【近红外小动物活体成像】小动物脑功能磁共振成像研究进展

　　原标题：【近红外小动物活体成像】小动物脑功能磁共振成像研究进展

　　摘要]

　　本文主要介绍血氧水平依赖的小动物脑功能磁共振成像的研究条件、 范围和研究方法，并简述小动物在发展非血氧水平依赖功能磁共振技术中所起 的作用。尽管小动物脑磁共振成像研究受到麻醉等条件的限制，这项研究已经 在神经科学及神经药理学范围作出了诸多贡献，并受到越来越多的重视。

　　[关键词]

　　动物；磁共振成像，功能性；脑

　　血氧水平依赖的功能磁共振成像(blood oxygen level dependent functional magnetic resonance imaging, BOLD-fMRI)是一种无创性的探索脑神经活动机制 的方法，在人体已经进行了大量研究，包括对认知 活动、静息状态、视觉、运动、神经精神疾病等方 面的脑fMRI研究已经取得一系列的发现和成果，动 物fMRI研究则可以实现由于伦理因素在人体不能进 行的基础研究，探索生理、病理状况下内在的脑功 能机制。BOLD信号的神经基础就是在1990年最早 由Ogawa等[1] 利用超高场磁共振(7.0 T和8.4 T)对大鼠 脑进行研究时发现的。啮齿动物最常用于小动物功 能磁共振成像研究。小动物fMRI可以适用于不宜在 人脑进行的研究，开拓了神经科学的新领域，使我 们能更好地理解脑功能活动的生理和分子机制。

　　1　小动物fMRI的研究条件

　　几乎绝大多数的实验动物是在麻醉条件下进行 的，常用的麻醉剂有α-氯醛糖、异氟烷和乌拉坦 等。研究发现实施全麻会对神经活动和BOLD fMRI信号强度产生影响[2] ：麻醉剂抑制脑的激活、代谢 及血流动力；尤其是脑区间的功能连接性与麻醉深 度有关，当麻醉深度较大时，两侧躯体感觉脑区间 的静息fMRI功能连接性消失[3] 。α-氯醛糖、乌拉 坦等麻醉剂具有一定的毒性，不能用于纵向研究； 近来的研究发现应用美托咪定，实现了镇静状态 的fMRI研究，以便模拟近似清醒状态[4,5] 。美托咪 定是β2肾上腺素能受体激动剂，具有镇定、去焦 虑和一些止痛、肌松方面的药理作用，它的作用 安全，可以适用于纵向研究。少数fMRI研究将大 鼠、兔等动物经过适应性训练，在清醒的状态下 进行成像检查[6] 。清醒状态动物的fMRI避免了麻醉 对脑血流、脑代谢、神经血管反应的影响和混淆 因素，可以进行脑皮层高级认知活动的研究，但 是面对的困难是要克服动物的头部运动干扰及缓 解动物在扫描环境中的紧张，为此，一种专用的 大鼠固定装置被设计制造出来。清醒状态的动物 在fMRI实验过程也需要注射适量的地西泮等镇定 剂来消除动物的紧张反应。

　　进行小动物的fMRI研究需要超高场磁共振设 备，因为小动物的脑体积小，需要小孔径的高场磁 体和相应的配套小线圈，以便得到良好的、敏感的 信号和信噪比。BOLD信号不仅依赖于氧合血红蛋 白，还受到血氧、血流速度、血容量等因素的影 响；动物fMRI检查过程还需要对体温、呼吸、血氧 饱和度、二氧化碳分压等进行监测，以控制这些因 素对血流动力学变化和血氧代谢的影响。

　　2　小动物fMRI脑激活的研究

　　由于动物难以配合进行认知方面的脑功能成 像，目前的动物fMRI研究多集中在BOLD机制、感 觉运动系统、神经疾病模型及药物等方面的研究。

　　大鼠的脑功能刺激实验多采用组块设计。 BOLD信号是与脑皮层活动相关的，电极刺激大鼠 前后爪的方法已经广泛用来研究BOLD信号在躯体 感觉通路，特别是感觉皮层的激活模式，这些研究 结果一致地显示了刺激单侧前爪引起对侧第一躯体 感觉皮层(SⅠ)的激活，激活区BOLD信号增高2.1% 左右[5] ；研究也发现前爪的感觉代表区位置位于后 爪的代表区前方和外侧方[7] ；但是对感觉传导通路 的激活效果研究结果不一致，Keilholz等[8] 利用电刺 激大鼠前爪显示了小脑皮层、丘脑、SⅠ及SⅡ(第 二躯体感觉皮层)的激活，而其他一些类似研究未 能发现感觉传导路径的激活[5,7] ，可能与实验设计有 关。BOLD信号与电刺激强度之间的关系也有不同 的研究结果，多数的研究认为电流1～2 mA、3～8 Hz低频率的电刺激强度引起感觉皮层的最大激活， 但是Goloshevsky等[9] 的研究发现BOLD信号随着电 刺激频率的增加(至180 Hz)而增加。研究也证明刺 激前爪诱发的感觉皮层的BOLD信号和体感诱发电 位(SEP)的变化呈相关性。

　　对大鼠的痛觉的皮层及传导通路的研究则发现 两侧感觉运动皮层、扣带回、丘脑后外侧核、岛叶 及海马等脑区接受刺激时呈固定激活[10] 。

　　以小动物fMRI为工具可以用来研究大鼠脑梗死 后脑功能的重塑变化，例如Dijkhuizen等[11] 刺激偏瘫 肢体发现，卒中后早期病灶对侧大脑半球广泛的激 活增强为主，而两周后(中期)表现为病灶周围激活 增强，这种梗死后双期的脑功能变化机制为卒中的 治疗和康复提供了理论。

　　3　脑激活的生理和药理研究

　　在脑激活的过程中血流动力学反应与脑激活关 系之间存在复杂的分子机制，通过阻断某些分子通 道，观察对BOLD信号的影响，能研究分子通道作 用和血流动力学间的关系，啮齿动物和高场磁共振 成为研究BOLD机制的重要手段。目前主流观点认 为胶质细胞是神经元兴奋和血流BOLD信号间的中 介，通过谷氨酸盐、Ca 2+ 、NO等信号途径调节脑组 织微血管舒缩及血氧水平[12-14] 。

　　fMRI可以评估药物作用引起的脑活动变化， 已经成为一种药理学研究的工具，被称为药理学 fMRI (pharmacologic fMRI，phfMRI)。尽管神经药 物可能引起心血管、呼吸作用进而影响fMRI，小动 物phfMRI正越来越多地被用于揭示药物在神经系统 的药理作用，例如观察戊四唑引起的鼠脑癫痫放电 脑区的活动[15] ；Shah等[16] 利用phfMRI成像探索大鼠 脑神经递质分布图，注射吗啡后使阿片受体密集的 脑区激活及然后注射其拮抗剂纳洛酮，发现吗啡引 起扣带回、丘脑、下丘脑、杏仁核、导水管周围灰 质正性激活，并且可以被纳洛酮阻断，激活减退。 phfMRI的设计一般不用传统的组块式设计，而是用 两阶段式的基线/药物注射比较。

　　4　静息脑功能的研究

　　静息fMRI指的是受试者放松、静止不动，并 避免任何有意思维活动的状态下进行功能磁共振 成像。静息态fMRI数据中包含的低频BOLD信号波 动(low frequency fluctuation，LFF)，反应了中枢神 经静息情况下自发的神经活动(频率范围0.01～0.1 Hz)，人类的静息fMRI研究发现静息状态存在默认 网络，呈现较强的兴奋活动。目前认为静息功能网 络可能是神经认知网络活动的重要基础和来源，对 于静息状态大脑活动的研究有利于全面认识大脑的 内在活动机制。动物的静息fMRI不能模拟人的静息 状态，只有在麻醉下进行，多数麻醉方法对BOLD 信号产生不利影响，近年来少数研究开始用美托咪 定为镇定剂进行浅麻醉，以便获得强的BOLD信号 和功能连接性。小动物的fMRI为揭示LFF信号的本 质提供了平台。Pelled等[17] 对活体鼠脑和死亡后的 鼠脑进行的LFF信号比较研究表明，LFF是一种生 理性的信号。研究已经发现大鼠两侧大脑对称的功 能脑区如感觉运动皮层、基底节等存在一致的LFF 信号网络[4,18] ，研究认为小型哺乳动物BOLD信号中 的LFF也适用于探索动物脑功能图。Pawela等[18] 研 究以大鼠丘脑后区为种子区利用时程相关方法检测 到由两侧第一、第二运动区、扣带回及同侧第二感 觉皮层区构成的感觉运动功能网络，而且还发现了 由视皮层V1区、背外侧膝状体核、上丘构成的视觉 信号网络。尚未见到小动物的脑内默认网络报道

　　5　非BOLD功能磁共振成像技术的研究

　　BOLD信号所反应的是神经活动相伴随的血 流动力学变化，并不能直接探测神经元的激活过 2010-05.indd 390 2010-9-24 9:21:22 http://www.cjmri.cn ·391· 磁共振成像 2010年第1卷第5期 Chin J Magn Reson Imaging, 2010, Vol 1, No 5 综　述 | Review 程。由于血管系统的变化，以及神经活动与血液 动力学之间耦合的复杂性，BOLD功能磁共振技 术无法对神经元活动进行精确的空间和时间定 位。为了克服这些问题，研究者们一直在努力发 展直接探测神经元活动的非BOLD功能磁共振技 术。这些技术包括神经电流磁共振成像(neuronal current MRI，ncMRI)，扩散加权功能磁共振成像 (diffusion-weighted fMRI)，以及分子功能磁共振成 像(molecular fMRI) [19] 。

　　小动物被广泛应用于非BOLD功能磁共振成像 技术的发展与可行性研究之中。最近，Luo等[20] 利 用离体但完整的乌龟脑系统(包含眼睛)进行ncMRI 技术的可行性研究。当把带着眼睛的龟脑从颅骨中 取出并放置于人工脑脊液中时，龟脑仍然能够产生 正常的视觉诱发神经活动。因此，该龟脑系统提供 了一个完全没有血液但却能够响应自然生理刺激(视 觉)的动物模型。利用这个模型，可以在没有任何 BOLD效应干扰的情况下探测ncMRI信号。除了神 经电流成像实验，在扩散加权和分子功能磁共振技 术研究中也使用了小动物模型。例如Jin等[21] 在猫的 大脑中探测视觉刺激引起的扩散加权磁共振信号变 化，Lin等[22] 利用大鼠进行以锰离子作为对比剂的分 子功能磁共振成像实验。这些基于小动物的实验为 非BOLD技术的发展作出了巨大的贡献。

　　总之，小动物的脑功能成像研究已成为影像医 学与生理、药理、精神神经等基础学科的交汇点， 在基础医学的研究中得到越来越多的应用，将来会 有更多的研究成果。

　　致谢：本文撰写得到了美国芝加哥大学Jiahong Gao博士的指导。

　　参考文献

　　[1] Ogawa S, Lee TM, Kay AR, et al. Brain magnetic resonance imaging with contrast dependent on blood oxygenation. Proc Natl Acad Sci U S A, 1990,87(24):9868- 9872.

　　[2] Hudetz AG, Wood JD, Kampine JP. Cholinergic reversal of isoflurane anesthesia in rats as measured by crossapproximate entropy of the electroencephalogram. Anesthesiology, 2003,99(5):1125-1131.

　　[3] Lu H, Zuo Y, Gu H, et al. Synchronized delta oscillations correlate with the resting-state functional MRI signal. Proc Natl Acad Sci U S A, 2007,104(46):18265-18269.

　　[4] Zhao F, Zhao T, Zhou L, et al. BOLD study of stimulationinduced neural activity and resting-state connectivity in medetomidine-sedated rat. Neuroimage, 2008,39(1):248- 260.

　　目前常见的分子影像技术如X-射线成像、断层扫描成像（CT）、磁共振成像（MRI）和超声成像（US）被用于对疾病等的医疗诊断，但这些方法具有较差的空间分辨率及其无法实现动态实时监测等缺点。

　　传统荧光成像技术存在一个显著的缺点是探测深度相对较低，光子穿透能力受光子在生物组织的吸收以及散射影响，荧光成像的噪音与背景一般来源于生物组织的自体荧光以及光子散射。由于光折射率在微观尺度上存在的不均一性，生物组织体对光具有强散射性，然而这些散射一般随着光的波长增长呈指数性衰减。

　　近红外二区成像（1000-1700nm）与可见光成像（400-780nm）和近红外一区（780?1000nm）相比，因其在样品中的散射与吸收系数更小，因此具有更高的成像分辨率与穿透深度。近红外二区成像系统针对小动物成像分辨率一般可达30um，能对细小的血管直接成像；穿透深度大致为3cm，即便是小鼠最深的脏器发出的信号也能被检测到。

　　近红外二区光学成像技术以其高灵敏度、高时空分辨率、信噪比高、成像深度大、自发荧光低、生物损伤小等优点，为微小肿瘤/转移瘤及肿瘤相关血管的检测和研究提供了一种新的无创检测成像手段，在活体成像、疾病诊断、无创治疗、手术导航等领域应用前景广泛。

　　相机部分：

　　1、成像模块采用TEC电制冷方式，工作温度达到-100℃；

　　2、对于微弱信号可实现不短于99秒的连续曝光；

　　3、近红区与可见光区实时同步成像，图像同步精确融合；

　　4、近红区与可见光区实时同步录像，视频同步精确融合；

　　激光部分：

　　1、激发光源采用两种波长（808nm, 980 nm），功率可调；

　　2、两根液芯匀光光纤分布两侧无死角照射；

　　3、光纤末端配备准直器，可调激发光的均匀照射；

　　暗室及控制系统：

　　1、去除背景，实现成像的平场校正功能；

　　2、调节红外成像窗宽、窗位功能；

　　3、荧光寿命成像专用软件模块‘；

　　4、实现材料长时间的荧光寿命成像；

　　5、寿命图像与材料单光子寿命分析结果误差极小；

　　6、多通道气体麻醉，大视野满足多个小动物同时成像；

　　应用：

　　适合从事生物学、医学、材料等科研工作者，例如生物医学荧光成像、材料学荧光成像、荧光偏振成像、荧光寿命成像、激光光斑分析等领域。

　　【案例1】NIR-I区与NIR-II区，成像范围、深度、清晰度对比：

　　【案例2】近红外二区成像在不通波长下成像比较

　　通过尾静脉注射PBS溶液中的NM-NPs雌性BALB/c小鼠。用1000LP、1250LP、1400LP滤光片进行160mW cm?2808 nm激光激发，当波长在1000~1400 nm之间变化时，血管的清晰度明显提高，1400LP滤光片NIR-II荧光成像的空间分辨率明显提高，清晰度显著提高。

　　【案例3】近红外二区成像用于药代释放测试

　　特定器官和组织中的药物浓度通常用破坏性方法测量，费时费力。针对小剂量毒性药物，可使用功能化的红外探针，与药物接触时发光峰会发生削弱与红移，以实现对药物的检测。将纳米探针放入可长时间存留于生物体内的条形生物膜中，并植入皮下、腹腔内等不同腔室，药物在腹膜内释放后，可检测到内侧纳米探针发光强度减弱与红移。

　　【案例4】近红外二区成像用于药代动力学监测

　　临床前药代动力学(PKs)的常用方法为在不同的时间点抽取血液，并通过不同的分析方法对血液水平进行定量。NIR-II可以通过测量麻醉小鼠眼睛和其他身体区域中标记化合物的荧光强度，无创地连续监测血液水平。通过非侵入性眼睛成像测量的血液水平与通过经典方法产生的结果之间有极好的相关性。全身成像显示预期区域(如肝脏、骨骼)有化合物积聚。所以眼睛和全身荧光成像的结合能够同时测量血液PKs和荧光标记化合物的生物分布。

　　【案例5】近红外二区成像在缺血性脑卒中应用

　　稀土纳米颗粒（RENPs）是一类稀土离子掺杂的荧光纳米材料，能够在近红外光激发下发射出位于第二近红外区的荧光。且其具有长荧光寿命、窄发射谱带、高光/化学稳定性、低毒性和可调谐荧光发射波长等优势，有望在生物分析和疾病诊断等领域发挥重要作用。利用染料敏化RENPs的复合材料，成功实现了非侵入性、高分辨率脑血管成像，清晰观察到脑血管网络结构及细小的毛细血管结构，并可实时监测生理过程中血液动力学及血管结构的变化。

　　缺血性脑卒中（Ischemic Stroke, IS）是导致长期残疾以及死亡的主要原因之一，该疾病的严重程度具有时间依赖性，及时评估IS对于该疾病的治疗以及预后起着至关重要的作用。利用比率型近红外二区纳米探针可有效富集在脑缺血病灶位点，可视化氧化应激水平用于及时评估IS。利用近红外二区成像的优势，该探针具有深层的脑组织穿透深度；基于目标物调控染料敏化RENPs发光的原理，该探针对高活性氧物种呈现优异的响应性能。综合以上功能，该探针通过可视化探针在病灶位点的富集程度以及氧化应激水平，在IS发生30min时即可对其进行监测，并评估其严重程度（传统磁共振成像则在IS发生24h才可观察到显著的信号变化）。

　　【案例6】近红外二区成像用于心肌梗死监测

　　利用近红外荧光成像的优越采集速度和近红外发射纳米粒子的有效选择性靶向，在急性梗塞事件后仅几分钟就获得了梗塞心脏的体内图像。

　　【案例7】近红外二区成像用于慢性肝脏疾病无创监测

　　准非酒精性脂肪性肝病（NAFLD），由于缺乏用于监测炎症和肝纤维化进程的无创方法，肝活检仍是临床诊断NAFLD的金标。非酒精性脂肪性肝病的病理发展中氧化应激是关键驱动力之一，肝损伤和坏死性炎症由驱动纤维化的活性氧簇（ROS, Reactive oxidative species）介导，内源性脂褐素（lipofusion）是ROS的副产物，在808nm激光激发下，能够在近红外范围内被检测到，因此脂褐素的红外成像用于无创评估坏死性炎症活动和纤维化阶段，实现慢性肝病的无创监测。

　　【案例8】近红外二区成像用于阿尔兹海默症监测

　　近红外荧光(NIRF)成像已广泛用于临床前研究；然而，它的低组织穿透性对于神经退行性疾病的转化临床成像来说是一个令人生畏的问题。众所周知，视网膜是中枢神经系统(CNS)的延伸，被广泛认为是大脑的窗口。因此，视网膜可以被认为是研究神经退行性疾病的替代器官，并且眼睛由于其高透明性而代表理想的NIRF成像器官。利用CRANAD-X荧光探针标记淀粉样蛋白β(aβ)，并利用成像系统对眼部进行观察可以明显观察到患病前后及治疗前后眼部的荧光强度的差异，进而在未来的人类研究中具有显著的转化潜力，并可能成为未来快速、廉价、可获得和可靠筛查AD的潜在成像技术。

　　【案例9】近红外二区成像用于体内脂质积累情况监测

　　细胞中脂质异常积累，通常预示着动脉硬化、脂肪肝等疾病。采用单壁碳纳米管荧光探针，通过近红外发射无创测量细胞中的脂质积累。在注射24 h后，探针富集在肝脏部位，与脂质结合后会使发光峰蓝移，积累越多则蓝移现象越明显，由此实现对脂质的定量检测。该方法可广泛应用于简化药物开发过程，并推动脂质相关疾病的研究。

　　【案例10】近红外二区成像联合酶激活的纳米探针用于术中进行快速组织病理学分析

　　准确的分析病理组织是肿瘤手术成功的关键之一，一种可被基质金属蛋白酶(MMP)14激活的NIR-II纳米探针A&MMP@Ag2S-AF7P，可用于体内外神经母细胞瘤诊断和非破坏性的组织病理学分析。

　　（1）A&MMP@Ag2S-AF7P在正常组织中的荧光可以忽略不计；但是在神经母细胞瘤组织中，其荧光信号会由于过表达的MMP14抑制了Ag2S量子点和A1094之间的荧光共振能量转移(FRET)过程而被快速激活。

　　（2）与此同时,暴露的膜渗透多肽R9 (TAT-peptide)可以使得该纳米探针被癌细胞有效地内化，进而产生优越的T/N组织信号比值。该探针可以对病灶进行富集定位通过红外二区实时成像描绘出明确的肿瘤边缘，用于癌症手术或组织活检。

　　【案例11】近红外二区成像指导肿瘤摘除手术

　　NIR-II成像的高灵敏度可对肿瘤组织进行精准定位。利用靶向NIR-II荧光探针成像并引导进行小鼠头部肿瘤切除手术。实验分两组进行，在完全切除手术后(左二)，选区线扫结果显示病灶部位近红外信号明显减弱，与健康组织相似，在对比实验(右二，人为留下少部分肿瘤组织)中则观察到部分区域仍存在高强度信号，肿瘤组织的切除并不完全，表明NIR-II在肿瘤摘除手术中具有潜在的指导作用。

　　【案例12】近红外二区NIR-II协同肿瘤光热治疗

　　纳米粒子(NPs)辅助光热疗法(PTT)是一种有前途的癌症治疗方式，并且已经吸引了科学主流的注意。利用聚集诱导发射(AIE)纳米颗粒和肿瘤细胞来源的“外泌体帽”(TT3-oCB NP@EXOs)制备具有增强的第二近红外(NIR-II，900–1700nm)荧光特性和PTT功能。由于它们在808 nm照射下具有高且稳定的光热转换能力，因此TT3-oCB NP@EXOs可以用作仿生的NPs用于NIR-II荧光成像引导的肿瘤PTT，因此，随着其他靶向性差的AIE纳米粒子的验证，肿瘤细胞衍生的EXO/AIE纳米粒子杂化纳米囊泡可能为改善肿瘤诊断和PTT提供一种替代的人工靶向策略。

　　【案例13】近红外二区成像测试荧光寿命

　　沈阳莫德医药自主研发近红外二区小动物活体荧光成像系统， 性能优异深受用户好评，欢迎您的咨询！

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