【个案报道】造血干细胞移植术后的重度β地中海贫血患者自体移植冻融卵巢组织诱导青春

　　

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　　作者：

　　李晶洁1 方丛1 李满超1 孙鹏1 王德娟2 廖建云3 曾海涛1 陈攀宇1 胡芸1 郭映纯1 李永芳1 梁晓燕1

　　作者单位：

　　1 中山大学附属第六医院生殖医学中心，广州 510000；2 中山大学附属第六医院小儿外科，广州 510000；3 东莞台心医院血液科，东莞 523125

　　通信作者：

　　梁晓燕，Email：liangxy2@mail.sysu.edu.cn，电话：+86-20-38048010

　　第一作者

　　李晶洁

　　医学博士，硕士生导师，中山大学附属第六医院生殖中心副主任医师。以第一/通信作者发表高水平SCI文章30余篇。主持与参与科技部国家重点研发计划，国家自然科学基金，广东省自然科学基金、广东省科技计划、中山大学青年教师培训计划等多项科研基金。是《中国女性生育力保存专家共识》及《中国女性肿瘤患者生育力保护及保存专家共识》执笔人，参与《Expert consensus on diagnosis, treatment and fertility management of young breast cancer patients》，《年轻乳腺癌诊疗与生育管理专家共识》的制定。

　　通信作者

　　梁晓燕

　　中山大学医学博士、二级教授、博士生导师、主任医师，中山大学附属第六医院生殖中心创始人，中山大学医学院妇产科学系教研室主任，中山大学附属第六医院妇产科儿科首席科学家，科技部国家重点研发计划首席科学家，中华医学会妇产科分会内分泌学组副组长，中国医师协会生殖医学专委会常委，中国妇幼保健协会生育保健专委会常委，中华医学会生殖医学分会临床学组委员，广东省医学领军人才。在Nature Communications等知名杂志发表论文150余篇，主编人民卫生出版社《辅助生殖临床技术-实践与提高》，参与《中华妇产科学》第一、二版的编写。负责国家、省自然科学基金及卫生厅基金共30余项，作为首席科学家获得国家科技部重点研发计划“建立有效的人卵母细胞体外成熟优化体系及其临床应用的安全性研究”。参与国家PCOS、高泌乳素血症及闭经的诊疗共识的制定。

　　本文刊登于《中华生殖与避孕杂志》

　　2022, 42(11): 1187-1191.

　　摘要

　　目的  探索自体移植冻融卵巢组织诱导青少年女性青春期发育的可行性。

　　方法  重度β地中海贫血患儿造血干细胞移植术前于2019年在中山大学附属第六医院生殖医学中心冷冻卵巢组织11片。患儿造血干细胞移植术后复诊出现卵巢早衰，无青春期发育征象，仍无月经初潮。2022年1月20日通过腹腔镜为患者行原位卵巢组织移植术，共移植卵巢组织5片。术后随访患者性激素水平、生长发育情况及月经是否来潮。

　　结果  患者卵巢移植术后5个月现月经初潮。性激素水平表现为卵泡刺激素与黄体生成素明显下降，雌二醇水平明显升高，提示卵巢组织移植成功，卵泡已开始募集及发育。患者彩色超声提示子宫明显增大，子宫内膜增厚，盆腔左侧移植部位探及窦卵泡声像。

　　结论  青春期前儿童通过卵巢组织冷冻保存生育力的临床价值。对已经出现卵巢功能衰竭、青春期发育延迟甚至停滞的患儿通过自体冻融卵巢组织移植可诱导自然的青春期发育，恢复患者的生殖内分泌功能。

　　【关键词】造血干细胞移植；生育力保存；卵巢组织移植；重度地中海贫血

　　基金项目：国家重点研发计划（2021YFC2700400）

　　DOI：10.3760/cma.j.cn101441-20220730-00318  

　　地中海贫血是一种由调控珠蛋白合成的基因缺失或突变导致珠蛋白肽链生成障碍而引发的溶血性贫血，是一种常染色体隐性单基因遗传疾病。全球5%的人口中有珠蛋白变异，新生儿中的地中海贫血的发病率约为4.4/10 000，我国以广东省、广西壮族自治区与海南省最为严重［1-2］。儿童重型地中海贫血往往需要长期输血维持血红蛋白浓度。这使得铁质大量聚集、出现铁过载，最终导致患儿多脏器功能受损。另外，患儿可能出现生殖内分泌异常例如发育落后、性发育迟缓［3］。据报道重度地中海贫血患儿早发性卵巢功能不全的发生概率增加，因此重度地中海贫血在2015年国际生育力保存学会-欧洲生殖医学会-美国生殖医学会生育力保存指南中因其早发性卵巢功能不全倾向性推荐作为生育力保存指征之一［4］。造血干细胞移植是重度地中海贫血治疗的主要方式，儿童期行造血干细胞移植的成功率高于成人，因此接受造血干细胞移植的患者以儿童或青少年为主。造血干细胞移植前大剂量的放疗或化疗生殖毒性强，对生育力的影响是毁灭性的。据报道，造血干细胞移植前的放化疗导致卵巢衰竭的比率高达70%~100%［5］。因此，重度地中海贫血的患者尤其是拟接受造血干细胞移植前的患者推荐进行生育力保存［4， 6-7］。然而对于非肿瘤患者的生育力保存，尤其是儿童或青少年的非肿瘤疾病的生育力保存国内外的研究及报道较少，仍缺乏足够的数据和经验。本文通过对1例因造血干细胞移植导致卵巢早衰的重度β地中海贫血患者自体移植冻融卵巢组织诱导的青春期发育的病历资料进行回顾性分析并文献复习，旨在探讨青春期前的患者生育力保存的方法。

　　病例资料

　　1.基本情况：患者为女性，出生于2005年9月11日。因“出生至今无月经来潮”就诊咨询。2006年诊断为重度β地中海贫血，基因型为CD17位点突变基因纯合子。2019年患者因“拟行造血干细胞移植”首诊于中山大学附属第六医院生殖医学中心行生育力保存。患者经腹腔镜下左侧卵巢切除术，共冷冻11片卵巢皮质片（皮片体积为10 mm×10 mm×1~2 mm）［8］。腹腔镜术前查性激素（2019年11月27日）：抗苗勒管激素（anti-Müllerian hormone，AMH）水平为5.43 μg/L， 卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，FSH） 水平为6.72 U/L，黄体生成素（luteinizing hormone，LH）水平为6.57 U/L，雌二醇水平为36.4 ng/L。腹腔镜术后查性激素（2019年12月12日）查AMH水平为3.11 μg/L，FSH水平为5.06 U/L，LH水平为2.42 U/L，雌二醇水平为21.6 ng/L。

　　患者于2020年3月至2020年5月期间于东莞市台心医院血液科行造血干细胞移植。2021年1月20日东莞市台心医院查性激素：FSH水平为69.23 U/L， LH水平为45.52 U/L，雌二醇水平为<5 ng/L，孕酮<0.05 μg/L。盆腔彩色超声示：幼稚子宫21 mm×15 mm×18 mm，双侧卵巢显示不清。2022年1月患者于中山大学附属第六医院生殖医学中心复诊查性激素AMH水平为0.01 μg/L，FSH水平为63.98 U/L，LH水平为26.56 U/L，雌二醇水平为5 ng/L，孕酮水平为0.05 μg/L。盆腔彩色超声：子宫前位，大小约21 mm×18 mm×15 mm，子宫内膜厚1 mm，宫体与宫颈比为1∶1，右侧卵巢大小15 mm×15 mm×17 mm。患者身高为1.52 m，体质量41 kg，尚无第二性征发育证据及月经初潮。诊断为“原发性闭经，卵巢早衰，性发育停滞”。遂拟行卵巢组织移植以诱导青春期发育。

　　2.卵巢组织解冻：将45 mL 1 mol/L的蔗糖溶液加到50 mL离心管，标记为平衡液体（equilibration solution，ES），放入37 ℃水浴锅内预热1 h。将45 mL 0.5 mol/L蔗糖溶液加入100 mm培养皿室温复温1 h，标记稀释溶液（diluent solution，DS）。将45 mL含20% SPS的Hepes缓冲液加入100 mm大培养皿内，室温放置1 h，标记为洗涤溶液（washing solution，WS）。另取45 mL 20%的Hepes缓冲液加入100 mm培养皿内，标记为WS2，放在冰上，提前1 h预冷。将带卵巢组织的载体放入含45 mL解冻液（thawing solution，TS）液的大离心管中（37 ℃），待组织片从载体上脱离后，将其倒入100 mm培养皿中，3 min。然后用镊子将组织片转移到DS液的培养皿内，计时5 min，并晃动几次，加速冷冻液的洗脱。接着将组织片转入室温WS1培养皿内，在培养皿内用镊子翻面多清洗几次，将组织片表面的冷冻液彻底清洗干净。最后，将组织片转移至预冷的WS2液内，待移。

　　3.腹腔镜下卵巢组织移植：2022年1月20日患者于中山大学附属第六医院生殖医学中心行腹腔镜检查+卵巢组织移植术。腹腔镜下见胃肠、肝脏无损伤，子宫稍小，表面光滑，双侧输卵管外观未见异常，右侧卵巢外观未见异常，左侧卵巢缺如；在左侧输卵管下方及输尿管上方和髂外血管围成的近似三角形区域中心，用超声刀切开1 cm，用剪刀钝性分离腹膜与脂肪间隙，用剪刀剪开腹膜约5 cm，用分离钳钝性分离脂肪形成“窝状”凹陷，右侧同法处理；在左侧脂肪凹陷窝内放置两片卵巢皮质、右侧脂肪凹陷窝内放置3片卵巢皮质。

　　4.随访：卵巢移植术后定期随访患者性激素及盆腔超声改变，患者卵巢组织移植前性激素提示卵巢衰竭。2022年6月26日（移植后第5个月）患者性激素：AMH水平为0.02 μg/L，FSH水平为14.42 U/L， LH水平为6.79 U/L，雌二醇水平为134.2 ng/L，孕酮水平为1.31 μg/L。患者于2022年6月27日出现阴道出血。2022年7月7日患者性激素：AMH水平为0.02 μg/L，FSH水平为9.71 U/L，LH水平为2.47 U/L，雌二醇水平51.1 ng/L，孕酮水平为0.05 μg/L。提示卵巢组织移植成活，生殖内分泌功能开始恢复（激素变化如图1）。2021年7月16日患者卵巢移植术后盆腔彩色超声显示：卵巢移植后患者子宫增大，宫体大小约41 mm×25 mm×23 mm，子宫内膜厚度6.3 mm，盆腔双侧移植部位探及卵巢组织样回声，左侧卵巢组织移植部位探及2~3个直径2~3 mm窦卵泡声像（详见图2A~2F）。

　　讨论

　　目前卵巢组织冷冻与胚胎冷冻及卵母细胞冷冻同样作为确切并推荐的生育力保存方式［9］。尤其是青春期前的儿童群体，卵巢组织冷冻是唯一推荐有效的生育力保存方法［10］。世界首例自体冻融卵巢组织移植活产病例开展于2004年，由比利时的Donnez等［11］对1例霍奇金淋巴瘤Ⅳ期的患者进行自体冻融卵巢组织移植获得活产。据文献报道，世界范围内卵巢组织移植活产超过140例［12］。

　　卵巢移植的成功率与移植手术技术、患者条件等因素有关，不同的文献报道具有差异。一项根据欧洲多中心共285例病例总结数据显示自体冻融卵巢组织移植后自然妊娠率为40%，接受体外受精（in vitro fertilization，IVF）的患者妊娠率为36%，总妊娠率是38%［13］。卵巢移植部位可在原位也可在异位移植。卵巢组织原位移植指盆腔内卵巢组织移植，可在卵巢原位（卵巢髓质表面），也可像本病例移植于腹膜袋（输卵管下方及输尿管上方和髂外血管围成的近似三角形区域）；异位移植即移植于非盆腔位置，通常可移植在前臂或腹壁。原位移植具体部位与移植成功率的关联目前存在争议，主要原因是混杂因素众多包括移植术者的技术、移植时间、移植皮片体积、患者卵巢皮片解冻后存活卵母细胞数量、移植部位血供、缺血再灌注损伤等原因都可能影响冻融卵巢组织移植效果［14］。而腹膜袋内移植创伤小、手术用时少、移植部位血运丰富，是近年来卵巢移植较多采用的移植方式。异位移植虽然可减少移植手术的创伤，但异位卵巢皮片存活后卵泡生长可能会使患者产生不适甚至疼痛感。异位移植的患者如有妊娠需求，只能依靠辅助生殖技术，而异位移植的周围组织环境可能影响卵泡质量［15］。基于以上原因，本例患者采用原位腹膜袋移植。

　　卵巢皮片的移植数量和患者本身的卵巢功能对卵巢移植的成功率也存在影响。Ernst等［16］报道对尤文肉瘤患儿自体原位移植冻融卵巢组织，卵巢皮片移植部位为残存卵巢表面，因残余卵巢面积小，仅移植4 mm×5 mm×1 mm大小的两片卵巢组织（仅使用了患儿20%的冻存卵巢组织），这也导致卵巢组织周围血运欠丰富，影响了卵巢组织存活时间。这项病例报道同样为诱导患儿青春期发育病例。患儿卵巢移植1年后才出现月经初潮，月经仅维持了6个月。据Schmidt等［17］既往病例资料移植6~10片卵巢组织卵巢功能可维持数年（6个月至54个月）。本病例中患者现16岁，移植卵巢皮片体积（皮片体积为10 mm×10 mm×1~2 mm）大于Ernst等［16］文献报道。为保证移植效果及后续有望满足患者进入生育期后的生育需求，移植5片卵巢组织。

　　患者2022年6月26日雌二醇水平明显高于2022年5月，这提示移植卵巢组织存活并开始分泌激素。而孕酮水平高于1 μg/L，这提示患者可能出现了一次排卵，处于黄体期。随后患者2022年6月27日出现阴道出血。2022年7月7日雌二醇和孕酮水平已为正常的卵泡早期的性激素水平。以上信息均提示患者移植卵巢皮片成功，恢复生殖内分泌功能，出现了排卵及月经。据既往文献报道，冻融卵巢组织移植后开始恢复生殖内分泌功能在3.5~6.5个月后［18］。而患者AMH水平未见明显上升，这与本中心既往卵巢组织移植病例及文献报道类似［19-21］。Hornsh?j等［21］报道绝经期的患者卵巢移植后只有不到一半的患者可检测到AMH值，其余患者AMH均在检测效能以下。可能的原因是卵巢组织移植后仅有少量卵泡恢复活力，虽然可以诱导患者月经来潮和生殖内分泌激素的恢复，但这并不意味着患者的卵巢功能也恢复如初。因此，AMH水平不能作为卵巢组织移植后卵巢功能恢复的指标。

　　重度β地中海贫血的青春期前患儿，可能因铁超载或造血干细胞移植导致卵巢功能衰竭从而影响患儿的青春期启动或发育，导致原发性闭经、性发育延迟或停滞。本病例中，患者出生后即需输血维持正常生活，15岁接受造血干细胞移植。患者月经从未来潮，无青春期发育的征象，符合原发性闭经、性发育停滞诊断。因此患者有青春期诱导的指征。青春期诱导的方式可通过传统的激素替代或者卵巢组织移植诱发自然的青春期发育。目前通过移植自体冻融卵巢组织诱导青春期发育的病例鲜少：2012年Poirot等［22］报道对于镰状细胞性贫血的患儿移植自体冻融卵巢组织诱导青春期发育；同年Ernst等［16］报道对尤文肉瘤患儿自体移植冻融卵巢组织诱导青春期发育。而我国尚无成功病例报道。通过自体移植冻融卵巢组织诱导患儿自然的青春期发育的优势在于卵巢组织移植即可诱导自发的青春期发育，也有可能在后续满足患者成人后生育的需求；因儿童服药依从性差，卵巢组织移植诱发的自然青春期发育对儿童患者而言更加方便，减少停药漏药导致的内分泌紊乱风险；因卵巢移植后为自然的青春期发育，对于患儿心理而言具有积极的意义。而其劣势在于卵巢组织移植后无法像药物激素替代一样可根据患儿的年龄和发育情况调整激素用量；卵巢移植也是一个有创的手术操作（当然如果只考虑用于青春期诱导，可考虑异位移植卵巢组织减少手术创伤）［23］。

　　目前冻融自体卵巢组织移植在全世界范围内活产超过140例［12］，其有效性及安全性已获得充分的论证。对于儿童和青春期前的青少年而言，卵巢组织冷冻及移植是目前其生育力保存的唯一选择。儿童及青少年卵巢组织冷冻及自体移植同样应严格遵循人类辅助生殖技术的伦理原则，充分考虑患者的获益，严格遵循知情同意原则的前提下开展，而对于其中“决定权与监护权”“冷冻组织及细胞的所有权（包括如患者不幸去世后）”等伦理问题仍需要进一步地关注和讨论。

　　本病例为我国首例成功完成的自体冻融卵巢组织移植诱导青春期发育成功的病例报道。患者在青春期前因重度β地中海贫血拟接受造血干细胞移植遂于本中心行卵巢组织冷冻。在患者造血干细胞移植后诊断卵巢早衰、青春期发育停滞、原发性闭经，具有明确的医学指征行卵巢组织移植诱导青春期发育。在世界范围内，本类病例鲜少。通过卵巢组织移植诱导青春期发育与药物激素替代诱导青春期发育对患儿后续的生长发育的影响是否有差别、青春期前移植卵巢组织是否有可能满足后续患者成人后生育需求目前仍缺乏足够的样本数据。但本病例的创新尝试，为生育力保存尤其是儿童生育力保存治疗提供了新的思路和数据支持。

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