小鼠的绒毛中foxl1表达的基质水平(＊:p值<0.05，＊＊:p值<0.01)。

　　图37。vil1-grem1小鼠小肠中foxl1(绿色)和wnt5a(红色)的多重荧光ish。使用dapi对切片进行复染。观察到foxl1和wnt5a的联合表达(在黄色区域)。

　　图38。野生型、vil1-grem1和处理模型中wnt配体和特络细胞(telocyte)细胞标志物的组织表达。抗体处理后，在野生型和vil1-grem1小鼠中使用ish的(a)wnt5a；(b)wnt2b；和(c)foxl特络细胞标志物表达和定量。

　　图39。vil1-grem1的kaplanmeier存活曲线；用对照运载体(线d，中位存活45天，n＝13)和抗grem1抗体以每周15mg/kg(线a，中位存活76.5天，n＝6)、每周30mg/kg(线b，中位存活108天，n＝15，正在进行的实验：两只小鼠仍然存活)和每周60mg/kg(线c，中位存活111天，n＝7，正在进行的实验：五只小鼠仍然存活)处理apcmin小鼠模型。

　　图40。已确立的息肉病的预防治疗和治疗的kaplanmeier生存曲线。箭头表示处理组中的处理开始时间点。

　　(a)vil1-grem1小鼠。运载体(实线)：中位存活242天(n＝13)；抗grem1疗法晚期治疗(点线)：519天，n＝7；抗grem1早期治疗(虚线)：540天，(n＝11)两组的对数秩p<0.01。(b)apcmin。运载体(实线)：中位存活:192天(n＝15)；抗grem1晚期治疗(点线)：261天(n＝11)；抗grem1早期治疗(虚线)：424.5天，(n＝10)，两组的对数秩p<0.01。

　　图41。与用同种型对照抗体(ab101.4)处理的小鼠相比，通过全身性ca注射接种pymt-b01乳腺癌细胞并用grem1中和抗体(ab7326)处理的c57bl6小鼠具有显著降低的肿瘤负荷。(a)在研究结束时(第13天)小鼠的ivis·bli成像显示，与ab101.4处理的小鼠相比，ab7326处理的小鼠的肿瘤负荷显著降低。平均值±标准误，studentt检验，ab101.4；n＝12，ab7326；n＝13，＊p<0.05。(b)在第13天的代表性bli成像。

　　图42。与用同种型对照(ab101.4)处理的小鼠相比，用grem1中和抗体(ab7326)处理的携带pymt-b01肿瘤的c57bl6小鼠的肺和肝转移减少。(a)显示与ab101.4处理的小鼠相比，ab7326处理的小鼠的肺中肿瘤负荷的离体bli成像结果的图。(b)显示ab7326和ab101.4处理组中肝脏肿瘤负荷的bli成像结果的图。平均值±标准误，studentt检验，ab101.4；n＝6，ab7326；n＝7，＊p<0.05。

　　图43。显示用同种型对照抗体(aba33)和grem1中和抗体(ucb6114)处理的携带mda-mb-231肿瘤的nsg小鼠的ivis·bli成像结果的图。平均值±标准误，studentt检验，n＝8，p>0.05。

　　图44。在接种肿瘤细胞后第22天，用同种型对照(aba33)或grem1中和抗体(ucb6114)处理的携带mda-mb-231肿瘤的小鼠的代表性ivis·bli成像。

　　图45。显示用同种型对照抗体(aba33)或grem1中和抗体(ucb6114)处理的携带mda-mb-231肿瘤的nsg小鼠的肺的离体ivisbli成像结果的图。平均值±标准误，studentt检验，n＝8，p>0.05。

　　图46。显示通过全身性ca注射接种pc-3前列腺癌细胞并用grem1中和抗体(ucb6114)或同种型对照抗体(aba33)处理的nsg小鼠bli成像结果的图。对(a)全身；(b)离体肝脏bli；(c)离体后肢；和(d)离体肺进行bli成像。平均值±标准误，studentt检验，n＝5-7，＊p<0.05，＊＊p<0.01，＊＊＊p<0.001。

　　图47。在研究结束时(第25天)，用同种型对照抗体(aba33)或grem1中和抗体(ucb6114)处理全身性pc-3肿瘤负荷的nsg小鼠的代表性bli图像。在最终全身扫描后，解剖肝脏、后肢和肺并立即进行离体成像。

　　发明详述

　　应该理解的是，所公开的产品和方法的不同应用可以根据本领域的具体需要进行调整。还应当理解，这里使用的术语仅仅是为了描述本发明的特定实施例，而不是为了进行限制。

　　此外，如在本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数指代物，除非内容另有明确规定。因此，例如，提及“抑制剂”包括两种或更多种这样的抑制剂，或者提及“寡核苷酸”包括两种或更多种这样的寡核苷酸等。

　　本文引用的所有出版物、专利和专利申请，无论是上文还是下文，在此全部引入作为参考。

　　癌症的治疗和预防

　　本发明提供了用于预防或治疗癌症的方法中的抗grem1拮抗剂。所述癌症通常具有基质(如促结缔组织增生基质(desmoplasticstroma))，典型地具有基质grem1过表达。所述癌症可另外地或替代地具有上皮grem1过表达或由grem1引发。

　　癌症

　　所述癌症可以是具有基质(通常为促结缔组织增生基质)的任何癌症或肿瘤。所述癌症可以是由grem1引发的任何癌症或肿瘤。所述癌症可以是任何观察到基质和/或上皮grem1过表达的癌症。所述癌症或肿瘤可具有基质grem1过表达，而没有上皮grem1过表达。所述癌症或肿瘤可具有上皮grem1过表达，而没有基质grem1过表达。在优选的实施方案中，所述癌症或肿瘤具有在促结缔组织增生基质中的grem1过表达。

　　所述癌症或肿瘤可以是实体瘤。所述实体瘤可具有促结缔组织增生基质。

　　可以治疗的特别优选的癌症包括结肠直肠癌、多发性骨髓瘤、胰腺癌、膀胱癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、十二指肠癌、食道癌、前列腺癌、头颈癌、子宫内膜癌、肝癌、脾癌、骨癌和骨肉瘤。可以治疗的癌症可以是肠癌、结肠癌或直肠癌。待治疗的癌症可以是扩散性癌症，例如转移性癌症。扩散性癌症应该被理解为已从体内最初的起源部位扩散的癌症。例如，扩散性癌症可以是起源于患者的骨髓、结肠、前列腺或乳房组织，但已经扩散到例如患者的肝脏或肺部的癌症。

　　所述grem1拮抗剂也可用于防止癌症的扩散。

　　所述grem1拮抗剂可用于预防与癌症相关的息肉病。

　　分级系统用于癌症生物学和医学，根据癌细胞细胞分化的缺乏对其进行分类。这反映了癌细胞在形态上不同于癌细胞来源组织中发现的健康细胞的程度。分级系统可用于提供特定癌症预计增长速度的指示。通常使用的癌症等级是等级(g)x和1至4级。gx表明癌症等级无法被评估。g1(低级)癌细胞具有与正常健康细胞相似的形态(即，它们分化良好)，并且预计生长缓慢，并且扩散的可能性较小。g2(中级)癌细胞是中等分化的，即它们看起来更不正常，并且预计比g1细胞生长稍快。g3(高级)癌细胞与正常细胞相比具有非常不同的形态(即，它们分化差)，并且预期比g1细胞和g2细胞生长更快。g4(高级)癌细胞是未分化的(也称为间变性的(anaplastic))，并且预计具有最高的增殖能力。

　　癌症分级不同于癌症分期，后者给出了癌症可能如何扩散的指示。常见的癌症分期系统有五个阶段，称为0期：原位癌细胞(即位于它们的正常组织中)；i期：癌症位于身体的一个部位；ii期：癌症局部进展；iii期：癌症也是局部进展(癌症被定为ii期还是iii期可取决于癌症的具体类型)；和iv期：癌症经常已经转移或扩散到其他器官或全身。

　　本领域技术人员知晓如何确定癌症的等级和/或阶段。在一个实施方案中，本发明涉及抗grem1拮抗剂用于治疗和/或预防已建立的癌症的用途。在一个实施方案中，所述癌症是已建立的癌症。已建立的癌症可以是高等级癌症，例如g3或g4癌症。已建立的癌症可以是ii期或以上的癌症。已建立的癌症可以是iii期或iv期癌症。在一个实施方案中，所述已建立的癌症是已经转移的iv期癌症。

　　结肠直肠癌

　　本发明在一个优选方面涉及结肠直肠癌的预防或治疗。作为背景，肠粘膜是一个复杂的生态系统，上皮与其微环境、特别是其下的基质具有相互依赖的关系。间充质-上皮串扰(crosstalk)密切参与调节体内平衡，并在肠再生和癌症中动态改变。细胞信号传导网络是区室间(inter-compartmental)串扰和控制上皮细胞命运决定的效应子途径，但可被结肠直肠癌中的肿瘤微环境所吸收(co-opted)和破坏。

　　目前对结肠直肠癌的化疗管理在过去的20年里没有实质性的改变，其主要是基于使用联合细胞毒性剂(如folfox和folfiri方案，http://www.cancerresearchuk.org/about-cancer/cancer-in-general/treatment/cancer-drugs/drugs)来对抗增殖的肿瘤上皮，而对这些上皮靶向剂的耐药性可能出现。现在比以往更重要的是确定结肠直肠癌的新疗法。

　　因此，一种特别优选的用于治疗的癌症或肿瘤是结肠直肠癌或结肠直肠肿瘤。要治疗的结肠直肠癌的一种特别优选的形式特征在于基质细胞中grem1过表达、即基质grem1过表达的结肠直肠癌。所述基质细胞可以是癌症相关的成纤维细胞。基质grem1过表达的结肠直肠癌可显示没有上皮grem1过表达。具有基质grem1过表达的结肠直肠癌可包括基质foxl1过表达。用于治疗的结肠直肠癌的一种特别合适的形式是间充质亚型结肠直肠癌，也被描述为cms4(guinney等人，natmed2015)的结肠直肠癌。也可以治疗结肠直肠癌的任何其他亚型，包括上文guinney等人所述的cms1、cms2和cms3中的任何一种。本文所述的结肠直肠癌可以是近端结肠直肠癌(或近端结肠直肠肿瘤)。所述近端结肠是脾曲上游的大肠区域，即盲肠、升结肠和横结肠。这个区域的癌症或肿瘤也被称为右侧癌症或肿瘤。本发明可涉及治疗右侧结肠直肠癌或右侧结肠直肠肿瘤。

　　所述结肠直肠癌可以是远端结肠直肠癌(或远端结肠直肠肿瘤)。远端结肠是脾曲下游的大肠区域，即降结肠、乙状结肠和直肠。这个区域的癌症或肿瘤也被称为左侧癌症或肿瘤。本发明可涉及治疗左侧结肠直肠癌或左侧结肠直肠肿瘤。具有grem1基质过表达的癌症可以优选为散发性(sporadic)癌症。所述散发性癌症可由体细胞突变引起。所述散发性癌症可由致癌物质引起。散发性癌症不是由遗传基因突变引起的。所述散发性癌症可引起grem1基质过表达。散发性癌症的增殖可能依赖于癌症中grem1的基质过表达。

　　在北欧白人中，至少有三个邻近grem1的单核苷酸多态性(snp)与结肠直肠癌(crc)的风险独立相关，并且可能在其他种族中也是如此(tomlinson等人，plosgenet，2011)。这与grem1的表达有直接联系，其他snp可能也有类似的作用。此外，bmp2附近的两个常见snp、bmp4附近的两个snp和bmp7附近的一个snp影响bmp配体的表达并影响crc的风险。因此，所述癌症可以包含一个或多个上述snp。

　　根据本发明用于治疗的另一种类型的癌症或肿瘤是在上皮细胞中表现出grem1过表达的癌症或肿瘤。上皮细胞中grem1的过表达可导致所述癌症。所述癌症的增殖可依赖于grem1的上皮过表达。因此，所述癌症可以是上皮来源的。所述癌症通常是结肠直肠癌或十二指肠癌。优选地，所述癌症是结肠直肠癌。所述癌症可以是由grem1引发的。由grem1引发的是指增强grem1活性或表达的诱变事件是所述癌症的原因。这种癌症可由于遗传的基因突变造成。因此，所述癌症可以是家族性癌症(见下文)。

　　要治疗的优选类型的结肠直肠癌可能对一种或多种已知的抗癌剂(比如化学治疗剂)具有抗性，如下文进一步描述的。

　　所述结直肠癌可以是扩散性结肠直肠癌。所述结肠直肠癌可以是转移性结肠直肠癌。所述结肠直肠癌可以是肺转移性结肠直肠癌。所述结肠直肠癌可以是肝脏转移性结肠直肠癌。所述结肠直肠癌可以是骨转移性结肠直肠癌。

　　所述结肠直肠癌的特征可以是foxl1的基质过表达。所述结肠直肠癌的特征可以是一种或多种wnt配体的基质过表达。例如，所述结肠直肠癌可以是特征为wnt5a和/或wnt2b的基质过表达。如果所述结肠直肠癌具有foxl1和/或wnt配体如wnt5a或wnt2b的基质过表达，则所述结肠直肠癌可能特别适合于使用grem1拮抗剂进行预防或治疗。

　　家族性癌症

　　家族性癌症包括由grem1编码基因中的一个或多个突变，或影响grem1基因表达的任何其他突变引起的癌症。常染色体显性病症遗传性混合息肉病综合征(hereditarymixedpolyposissyndrome，hmps)是由grem1上游的40kb复制引起的，其导致病理性区表达转变，从局限性的间充质梯度转变为整个上皮的异位grem1基因表达。

　　接受抗grem1拮抗剂治疗的受试者可先前已被确定有患家族性癌症的风险。例如，所述受试者可已经根据其家族史和/或因为受试者携带已知会导致家族性癌症或增加其发展风险的基因突变而被确定为处于风险中。

　　所述家族性癌症可以是林奇综合征，也称为遗传性非息肉病性结肠直肠癌(hereditarynonpolyposiscolorectalcancer，hnpcc)。所述家族性癌症可以是家族性腺瘤性息肉病(familialadenomatouspolyposis，fap)。

　　本发明人已经证明，使用抗grem1抗体显著增加了apcmin模型小鼠的存活(参见例如下面的实施例11、19和23)。apcmin小鼠是家族性腺瘤性息肉病(fap)的成熟模型。因此，患有fap的患者或受试者可能特别适合用抗grem1拮抗剂治疗。用抗grem1拮抗剂(例如抗grem1抗体)治疗或预防的家族性癌症可以是fap病。可以对以前患有fap病的受试者预防性施用抗grem1拮抗剂，以便例如防止复发。可以对先前未患fap但先前已被确定有患fap风险的受试者预防性施用抗grem1拮抗剂。受试者可能已被确定有患fap的风险，因为已发现该受试者在他们的apc基因中携带有害突变。

　　多发性骨髓瘤

　　本发明在另一个优选方面涉及多发性骨髓瘤的治疗或预防。多发性骨髓瘤(multiplemyeloma，mm)是一种血液恶性肿瘤，其特征是骨髓(bm)中浆细胞(pc)的克隆性增殖。众所周知，bm支持mm中的肿瘤生长，肿瘤细胞和bm之间的双向信号传导对mmpc的持续生长、扩散和存活至关重要。细胞和非细胞bm成分对mmpc的生长和扩散有不同的影响。虽然最近的研究已经确定了在疾病进展中起作用的bm成分，并且已经开发出了针对这些成分的治疗方法，但是mm的标准护理治疗仍然主要依赖于针对肿瘤细胞本身。虽然这种疗法在延长患者生存方面是有效的，但由于bm在mm细胞的生长、扩散、存活和耐药性方面起着重要作用，因此需要针对疾病这一重要方面的更有效的疗法。事实上，mm在很大程度上是一种无法治愈的疾病，疾病复发是有效治疗这种疾病所面临的关键问题。

　　因此，本发明还优选涉及多发性骨髓瘤的治疗或预防。多发性骨髓瘤通常包括骨髓中存在多于一块浆细胞团。因此多发性骨髓瘤通常与骨髓中浆细胞的异常增殖有关。一种特别优选的进行治疗的多发性骨髓瘤形式的特征在于骨髓中grem1的过表达。因此，多发性骨髓瘤可包含基质grem1过表达。基质grem1过表达可存在于骨的密质骨区室内。基质grem1过表达可反映基质细胞数量的增加，或现有的grem1表达基质细胞中grem1表达水平的增加。骨髓可以包含骨组织(osteochrondroreticular)(ocr)干细胞。过表达grem1的基质细胞可包含ocr干细胞。一种优选类型的要治疗的多发性骨髓瘤可对一种或多种已知的抗癌剂(比如化学治疗剂)具有抗性，如下文进一步描述的。

　　乳腺癌

　　本发明在另一个优选方面涉及乳腺癌的治疗或预防。如实施例中更详细描述的，发明人已经观察到grem1诱导乳腺癌细胞增殖，并且进一步观察到乳腺癌细胞与表达grem-1的基质细胞的共培养也诱导这种增殖。此外，grem1拮抗剂能够中和grem1对乳腺癌细胞的激活作用。

　　因此，在乳腺癌中获得的结果支持grem1在乳腺癌细胞增殖中的作用，包括通过在基质细胞中的grem1表达。

　　发明人还在临床前小鼠模型中证明了grem1拮抗剂在预防和治疗乳腺癌中的体内功效(见下面的实施例24)。特别是，观察到用grem1拮抗剂治疗的乳腺癌荷瘤小鼠显示总体肿瘤负荷、肺肿瘤负荷和肝脏肿瘤负荷减少。

　　因此，本发明通过施用抗grem1拮抗剂来治疗和预防乳腺癌。所述乳腺癌可包括基质grem1过表达。过表达grem1的基质乳腺细胞可包含基质成纤维细胞，在本文中也称为癌症相关成纤维细胞。要治疗的优选类型的乳腺癌可对一种或多种已知的抗癌剂(例如化学治疗剂)具有抗性，如下文进一步描述的。所述乳腺癌可是扩散性乳腺癌。所述乳腺癌可以是转移性乳腺癌。所述乳腺癌可是肺转移性乳腺癌。所述乳腺癌可以是肝转移性乳腺癌。所述乳腺癌可以是骨转移性乳腺癌。

　　前列腺癌

　　另一方面，本发明涉及前列腺癌的治疗或预防。

　　如实施例25中更详细描述的，发明人已经在临床前小鼠模型中证明了grem1拮抗剂在预防和治疗前列腺癌中的功效。特别是，观察到用grem1拮抗剂治疗的前列腺癌荷瘤小鼠显示总体肿瘤负荷、肝脏肿瘤负荷、骨骼肿瘤负荷和肺肿瘤负荷减少。

　　因此，本发明通过施用抗grem1拮抗剂进一步提供了前列腺癌的治疗和预防。所述前列腺癌可能是扩散性前列腺癌。所述前列腺癌可是转移性前列腺癌。所述前列腺癌可以是肺转移性前列腺癌。所述前列腺癌可以是肝转移性前列腺癌。所述前列腺癌可以是骨转移性前列腺癌。

　　其他癌症

　　除了在结肠直肠癌、多发性骨髓瘤、乳腺癌和前列腺癌的治疗和预防中的具体示例性应用之外，发明人设想这些癌症中所示的grem1拮抗剂的治疗功效也将适用于具有相应特征的其他癌症的治疗。特别地，设想grem1拮抗剂将对于预防或治疗其中存在基质和/或上皮grem1过表达的癌症有用，这种过表达有助于恶性细胞生长。此类癌症包括胰腺癌、膀胱癌、肺癌、胃癌、十二指肠癌、食道癌、头颈癌、神经胶质瘤、子宫内膜癌、肝癌、脾癌、骨癌和骨肉瘤。使用公开可获得的数据(来自r2服务器，https://hgserver1.amc.nl/cgi-bin/r2/main.cgi)确定的各种实体肿瘤中grem1表达和生存指示之间的关系在图24至29中示出。

　　基质和上皮

　　本文针对预防或治疗所描述的癌症可能包括基质和/或上皮grem1过表达。

　　本文使用的术语“基质细胞”或“基质”是指组织或器官的结构和/或结缔部分。

　　基质组织主要由含有结缔组织细胞的细胞外基质组成。细胞外基质主要由基质(一种多孔的水合凝胶，主要由蛋白多糖聚集体组成)和结缔组织纤维组成。基质中通常有三种类型的纤维:i型胶原纤维、弹性纤维和网状(iii型胶原)纤维。成纤维细胞和周细胞是最常见的基质细胞类型。

　　在癌症或肿瘤的情况下(例如，起始于组织或器官的上皮)，组织或器官的基质可以帮助癌症的生长和发展。与癌症或肿瘤相关的基质可以是由癌症或肿瘤周围的纤维或结缔组织生长引起的促结缔组织增生基质。

　　grem1的过表达可以在基质的任何部分/任何基质细胞中观察到。基质细胞可以是成纤维细胞或成纤维细胞样支持细胞。基质细胞可以是分离自上述任何癌症或肿瘤的促结缔组织增生基质的成纤维细胞或成纤维细胞样支持细胞，如在结肠直肠癌中分离自结肠或直肠、或在多发性骨髓瘤中分离自骨髓。基质细胞可以是与癌症相关的成纤维细胞。

　　本文使用的术语“上皮”是指来源于组织或器官外层的细胞。对于结肠，肠上皮是形成胃肠道小肠和大肠的腔表面或内层的细胞层。它由简单的柱状上皮组成。“上屏障”(“upperbarrier”)是由四种肠上皮细胞类型：吸收性肠细胞、杯状细胞、paneth细胞和肠内分泌细胞组成的肠上皮单层柱状细胞。小肠和大肠的上屏障特征相似。主要区别在于十二指肠、空肠和回肠中存在隆起(elevation)和突起(projection)(圆形皱襞、绒毛和微绒毛)，从而增加了吸收表面。这在结肠中没有被观察到，而是显示出平坦的表面。在称为绒毛的粘膜突起(protrusion)中，有称为李氏隐窝(cryptsoflieberkühn)的弯曲，这是不同的腺体内陷。观察到有上皮grem1过表达的细胞可以是任何上皮细胞，比如任何肠上皮细胞。

　　虽然不受理论的约束，但本发明人推测上皮和/或基质中grem1的过表达可能促进干细胞/祖细胞表型(增加干细胞/祖细胞的数量)，促进上皮干细胞行为并驱动癌症进展和/或对化学治疗剂的抗性。因此，根据本发明使用的grem1拮抗剂可以在要预防或治疗癌症的受试者的组织或器官的上皮中，比如在肠上皮中，防止异常癌症干细胞/祖细胞表型的诱导，减少上皮干细胞行为和/或减少干细胞/祖细胞的数量。grem1拮抗剂影响干细胞行为的能力可以通过评估已知的上皮和癌症干细胞标志物进行临床分析。

　　grem1

　　在蛋白质的上下文中，在本发明中使用的术语grem1或gremlin-1是指通常具有在uniprot条目o60565(seqidno:1)中列出的氨基酸序列的蛋白质，人类grem1。术语greml1和gremlin-1也可以指如下gremlin-1多肽，其:

　　(a)包含seqidno:1的氨基酸序列或由其组成，其带有或不带有n-末端信号肽，即可以包含seqidno:21示出的成熟的肽序列或由其组成；或者

　　(b)是相对于seqidno:1的氨基酸序列具有一个或多个氨基酸取代、修饰、缺失或插入的衍生物，其带有或不带有n-末端信号肽(如seqidno:21所示)，保留了gremlin-1的活性，比如seqidno:20的氨基酸序列。

　　(b)其变体，这种变体通常与seqidno:1(或seqidno:20或seqidno:21)保持至少约60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％或95％的同一性(或甚至约96％、97％、98％或99％的同一性)。换句话说，这种变体可与seqidno:1保持约60％-约99％的同一性，合适地与seqidno:1有约80％-约99％的同一性，更合适地与seqidno:1有约90％-约99％的同一性，最合适地与seqidno:1有约95％-约99％的同一性。下文进一步描述变体。

　　如下文进一步讨论的，残基号通常基于seqidno:1的序列来引用。然而，本领域技术人员可以容易地将残基编号外推至如上所述的衍生物或变体序列。在引用残基号时，本发明还涵盖变体或衍生序列上的这些残基。

　　grem1或gremlin-1核酸序列可以包含seqidno:36或seqidno:37或其变体或者由它们组成。变体核酸序列在下面进一步描述。grem1或gremlin-1核酸序列可以包含或由任何grem1转录本变体组成。grem1转录本变体的例子是转录本1(ncbi:nm_013372.6；ensembl:enst00000560677.5)；转录本2：ncbi:nm_001191323.1；ensembl:enst00000560830.1)；转录本3：ncbi:nm_001191322.1；ensembl:enst00000622074.1。截至2018年6月18日，以上述登记号可获得的序列通过引用并入本文。

　　过表达

　　基质和/或上皮中grem1的过表达可以通过任何手段确定。grem1的过表达典型地通过与相同组织类型的正常细胞中的标志物水平，即基础表达水平进行比较来确定。该表达典型地相对于其他基因(优选包含一个或多个看家基因)的表达水平进行标准化。grem1也可以被分类为在癌症患者人群中显示阈值百分比的过表达或低表达。该人群中每个患者的过表达可高于几何平均数的2倍。该人群中至少10％，更优选至少15％或更多的患者可表现出这种过表达。

　　grem1基质过表达是指基质grem1水平高于匹配的正常组织。例如，基质grem1水平可能比匹配的正常组织高至少两倍。

　　当grem1过表达时，其量可以相对于基础量增加任何量。例如，由grem1引发的癌症如hmps可包括上皮grem1的几千倍的上调，而在正常上皮中没有观察到grem1的表达。包含基质grem过表达的散发性癌症可能包含超过该器官的正常基质中生理性grem1表达水平的任何水平的基质grem1过表达。本领域技术人员能够评估与相同类型的正常细胞中grem1水平相比较基质或上皮中的过表达。

　　所确定的量可以是mrna的量。因此，癌症可能包括grem1mrna的过表达。所述癌症可包含与相同组织类型的正常细胞相比增加量的grem1mrna。该mrna可以增加任何数量。可以使用定量逆转录聚合酶链式反应(qrt-pcr)，比如实时qrt-pcr、定量基因分析(affymetrix/thermofisher)，通过northern印迹或使用微阵列、rna测序来测量mrna的量。优选通过将样品的基因表达与该特定基因在由针对该基因为二倍体的肿瘤组成的参考样品中的表达水平分布进行比较来确定mrna表达。z评分可以使用rnaseq通过预期最大化(rsem)算法(cbioportalforcancergenomics,www.cbioportal.org；gao等人,2013andserami等人2012)来获得。比参考组的平均值高或低2个标准差的z评分优选分别被认为是过表达或低表达。

　　确定的量可以是蛋白质的量。癌症可包括grem1蛋白的过表达，比如与相同组织类型的正常细胞相比。蛋白质可以增加任何数量。可以使用免疫组织化学、蛋白质印迹、质谱或荧光激活细胞分选(facs)，包括通过使用本发明的抗grem1抗体，来测量蛋白质的量。用于确定表达的阈值可因所使用的技术而异，并且可以通过免疫组织化学评分进行验证。

　　因此，如本文所述，grem1拮抗剂在治疗或预防患者中癌症的用途可以包括(a)测量癌症中grem1的量，和(b)如果癌症包含grem1的过表达，则向患者施用grem1拮抗剂，从而治疗或预防所述癌症。grem1的量可以是mrna或蛋白质的量，以及上述任何过表达。

　　样品

　　上述测量可以在来自患者的任何合适的样品中进行。测量可以在从患者中获得的癌症或肿瘤活组织检查中进行。基质和/或上皮(基质和/或上皮细胞)可以从活组织检查中分离出来。活组织检查组织可以是福尔马林固定、石蜡包埋(formalinfixedparaffinembedded，ffpe)的组织或新鲜组织。该组织可以是胰腺组织、膀胱组织、肺组织、子宫内膜组织、乳房组织、胃组织、十二指肠组织、食管组织、骨髓或结肠直肠组织。以上讨论的任何方法都可以在癌症活组织检查中进行。这些方法也可以在患者血液中循环的癌细胞上进行。rna方法可以在尿或血液外泌体上进行。

　　拮抗剂

　　抗grem1拮抗剂是任何降低grem1功能或活性的分子。抗grem1拮抗剂可以以任何量降低grem1的功能或活性。抗grem1拮抗剂可以降低grem1的功能或活性至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％，或者可以阻止grem1的任何功能或活性。抗grem1拮抗剂降低grem1功能或活性的程度可以通过在存在和不存在抗grem1拮抗剂的情况下测量细胞中grem1的功能或活性来确定。细胞可以是正常细胞或癌细胞。细胞可以是如上所述的癌细胞。它们可以是结肠直肠癌细胞。如实施例中所述，结肠直肠癌细胞可存在于vil1-grem1和/或apc(min)小鼠模型中。因此，可以在由grem1引发的癌症或导致基质grem1过表达的散发性癌症的小鼠模型中进行grem1拮抗剂在结肠直肠癌中的活性的体内测定。可替代地，癌细胞可以是多发性骨髓瘤癌细胞，比如从骨髓中存在的骨髓瘤分离出的浆细胞。更一般地说，可以在体外或体内测定通过任何方式显示出降低grem1功能或活性的grem1拮抗剂阻止或减少癌细胞(如结肠直肠癌细胞或多发性骨髓瘤癌细胞或乳腺癌细胞)增殖的能力，或防止、减少或消除癌症或肿瘤的能力。

　　拮抗剂可以通过任何方式降低grem1功能。它可以直接或间接增加或减少影响grem1功能的任何分子的活性或数量。它可以在mrna或蛋白质水平上减少grem1的量。它可以增加grem1的降解。它可以通过抑制性修饰降低grem1的功能。它可以降低增强grem1功能的分子的转录。它可以使用试剂如锌指核酸酶来破坏编码grem1的dna或增强grem1功能的分子。

　　拮抗剂可以是与gremlin-1相互作用的药剂。与gremlin-1相互作用的试剂通常是结合gremlin-1的试剂。与gremlin-1相互作用的试剂可以调节gremlin-1。抑制性调节剂可能对gremlin-1的任何功能有影响，但通常会降低gremlin-1与bpm(bmp2/4/7)的结合。该拮抗剂可以是bmp-7模拟分子。gremlin-1是bmp的负调节因子，因此减少的结合将增加通过bmp的信号传导。活化调节剂可以增加gremlin-1与bmp的结合。

　　bmp结合和信号传导可以通过本领域已知的任何方法检测。例如，本申请的实施例描述了smad磷酸化测试。smad1、5和8在bmp信号传导时被磷酸化。因此，smad磷酸化的增加可用于确定增加的bmp信号传导，这可反映与gremlin-1的结合的减少。实施例还描述了id1报告基因测试，其中id1基因是bmp信号传导的靶基因。因此，该测试中信号传导恢复的增加也可用于确定试剂是否抑制gremlin-1与bmp的结合。

　　拮抗剂可以通过结合grem1的活性位点起作用，或者通过结合在不同的位点别构地起作用。拮抗剂可以通过结合grem1的调节因子或配体起作用，从而减少grem1的活化。拮抗剂可以是可逆的或不可逆的。

　　grem1拮抗剂可以是小分子抑制剂、肽、蛋白质、抗体、多核苷酸、寡核苷酸、反义rna、小干扰rna(sirna)或小发夹rna(shrna)。

　　grem1的拮抗剂可以是与编码grem1的mrna或编码增强grem1活性的分子的mrna特异性杂交的寡核苷酸。grem1的拮抗剂可以是编码任何降低grem1功能的分子的多核苷酸。例如，grem1拮抗剂可以是编码本文所述的抗grem1抗体的多核苷酸。

　　grem1的拮抗剂可以是特异性结合任何靶分子(通常是蛋白质)的抗体，从而直接或间接降低grem1的功能。拮抗剂可以是特异性结合grem1的抗体。在这方面，抗体可以通过变构失活或通过阻断活性所需的其靶标和配体之间的相互作用来降低grem1的功能。

　　拮抗剂与蛋白质残基的相互作用可以通过本领域已知的任何合适的方法来确定，比如通过x射线结晶学确定的残基与试剂之间的距离(通常小于或小于)。如以下实施例中所讨论的，可以被治疗剂靶向的gremlin-1的区域可以包括氨基酸asp92-leu99、arg116-his130、ser137-ser142、cys176-cys178。这些都在gremlin-1表面上突变的那些的以内。

　　抗体拮抗剂

　　本文所指的术语“抗体”包括完整抗体和任何抗原结合片段(即，“抗原结合部分”)或其单链。抗体是指包含至少两条重链(h)和两条轻链(l)的糖蛋白或其抗原结合部分，重链和轻链通过二硫键相互连接。每个重链由一个重链可变区(本文缩写为hcvr或vh)和一个重链恒定区组成。每个轻链由一个轻链可变区(本文缩写为lcvr或vl)和一个轻链恒定区组成。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。vh和vl区域可以进一步细分为高变区，称为互补决定区，其间穿插着更保守的区域，称为框架区。

　　抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的多种细胞(如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(clq)。

　　根据本发明使用的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，并且典型地将是单克隆抗体。根据本发明使用的抗体可以是嵌合抗体、cdr移植抗体、纳米抗体、人或人源化抗体或其任何抗原结合部分。为了产生单克隆抗体和多克隆抗体，实验动物通常是非人类哺乳动物，比如山羊、兔子、大鼠或小鼠，但是抗体也可以在其他物种中产生。

　　多克隆抗体可以通过常规方法产生，比如用目标抗原免疫合适的动物。随后可从动物中取出血液，并纯化igg部分。

　　在需要对动物进行免疫的情况下，可以通过使用众所周知的常规方案对动物(例如非人动物)施用多肽来获得针对gremlin-1的抗体，参见例如《实验免疫学手册》，d.m.weir(编辑)，第4卷，blackwellscientificpublishers,oxford,england,1986。许多温血动物，如兔、小鼠、大鼠、羊、牛、骆驼或猪，都可以被免疫。但是，小鼠、兔、猪和大鼠一般最适合。

　　单克隆抗体可以通过本领域已知的任何方法制备，如杂交瘤技术(kohler&milstein,1975,nature,256:495-497)、三瘤(trioma)技术、人b细胞杂交瘤技术(kozbor等人,1983,immunologytoday,4:72)和ebv杂交瘤技术(cole等人,monoclonalantibodiesandcancertherapy,pp77-96,alanrliss,inc.,1985)。

　　根据本发明使用的抗体也可以使用单淋巴细胞抗体方法通过克隆和表达从单淋巴细胞产生的免疫球蛋白可变区cdna来产生，所述单淋巴细胞被选择用于通过例如babcook，j.等人，1996，proc.natl.acad.sci.usa93(15):7843-7848l；wo92/02551；wo2004/051268和wo2004/106377所描述的方法产生特异性抗体。

　　也可以使用本领域已知的各种噬菌体展示方法来产生抗体，包括brinkman等人公开的方法(摘自j.immunol.methods,1995,182:41-50)，ames等人(j.immunol.methods,1995,184:177-186)，kettleborough等人(eur.j.immunol.1994,24:952-958)，persic等人(gene,19971879-18)，burton等人(advancesinimmunology,1994,57:191-280)和wo90/02809；wo91/10737；wo92/01047；wo92/18619；wo93/11236；wo95/15982；wo95/20401；和美国5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743和5,969,108。

　　全人抗体是指其中重链和轻链的可变区和恒定区(如果存在)都来自人，或者与人来源的序列基本相同，但不必定来自相同抗体的抗体。全人抗体的例子可以包括由例如上述噬菌体展示方法产生的抗体和由小鼠产生的抗体，其中小鼠免疫球蛋白可变区和任选地恒定区基因已经被它们的人对应物替代，例如在欧洲专利0546073,美国专利5,545,806,美国专利5,569,825,美国专利5,625,126,美国专利5,633,425,美国专利5,661,016,美国专利5,770,429,欧洲专利0438474和欧洲专利0463151中的一般性描述。

　　可替代地，根据本发明使用的抗体可以通过包括用gremlin-1免疫原免疫非人类哺乳动物的方法产生；从所述哺乳动物获得抗体制剂；由此衍生出识别gremlin-1的单克隆抗体。

　　根据本发明使用的抗体分子可以包括具有全长重链和轻链的完整抗体分子或其片段或抗原结合部分。术语抗体的“抗原结合部分”是指保留选择性结合抗原的能力的抗体的一个或多个片段。已经表明，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来实现。抗体及其片段和抗原结合部分可以是但不限于fab、修饰的fab、fab’、修饰的fab’、f(ab’)2、fv、单结构域抗体(例如vh或vl或vhh)、scfv、二价、三价或四价抗体、bis-scfv、双抗体、三抗体、四抗体和上述任何一种的表位结合片段(例如参见holliger和hudson，2005，naturebiotechnic.biotech。23(9):1126-1136；adairandlawson,2005,drugdesignreviews-online2(3),209-217)。用于产生和制造这些抗体片段的方法在本领域中是众所周知的(例如参见verm等人,1998,journalofimmunologicalmethods,216,165-181)。本发明中使用的其他抗体片段包括国际专利申请wo2005/003169、wo2005/003170和wo2005/003171中描述的fab和fab’片段以及国际专利申请wo2009/040562中描述的fab-dab片段。多价抗体可以包含多种特异性或者可以是单特异性的(例如参见wo92/22853和wo05/113605)。这些抗体片段可以使用本领域技术人员已知的常规技术获得，并且可以以与完整抗体相同的方式筛选片段以使用。

　　可以根据抗体分子的推测功能，特别是可能需要的效应子功能来选择抗体分子的恒定区结构域，如果存在的话。例如，恒定区结构域可以是人iga、igd、ige、igg或igm结构域。特别地，当抗体分子用于治疗用途并且需要抗体效应子功能时，可以使用人igg恒定区结构域，尤其是igg1和igg3同种型。可替代地，当抗体分子用于治疗目的且不需要抗体效应子功能时，可以使用igg2和igg4同种型。

　　可以通过重组方式制备、表达、产生或分离根据本发明使用的抗体，比如(a)从对于目的免疫球蛋白基因而言为转基因的或跨染色体的动物(例如小鼠)中分离的抗体，或由其制备的杂交瘤，(b)从被转化以表达目的抗体的宿主细胞中分离的抗体，例如从转染瘤中分离的抗体，(c)从重组、组合抗体文库中分离的抗体，和(d)通过涉及免疫球蛋白基因序列与其他dna序列的剪接的任何其他方式制备、表达、产生或分离的抗体。

　　根据本发明使用的抗体可以是人抗体或人源化抗体。本文使用的术语“人抗体”旨在包括具有可变区的抗体，其中框架区和cdr区均来源于人种系免疫球蛋白序列。此外，如果抗体包含恒定区，则该恒定区也来源于人种系免疫球蛋白序列。本文所述的人抗体可包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性突变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，本文所用的术语“人抗体”不旨在包括这样的抗体：其中来源于另一种哺乳动物物种(如小鼠)种系的cdr序列已经被移植到人框架序列上。

　　这种人抗体可以是人单克隆抗体。这种人单克隆抗体可以由杂交瘤产生，该杂交瘤包括从转基因非人动物(例如转基因小鼠)获得的b细胞，该动物具有包含与永生化细胞融合的人重链转基因和轻链转基因的基因组。

　　可以通过体外免疫人淋巴细胞，然后用爱泼斯坦-巴尔病毒转化淋巴细胞来制备人抗体。

　　术语“人抗体衍生物”是指人抗体的任何修饰形式，例如抗体和另一种试剂或抗体的缀合物。

　　术语“人源化抗体”是指cdr移植的抗体分子，其中来自另一种哺乳动物物种(如小鼠)种系的cdr序列已经被移植到人框架序列上。可以在人框架序列内进行另外的框架区修饰。

　　如本文所用，术语“cdr移植的抗体分子”是指这样的抗体分子，其中重链和/或轻链包含来自供体抗体(例如鼠或大鼠单克隆抗体)的一个或多个cdr(如果需要，包括一个或多个修饰的cdr)被移植到受体抗体(例如人抗体)的重链和/或轻链可变区框架中。有关综述请参见vaughan等人，naturebiotechnology,16,535-539,1998。在一个实施方案中，不是转移整个cdr，而是将上述任一cdr中的一个或多个特异性决定残基转移到人抗体框架中(例如，参见kashmiri等人,2005,methods,36,25-34)。在一个实施方案中，只有来自上述一个或多个cdr的特异性决定残基被转移到人抗体框架中。在另一个实施方案中，只有来自上述每个cdr的特异性决定残基被转移到人抗体框架中。

　　当cdr或特异性决定残基被移植时，可以使用任何合适的受体可变区框架序列，考虑到cdr来源的供体抗体的种类/类型，包括小鼠、灵长类和人框架区。合适地，根据本发明的cdr移植抗体具有可变结构域，该可变结构域包含人受体框架区以及一个或多个上述cdr或特异性决定残基。因此，在一个实施方案中提供了中和性cdr移植抗体，其中可变结构域包含人受体框架区和非人供体cdr。

　　可用于本发明的人框架的例子是：kol,newm,rei,eu,tur,tei,layandpom(上述kabat等人)。例如，重链可以使用kol和newm，轻链可以使用rei，重链和轻链都可以使用eu、lay和pom。可替代地，可以使用人种系序列；这些可在例如：http://www.vbase2.org/(见retter等人,nucl.acidsres.(2005)33(附件1),d671-d674)中获得。

　　在本文所述的cdr移植抗体中，受体重链和轻链不一定需要来源于相同的抗体，并且如果需要，可以包含具有来源于不同链的框架区的复合链。

　　此外，在本文所述的cdr移植抗体中，框架区不需要与受体抗体的序列完全相同。例如，对于该受体链类别或类型，不常见的残基可被改变为更频繁出现的残基。或者，可以改变受体框架区中的选定残基，使其对应于供体抗体中相同位置的残基(参见reichmann等人，1998，nature,332,323-324)。这种变化应保持在最低限度以恢复供体抗体亲和力。wo91/09967中提出了选择受体框架区中可能需要改变的残基的方案。

　　本领域技术人员还将理解，抗体可以经历多种翻译后修饰。这些修饰的类型和程度通常取决于用于表达抗体的宿主细胞系以及培养条件。这种修饰可以包括糖基化、甲硫氨酸氧化、二酮哌嗪形成、天冬氨酸异构化和天冬酰胺脱酰胺化的变化。一种常见的修饰是由于羧肽酶的作用(如harris,rj.journalofchromatography705:129-134,1995中所述)导致羧基末端碱性残基(如赖氨酸或精氨酸)的缺失。

　　在一个实施方案中，抗体重链包含ch1结构域，抗体轻链包含cl结构域，κ或λ。

　　生物分子，如抗体或片段，含有酸性和/或碱性官能团，从而赋予分子净正电荷或负电荷。总的“观察到的”电荷数量将取决于实体的绝对氨基酸序列、3d结构中带电基团的局部环境和分子的环境条件。等电点(pi)是特定分子或表面不带净电荷的ph。在一个实施方案中，根据本公开的抗体或片段具有至少为7的等电点(pi)。在一个实施方案中，抗体或片段的等电点至少为8，比如8.5、8.6、8.7、8.8或9。在一个实施方案中，抗体的pi为8。诸如＊＊expasyhttp://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html(见walker,theproteomicsprotocolshandbook,humanapress(2005),571-607)的程序可用于预测抗体或片段的等电点。

　　为了表征优选的gremlin-1表位，发明人单独结晶了人gremlin-1，并与称为ab7326(fab片段)的抗体复合。gremlin-1的结晶使得bmp结合位点的推定残基得以确定。此外，用ab7326(一种变构抑制抗体)结晶，使得抗体表位中的残基得以确定。结合该表位的抗体在治疗与gremlin-1相关的疾病中具有作为治疗剂的特定潜力。

　　本文所述的优选的ab7326抗体已被鉴定结合下列gremlin-1的残基:ile110(131)、lys126(147)、lys127(148)、phe128(149)、thr129(150)、thr130(151)、arg148(169)、lys153(174)和gln154(175)，其中lys126(147)、lys127(148)、phe128(149)、thr129(150)、thr130(151)、arg148(169)、lys153(174)和gln154(175)存在于一个gremlin-1单体上，ile110(131)存在于第二gremlin-1单体上。不在括号中的编号是基于结构文件(与基于结构比对的鼠gremlin-2的编号匹配)。括号中的编号代表基于seqidno:1的uniprot条目o60565。如实施例部分所讨论的，这些表位残基是通过对gremlin-1-ab7326fab复合物的处进行ncont分析来鉴定的。

　　因此，本文所述的抗体可结合包含至少一个选自ile131、lys147、lys148、phe149、thr150、thr151、arg169、lys174和gln175的残基的表位(残基号基于seqidno:1)。本文所述的抗体可结合包含2、3、4、5、6、7、8或所有9个这些残基(优选至少5个残基)的表位。

　　本文所述的抗体还可以识别其中ile131存在于与其他残基不同的gremlin-1单体上的表位。

　　虽然这些残基是为人gremlin-1的特定序列提供的，但是本领域技术人员可以使用常规技术容易地将这些残基的位置外推至其他相应的gremlin序列(例如小鼠)。因此，本发明还提供了与包含这些其它gremlin序列中相应残基的表位结合的抗体。

　　为了筛选结合特定表位的抗体，可以进行常规的交叉阻断测试，如在antibodies,harlowandlane(coldspringharborpress,coldspringharb.,ny)中所述。其他方法包括丙氨酸扫描突变体(alaninescanningmutants)、肽印迹(reineke(2004)methodsmolbiol248:443-63)或肽切割分析。此外，可以采用诸如抗原表位切除、抗原表位提取和化学修饰的方法(tomer(2000)proteinscience9:487-496)。这样的方法在本领域是众所周知的

　　抗体表位也可以通过x射线结晶学分析来确定。因此，本公开的抗体可以通过结合到gremlin-1的抗体的x射线晶体学分析来评估。特别地，可以以这种方式通过确定gremlin-1上抗体互补位(paratope)残基内的残基来鉴定表位。

　　因此，本文所述的抗体可以结合包含至少一个选自trp93、phe117、tyr119、phe125、tyr126和phe138的残基的gremlin-1上的表位，其中残基编号根据seqidno:1。本文进一步描述了结合包括trp93、phe117、tyr119、phe125、tyr126和phe138的所有的表位的抗体。另外描述的是结合包含以下残基的表位的抗体:ile131、lys147、lys148、phe149、thr150、thr151、arg169、lys174和gln175。优选地，lys147、lys148、phe149、thr150、thr151、arg169、lys174和gln175位于gremlin-1的一个单体上，ile131位于gremlin-1的另一个单体上(gremlin-1二聚体结合bmp二聚体)。

　　如果通过x射线结晶学测定，抗体互补位在gremlin-1残基的范围内，则抗体可结合上述gremlin-1残基。

　　结合本文公开的表位的抗体可以包含seqidno:4至6(分别为hcdr1/hcdr2/hcdr3)的至少一个、至少两个或全部三个重链cdr序列。这些是如使用kabat方法测定的实施例的ab7326抗体的hcdr1/hcdr2/hcdr3序列。

　　用于确定cdr序列的kabat和chothia方法(以及其他技术)是本领域众所周知的。可以使用任何合适的方法来确定cdr序列，并且在本发明中，虽然通常使用kabat，但是也可以使用其他技术。在本发明中，seqidno:3代表了使用chothia&kabat联合定义所确定的ab7326hcdr1序列。

　　根据本发明使用的抗体可以包含seqidno:7至9(分别为lcdr1/lcdr2/lcdr3)的至少一个、至少两个或所有三个轻链cdr序列。这些是使用kabat方法的ab7326的lcdr1/lcdr2/lcdr3序列。

　　所述抗体优选包含至少一个seqidno:6的hcdr3序列。

　　典型地，所述抗体包含至少一个选自seqidno:4至6的重链cdr序列和至少一个选自seqidno:7-9的轻链cdr序列。所述抗体可以包含至少两个选自seqidno:4至6的重链cdr序列和至少两个选自seqidno:7-9的轻链cdr序列。所述抗体典型地包含所有三个seqidno:4至6的重链cdr序列(分别为hcdr1/hcdr2/hcdr3)和所有三个seqidno:7-9的轻链cdr序列(分别为lcdr1/lcdr2/lcdr3)。所述抗体可以是嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。

　　所述抗体可以包含seqidno:10或12的重链可变区(hcvr)(ab7326变体1和2的hcvr)。所述抗体可以包含seqidno:11或13的轻链可变区(lcvr)(ab7326变体1和2的lcvr)。所述抗体优选包含seqidno:10或12的重链可变区序列和seqidno:11或13的轻链可变区序列(尤其是seqidno:10/11或12/13的hcvr/lvcr对)。

　　所述抗体可以包含下述的重链(h-链)序列：

　　seqidno:14小鼠全长igg1重链变体1，或

　　seqidno:28小鼠全长igg1重链变体2，或

　　seqidno:30人全长igg1重链变体1，或

　　seqidno:16人全长igg1重链变体2，或

　　seqidno:22人全长igg4p重链变体1，或

　　seqidno:34人全长igg4p重链变体2，或

　　seqidno:18fab重链变体1，或

　　seqidno:32fab重链变体2。

　　所述抗体可以包含下述的轻链(l-链)序列：

　　seqidno:15小鼠全长igg1轻链变体1，或

　　seqidno:29小鼠全长igg1轻链变体2，或

　　seqidno:31人全长igg1轻链变体1，或

　　seqidno:17人全长igg1轻链变体2，或

　　seqidno:23人全长igg4p轻链变体1，或

　　seqidno:35人全长igg4p轻链变体2，或

　　seqidno:19fab轻链变体1，或

　　seqidno:33fab轻链变体2。

　　在一个实例中，所述抗体包含下述的重链/轻链序列对：

　　seqidno:14/15小鼠全长igg1变体1，或

　　seqidno:28/29小鼠全长igg1变体2，或

　　seqidno:30/31人全长igg1变体1，或

　　seqidno:16/17人全长igg1变体2，或

　　seqidno:22/23人全长igg4p变体1，或

　　seqidno:34/35人全长igg4p变体2，或

　　seqidno:18/19fab轻链变体1，或

　　seqidno:32/33fab轻链变体2。

　　相应序列的变体形式可以互换。例如，所述抗体可以包含下述的重链/轻链序列对：

　　seqidno:14/29小鼠全长igg1重链变体1/轻链变体2，或

　　seqidno:28/15小鼠全长igg1重链变体2/轻链变体1，或

　　seqidno:30/17人全长igg1重链变体1/轻链变体2，或

　　seqidno:16/31人全长igg1重链变体2/轻链变体1，或

　　seqidno:22/35人全长igg4p重链变体1/轻链变体2，或

　　seqidno:34/23人全长igg4p重链变体2/轻链变体1，或

　　seqidno:18/33fab重链变体1/轻链变体2，或

　　seqidno:32/19fab重链变体2/轻链变体1。

　　所述抗体可以是嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。

　　所述抗体可以可替代地是或可以包含上述特定序列之一的变体。抗体变体的以下描述也适用于如上所述的grem1多肽变体的选择。

　　例如，变体可以是任何上述氨基酸序列的取代、缺失或添加变体。

　　变体抗体可以包含1、2、3、4、5、最多10、最多20个或更多(通常最多50个)来自上述特定序列的氨基酸取代和/或缺失。“缺失”变体可包括单个氨基酸的缺失、小组氨基酸如2、3、4或5个氨基酸的缺失，或较大氨基酸区域的缺失，如特定氨基酸结构域或其他特征的缺失。“取代”变体通常涉及用相同数量的氨基酸替换一个或多个氨基酸，并进行保守的氨基酸取代。例如，氨基酸可以被具有相似性质的替代氨基酸取代，例如，另一种碱性氨基酸、另一种酸性氨基酸、另一种中性氨基酸、另一种带电氨基酸、另一种亲水氨基酸、另一种疏水氨基酸、另一种极性氨基酸、另一种芳香族氨基酸或另一种脂肪族氨基酸。可用于选择合适的取代的20种主要氨基酸的一些性质如下:

　　“衍生物”或“变体”通常包括其中出现在序列中的氨基酸是其结构类似物而不是天然存在的氨基酸的那些。序列中使用的氨基酸也可以是衍生的或修饰的，例如标记的，只要抗体的功能不会受到显著的不利影响。

　　如上所述的衍生物和变体可以在抗体的合成过程中或通过产生后修饰来制备，或者当抗体是重组形式时，使用已知的定点诱变、随机诱变或核酸酶切和/或连接的技术来制备。

　　变体抗体可以具有与本文公开的氨基酸序列(特别是hcvr/lcvr序列和h-链和l-链序列)具有超过约60％，或超过约70％，例如75％或80％，典型地超过约85％，例如超过约90％或95％氨基酸同一性的氨基酸序列。此外，所述抗体可以是变体，其与本文公开的hcvr/lcvr序列和h-链和l-链序列具有超过约60％，或超过约70％，例如75％或80％，典型地超过约85％，例如超过约90％或95％的氨基酸同一性，同时保留这些序列所公开的精确cdr。变体可以保留与本文公开的hcvr/lcvr序列和h-链和l-链序列至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性(在某些情况下，同时保留精确的cdr)。

　　变体典型地保持约60％至约99％的同一性，约80％至约99％的同一性，约90％至约99％的同一性或约95％至约99％的同一性。这种水平的氨基酸同一性可以在相关的序列号序列的全长上或在该序列的一部分上看到，例如在大约20、30、50、75、100、150、200或更多个氨基酸上看到，取决于全长多肽的大小。

　　就氨基酸序列而言，“序列同一性”是指当使用clustalw(thompson等人，1994，上文)评估时具有所述值的序列，其具有以下参数:

　　成对比对参数-方法：精确，矩阵：pam，空位罚分(gapopenpenalty)：10.00，空位延伸罚分(gapextensionpenalty)：0.10；

　　多个比对参数-矩阵：pam，空位罚分：10.00，％延迟识别：30，惩罚末端空位：开，空位分离距离：0，负矩阵:否，空位延伸罚分：0.20，特定残基的空位罚分：开，亲水性空位罚分：开，亲水性残基：gpsndqekr。特定残基的序列同一性旨在包括简单衍生的相同残基。

　　因此，提供了具有维持这些链的功能或活性的特定序列和变体的抗体。

　　抗体可以与上述定义的h-链/l-链、hcvr/lcvr或cdr序列竞争结合gremlin-1或结合相同的表位。特别地，抗体可以与包含seqidno:4/5/6/7/8/9的hcdr1/hcdr2/hcdr3/lcdr1/lcdr2/lcdr3序列组合的抗体竞争结合gremlin-1或结合相同的表位。抗体可能与包含seqidno:10/11或12/13的hcvr和lcvr序列对或seqidno:14/15或16/17的全长链的抗体竞争结合gremlin-1，或结合相同的表位。

　　术语“表位”是由抗体结合的抗原的区域。表位可以被定义为结构性或功能性的。功能表位通常是结构表位的一个子集，其残基直接影响相互作用的亲和力。表位也可以是构象的，即由非线性氨基酸组成。在某些实施方案中，表位可以包括分子的化学活性表面基团的决定簇，如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且在某些实施方案中，可以具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。

　　通过使用本领域已知的常规方法，可以容易地确定抗体是否与参考抗体结合相同的表位，或者与参考抗体竞争结合。例如，为了确定测试抗体是否与本发明的参考抗体结合相同的表位，允许参考抗体在饱和条件下与蛋白质或肽结合。接下来，评估测试抗体与蛋白质或肽结合的能力。如果测试抗体在蛋白质或肽与参考抗体饱和结合后能够与蛋白质或肽结合，则可以得出结论，测试抗体与参考抗体结合的表位不同。另一方面，如果测试抗体在蛋白质或肽与参考抗体饱和结合后不能与蛋白质或肽结合，那么测试抗体可能结合与本发明的参考抗体结合的表位相同的表位。

　　为了确定抗体是否与参考抗体竞争结合，上述结合方法在两个方向上进行。在第一个方向上，允许参考抗体在饱和条件下与蛋白质/肽结合，然后评估测试抗体与蛋白质/肽分子的结合。在第二个方向上，允许测试抗体在饱和条件下与蛋白质/肽结合，然后评估参考抗体与蛋白质/肽的结合。如果在两个方向上，只有第一个(饱和的)抗体能够与蛋白质/肽结合，那么可以得出结论，测试抗体和参考抗体竞争结合该蛋白质/肽。如本领域技术人员所理解的，与参考抗体竞争结合的抗体不必定结合与参考抗体相同的表位，但可通过结合重叠或相邻的表位在空间上阻断参考抗体的结合。

　　如果两种抗体中的每种竞争性地抑制(阻断)另一种抗体与抗原的结合，则两种抗体结合相同或重叠的表位。也就是说，一种抗体的1、5、10、20或100倍过量抑制另一种抗体的结合至少50％、75％、90％或甚至99％，如在竞争性结合测试中测量的那样(参见，例如，junghans等人,cancerres,1990:50:1495-1502)。可替代地，如果抗原中减少或消除一种抗体结合的氨基酸的所有突变减少或消除另一种抗体的结合，则两种抗体有相同的表位。如果减少或消除一种抗体结合的氨基酸的一些突变减少或消除另一种抗体的结合，则两种抗体有重叠的表位。

　　然后可以进行另外的常规实验(例如，肽突变和结合分析)，以确认观察到的测试抗体结合的缺乏实际上是由于与参考抗体结合相同的表位，还是说空间阻断(或另一种现象)是观察到的结合缺乏的原因。可以使用elisa、ria、表面离子共振、流式细胞术或本领域可获得的任何其他定量或定性抗体结合测试来进行这类实验。

　　可以通过例如标准elisa或蛋白质印迹法来检测抗体与gremlin-1的结合。elisa也可用于筛选与靶蛋白呈阳性反应的杂交瘤。抗体的结合选择性也可以通过监测抗体与表达靶蛋白的细胞的结合来确定，例如通过流式细胞术。因此，筛选方法可以包括通过进行elisa或蛋白质印迹或通过流式细胞术来鉴定能够结合gremlin-1的抗体的步骤。

　　抗体可以选择性(或特异性)识别gremlin-1。当抗体或其它化合物与对其具有选择性的蛋白质以优先或高亲和力结合，但基本上不与其它蛋白质结合或以低亲和力结合时，其“选择性结合”或“选择性识别”蛋白质。可以通过确定抗体是否结合如上所述的其他相关蛋白或是否区分它们来进一步研究抗体的选择性。根据本发明使用的抗体通常识别人gremlin-1.。

　　抗体也可对相关蛋白质，或对人gremlin-1和对来自其他物种的gremlin-1具有交叉反应性。

　　就特异性(或选择性)而言，应理解抗体与目标蛋白结合，而与任何其他分子没有显著的交叉反应性。交叉反应性可以通过本文描述的任何合适的方法来评估。如果抗体与另一个分子的结合强度为与目标蛋白的结合强度的至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或100％，则可以认为抗体的交叉反应性是显著的。特异性(或选择性)的抗体可以以小于其与目标蛋白结合的强度的约90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％或20％的强度与另一分子结合。抗体与另一分子的结合强度可以为小于其与目标蛋白结合强度的约20％、小于约15％、小于约10％或小于约5％、小于约2％或小于约1％。

　　先前已经描述了抗gremlin抗体，例如wo2014/159010a1(regeneron)描述了抑制gremlin-1活性的抗gremlin抗体，在25℃时结合亲和力kd值为从625pm至270nm。ciuclan等人(2013)描述了结合亲和力kd为5.6×10-10m的抗gremlin-1单克隆抗体。。

　　本文(以及2017年12月19日提交的pct/gb2017/083650，其全部内容通过引用并入本文)中新描述的抗gremlin-1抗体是gremlin-1活性的变构抑制剂，并且结合到远离bmp结合位点的如上所述的新表位。抗体以异常高的亲和力结合gremlin-1，kd值<100pm。因此，这些抗体代表了对目前可用抗体的显著改进，并有望特别用于治疗gremlin-1介导的疾病。

　　因此，适用于本发明的抗体可以对(人)gremlin-1具有高亲和力结合。抗体可具有<1nm的解离常数(kd)，优选<500pm。在一个实例中，抗体具有小于200pm的解离常数(kd)。在一个实例中，抗体具有小于100pm的解离常数(kd)。多种方法可用于确定抗体对其靶抗原的结合亲和力，如表面离子共振测定法、饱和测定法或免疫测定法，如elisa或ria，这是本领域技术人员所熟知的。确定结合亲和力的示例性方法是使用cm5传感器芯片在biacoretm2000仪器(biacoreab，freiburg，德国)上进行表面离子共振分析，如krinner等人,(2007)mol.immunol.february；44(5):916-25.(epub2006may11))所述。

　　根据本发明使用的抗体通常是抑制性抗体。gremlin-1负向调节bmp-2、4和7，因此抑制gremlin-1导致通过bmp的信号传导增加。

　　如上所述，本申请的实施例描述了用于筛选抗体是否能够抑制gremlin1的两种功能性测试，即smad磷酸化测试和hekid1报告基因测试。典型地，抑制性抗体恢复smad磷酸化和/或在hekid1报告基因测试中恢复bmp的信号传导。与bmp对照相比，smad磷酸化可以恢复到至少80％、90％或100％。在hekid1报告基因测试中，抑制性抗体的ic50可小于10nm，优选小于5nm。

　　一旦鉴定和选择了合适的抗体，可以通过本领域已知的方法鉴定抗体的氨基酸序列。编码抗体的基因可以用简并引物克隆。抗体可以通过常规方法重组产生。

　　本公开还提供了编码本文新描述的抗体分子的重链和/或轻链可变区(或全长h-链和l-链)的分离的dna序列。

　　变体多核苷酸可以包含序列表中给出的任何核酸序列(包括grem1和抗grem1抗体核酸序列)的1、2、3、4、5、最多10、最多20、最多30、最多40、最多50、最多75个或更多个核酸取代和/或缺失。通常，变体具有1-20、1-50、1-75或1-100个取代和/或缺失。

　　合适的变体可以与本文公开的任何一种核酸序列的多核苷酸至少约70％同源，通常与其至少约80％或90％同源，更合适的是至少约95％、97％或99％同源。变体可以保持至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。变体通常保持约60％至约99％的同一性，约80％至约99％的同一性，约90％至约99％的同一性或约95％至约99％的同一性。这些水平的同源性和同一性通常至少存在于多核苷酸的编码区。测量同源性的方法在本领域是众所周知的，并且本领域技术人员将理解，在本文中，同源性是基于核酸同一性来计算的。这种同源性可以存在于至少约15个、至少约30个、例如至少约40个、60个、100个、200个或更多个连续核苷酸(取决于长度)的区域内。这种同源性可存在于未修饰的多核苷酸序列的整个长度上。

　　测量多核苷酸同源性或同一性的方法是本领域已知的。例如，uwgcg软件包提供了bestfit程序，该程序可用于计算同源性(例如，用其默认设置)(devereux等人(1984)nucleicacidsresearch12,p387-395)。

　　pileup和blast算法也可用于计算同源性或排列序列(通常基于它们的默认设置)，例如在altschuls.f.(1993)jmolevol36:290-300；altschul,s,f等人(1990)jmolbiol215:403-10中所述。

　　用于进行blast分析的软件可通过国家生物技术信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。该算法涉及首先通过识别查询序列中长度为w的短字节来识别高评分序列对(hsp)，所述短字节是当短字节与数据库序列中相同长度的字节对齐时匹配或满足某个正值阈值分数t的字节。t被称为邻近字节评分阈值(neighbourhoodwordscorethreshold)(altschul等人，上文)。这些最初的邻近字节命中充当种子，用于启动搜索以找到包含它们的hsp。字节命中沿着每个序列在两个方向上延伸，直到累积比对分数可以增加为止。当下列情况发生时，在每个方向上的字节命中延伸停止：由于一个或多个负评分残基比对的累积，累积比对评分变为零或更低；或者到达任一序列的末尾。blast算法参数w、t和x决定比对的灵敏度和速度。blast程序默认使用字长(w)为11，blosum62评分矩阵(见henikoff和henikoff(1992)proc.natl.acad.sci.usa89:10915-10919)，比对(b)为50，期望(e)为10，m＝5，n＝4，以及两条链的比较。

　　blast算法对两个序列之间的相似性进行统计分析；例如，karlin和altschul(1993)proc.natl.acad.sci.usa90:5873-5787。blast算法提供的一种相似性度量是最小和概率(p(n))，它提供了两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果第一序列与第二序列的比较中的最小和概率小于约1，典型地小于约0.1，合适地小于约0.01，最合适地小于约0.001，则认为一个序列与另一个序列相似。例如，最小和概率可以在约1至约0.001的范围内，通常约0.01至约0.001。

　　同源物可以与相关多核苷酸中的序列不同少于约3、5、10、15、20个或更多个突变(每个突变可以是取代、缺失或插入)。例如，同源物可有3-50个突变、通常是3-20个突变的不同。可以在同源物的至少30个，例如至少约40个、60个或100个或更多个连续核苷酸的区域上测量这些突变。

　　在一个实施方案中，由于遗传密码中的冗余，变体序列可以不同于序列表中给出的特定序列。dna编码有4个主要的核酸残基(a、t、c和g)，并使用这些残基来“拼写”代表生物体基因中编码蛋白质的氨基酸的三个字母密码子。沿着dna分子的线性密码子序列被翻译成由这些基因编码的蛋白质中氨基酸的线性序列。该编码是高度简并的，61个密码子编码20种天然氨基酸，3个密码子代表“停止”信号。因此，大多数氨基酸是由大于一个密码子编码的——事实上有几个是由四个或更多不同的密码子编码的。因此，本发明的变体多核苷酸可以编码与本发明的另一种多核苷酸相同的多肽序列，但是可以具有不同的核酸序列，这是由于使用不同的密码子来编码相同的氨基酸。

　　该dna序列可以包括合成的dna，例如通过化学处理产生的合成的dna，cdna，基因组dna或其任意组合。

　　可以通过本领域技术人员熟知的方法获得编码本文所述抗体分子的dna序列。例如，可以根据需要从确定的dna序列或基于相应的氨基酸序列合成编码部分或全部抗体重链和轻链的dna序列。

　　构建载体的一般方法、转染方法和培养方法是本领域技术人员熟知的。在这方面，可参考冷泉港出版社出版的“currentprotocolsinmolecularbiology”,1999,f.m.ausubel(编辑),wileyinterscience,newyorkandthemaniatismanual。

　　核酸拮抗剂

　　多核苷酸，如核酸，是包含两个或多个核苷酸的聚合物。核苷酸可以是天然的或人工的。核苷酸通常含有一个核碱基、一个糖和至少一个连接基团，如磷酸酯、2’邻甲基、2’甲氧基乙基、氨基磷酸酯、甲基磷酸酯或硫代磷酸酯基团。核碱基通常是杂环的。核碱基包括但不限于嘌呤和嘧啶，更具体地说是腺嘌呤(a)、鸟嘌呤(g)、胸腺嘧啶(t)、尿嘧啶(u)和胞嘧啶(c)。糖通常是戊糖。核苷酸糖包括但不限于核糖和脱氧核糖。核苷酸通常是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。核苷酸通常含有一磷酸、二磷酸或三磷酸。磷酸盐可以附着在核苷酸的5’或3’侧。

　　核苷酸包括但不限于腺苷一磷酸(amp)、腺苷二磷酸(adp)、腺苷三磷酸(atp)、鸟苷一磷酸(gmp)、鸟苷二磷酸(gdp)、鸟苷三磷酸(gtp)、胸苷一磷酸(tmp)、胸苷二磷酸(tdp)、胸苷三磷酸(ttp)、尿苷一磷酸(ump)、尿苷二磷酸(udp)、尿苷三磷酸(utp)、胞苷一磷酸(cmp)、胞苷二磷酸(cdp)、胞苷三磷酸(ctp)、5-甲基胞苷一磷酸、5-甲基胞苷二磷酸、5-甲基胞苷三磷酸、5-羟基甲基胞苷一磷酸、5-羟基甲基胞苷二磷酸、5-羟基甲基胞苷三磷酸、环腺苷一磷酸(camp)、环鸟苷一磷酸(cgmp)、腺苷三磷酸(atp)、脱氧腺苷一磷酸(damp)、脱氧腺苷二磷酸(dadp)、脱氧腺苷三磷酸(datp)、脱氧鸟苷一磷酸(dgmp)、脱氧鸟苷二磷酸(dgdp)、脱氧鸟苷三磷酸(dgtp)、脱氧胸苷一磷酸(dtmp)、脱氧胸苷二磷酸(dtdp)、脱氧胸苷三磷酸(dttp)、脱氧尿苷一磷酸(dump)、脱氧尿苷二磷酸(dudp)、脱氧尿苷三磷酸(dutp)、脱氧胞苷一磷酸(dcmp)、脱氧胞苷二磷酸(dcdp)和脱氧胞苷三磷酸(dctp)、5-甲基-2’-脱氧胞苷一磷酸、5-甲基-2’-脱氧胞苷二磷酸、5-甲基-2’-脱氧胞苷三磷酸、5-羟基甲基2’-脱氧胞苷一磷酸、5-羟基甲基2’-脱氧胞苷二磷酸、5-羟基甲基2’-脱氧胞苷三磷酸。核苷酸优选选自amp、tmp、gmp、ump、damp、dtmp、dgmp或dcmp。

　　核苷酸可包含额外的修饰。尤其是，合适的修饰的核苷酸包括但不限于2’氨基嘧啶(如2’-氨基胞苷和2’-氨基尿苷)、2’-羟基嘌呤(如2’-氟嘧啶(如2’-氟胞苷和2’氟尿苷))、羟基嘧啶(如5’-α-p-硼烷尿苷)、2’-邻甲基核苷酸(如2’-邻甲基腺苷、2’-邻甲基鸟苷、2’-邻甲基胞苷和2’-邻甲基尿苷)、4’-硫嘧啶(如4’-硫尿苷和4’-硫胞苷)和具有核碱基修饰的核苷酸(如5-戊烯基-2’脱氧尿苷、5-(3-氨丙基)-尿苷和1,6-二氨基己基-n-5-氨甲酰基甲基尿苷)。

　　多核苷酸中的核苷酸可以以任何方式相互连接。核苷酸可以通过磷酸酯、2’邻-甲基、2’甲氧基-乙基、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯或硫代磷酸酯连接。如在核酸中，核苷酸典型地由它们的糖和磷酸基团连接。核苷酸可以像嘧啶二聚体一样通过它们的核碱基连接。

　　grem1拮抗剂可以是编码本文所述的抗grem1抗体的多核苷酸。

　　多核苷酸可以是核酸，如脱氧核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna)。多核苷酸可以是本领域已知的任何合成核酸，如肽核酸(pna)、甘油核酸(gna)、苏糖核酸(tna)、锁核酸(lockednucleicacid)(lna)、吗啉代核酸或具有核苷酸侧链的其他合成聚合物。多核苷酸可以是单链或双链的。

　　多核苷酸序列可以被克隆到任何合适的表达载体中。在表达载体中，编码构建体的多核苷酸序列典型地与能够提供由宿主细胞表达编码序列的控制序列可操作地连接。这样的表达载体可用于表达构建体。

　　在一个实施方案中，抗grem1拮抗剂是编码本文所述的抗grem1抗体的多核苷酸。该多核苷酸可被提供用于基因治疗。多核苷酸可以在能够在体内提供抗grem1抗体表达的任何合适的载体中被提供。

　　编码抗grem1抗体的多核苷酸可以是dna序列。该dna序列可以在任何合适的载体中被提供，例如表达载体，用于给有需要的受试者施用。例如，可以在能够在体内提供抗grem1抗体表达的表达载体中向受试者施用该dna序列。表达载体可以是病毒表达载体，如腺相关病毒(aav)载体。在一个实施方案中，抗grem1拮抗剂是编码本文所述的抗grem1抗体的dna序列。在一个实施方案中，抗grem1拮抗剂是用于基因治疗的dna序列，其中该dna序列编码本文所述的抗grem1抗体。在一个实施方案中，抗grem1拮抗剂是包含编码本文所述抗grem1抗体的dna序列的aav。在一个实施方案中，抗grem1拮抗剂是用于基因治疗的aav，其中aav包含编码本文所述的抗grem1抗体的dna序列。

　　编码抗grem1抗体的多核苷酸可以是rna序列。该rna序列可以在任何合适的载体中被施用给有需要的受试者。rna序列可以是信使rna(mrna)序列。该mrna序列可以以稳定的形式被施用给有需要的受试者。例如，mrna序列可以在脂质纳米颗粒(lnp)组合物中被提供。lnp组合物可以包含任何合适的能够封装该mrna序列的lnp，以增加所述mrna序列的稳定性。因此，在一个实施方案中，抗grem1拮抗剂是编码本文所述的抗grem1抗体的稳定的mrna序列。在一个实施方案中，抗grem1拮抗剂是用于基因治疗的稳定的mrna序列，其中该mrna序列编码本文所述的抗grem1抗体。在一个实施方案中，抗grem1拮抗剂是lnp组合物，其包含编码本文所述的抗grem1抗体的mrna。在一个实施方案中，抗grem1拮抗剂是用于基因治疗的lnp组合物，其中lnp组合物包含编码本文所述的抗grem1抗体的mrna。

　　术语“可操作地连接”是指一种并列(juxtaposition)，其中所描述的组件处于允许它们以其预期方式起作用的关系中。与编码序列“可操作地连接”的控制序列以这样的方式连接，使得编码序列的表达