基因编辑范文

　　基因编辑范文第1篇

　　在一项生命科学的前沿技术上，中国科学家成了“第一个吃螃蟹的人”，不过这项“创举”没能获得认可，反而迎来了国际生物学界的巨大争议。

　　5月18日，美国国家科学院和美国国家医学院（下称“两院”）宣布，将发起一项重要倡议，为编辑人类基因组的研究制定指导性规范。

　　“两院”提议在今年秋季召开一次国际峰会，同时建立一个工作组，来研究涉及生殖细胞编辑的伦理、法律、社会和科学议题。

　　就在这项倡议之前，4月底，美国国立卫生研究院主任弗朗西斯?柯林斯发表声明，表态研究院不会资助任何人类胚胎基因编辑的研究。

　　让几家美国国家研究机构大动干戈的缘由，来自4月18日中国中山大学副教授黄军就团队的一项最新研究进展。

　　当天，黄军就带领的研究小组在学术期刊《蛋白质和细胞》上，报道了研究小组使用基因编辑技术改造人类胚胎的最新研究进展。

　　这被不少生物学界人士认为是逾越了基因研究的伦理和安全红线，在一些人的眼中，甚至和当年的克隆人一样，将引发“蝴蝶效应”，“打开人类灭亡的潘多拉魔盒”。

　　中国科学家做的这项研究，真的有如此巨大的能量？

　　论文“导火索”

　　实际上，黄军就研究小组使用的基因编辑技术――CRISPR/Cas9，并非中国团队独创，它主要是通过对生物体基因组的改变，来读取和改变遗传物质和编码信息。通俗一点的描述，就是把一小段基因剪切或替换掉。

　　与仍存在争议的转基因技术相比，基因编辑不涉及外源性基因，只是对生物体内源性基因的调控，所以更容易被人们接受。比如，在一些农作物的基因修复上，可以利用基因编辑技术，把一些遗传疾病出现的基因突变恢复正常，让农作物回到健康生长状态。

　　CRISPR/Cas9技术已经属于基因编辑的第三代技术，最近两年，这项技术也已被全球生物科学界大量深入研究和优化。不过，在黄军就小组的研究之前，还没有人公开把这项技术真正应用在人体胚胎上。这也是争议点所在。

　　事实上，未公开的研究也并非没有。在黄军就小组的研究之前，《麻省理工科技评论》报道了另一个还未来得及发表的研究项目：哈佛大学著名遗传学家乔治?丘奇的实验室中，博士后中国留学生杨璐菡正在对人类尚未成熟的胚胎进行基因编辑。

　　杨璐菡的研究主要针对乳腺癌的突变基因，希望能通过这一研究降低下一代女性的患病风险。但报道发表后，外界的舆论压力让她不得不停止了研究，也变得遥遥无期。

　　相比之下，黄军就研究小组看起来就“幸运”得多，他们的研究并没有遇到社会舆论以及伦理禁忌的压力，文章顺利发表在《蛋白质和细胞》上。最开始黄军就想把在《自然》和《科学》杂志上，但先后被拒绝。

　　《蛋白质与细胞》是新创不久的学术期刊，并不如《自然》和《科学》等期刊一样为人所熟知，不过，黄军就小组的研究文章发表后，质疑和批评声还是如洪水般汹涌而来。

　　这其中不乏一些生物学界和基因编辑领域的大师级人物。比如基因编辑技术的先驱弗奥多?乌诺夫以及CRISPR/Cas9技术的发明者之一詹妮弗?杜德娜就明确表态，应该禁止该技术应用于人类生殖细胞基因的改造。

　　伦理与监管

　　一些学者还将矛头指向刊登论文的《蛋白质和细胞》杂志，指责杂志的编辑没有对论文的发表进行同行评审，激进一点的批评，则认为杂志编辑极端不负责，这是在支持修改人类胚胎基因。

　　《蛋白质和细胞》期刊执行编辑张晓雪对于这些批评予以澄清，她说：“编辑部作出刊登这项研究的决定，不应该被看作是对类似尝试的一种认可或者鼓励。”

　　黄军就随后也对他们的研究作出进一步的说明，他认为自己团队的研究并没有跨越伦理红线，研究所使用的胚胎都是无法发育的废弃胚胎，而且研究的目的，也是为了找出这项技术的问题所在。

　　按照黄军就小组论文的描述，团队使用了86个胚胎细胞，48小时之后，只有28个胚胎拼接成功，而且还有胚胎出现了“脱靶”突变（影响到正常基因）。

　　在研究小组看来，这一研究结果向学界揭示了技术的不成熟，因此他们停止了实验，除非成功率接近100%。

　　但一些研究人员仍然担心，这篇论文会是个开始，更多的人会在对基因编辑技术的后果不明确的前提下，就启动更进一步的研究和实验，进而演变到制造变种人类的地步。

　　这也是所有担心的症结所在，技术本身的成熟只是时间问题，但应用的方向出现偏差，整个人类种族的未来就有可能陷入危机。

　　这些担心不无道理，不过，就像核技术等备受争议的技术一样，任何科学技术都有两面性，是否会被应用于对人类有害的领域，这已经明显超出科学家所能掌控的范畴。

　　《自然》杂志在随后发表的一篇文章中写道，改造人类胚胎基因组是一个复杂的问题。论文发与不发，都改变不了实验已经完成的事实。而任何关于人类胚胎的人为操作，总是会引起激烈争论，但争论的最终目的，应该是制定出明确的规范标准，让科研真正朝着有利于人类福祉的方向发展。

　　基因编辑范文第2篇

　　关键词 基因编辑 锌指核酸酶 转录激活因子样效应物核酸酶 CRISPR/Cas9核酸酶

　　中图分类号 Q-49 文献标志码 E

　　基因编辑是指对基因组进行定点修饰的一项新技术。利用该技术，可以精确地定位到基因组的某一位点上，在这位点上剪断靶标DN段并插入新的基因片段。此过程既模拟了基因的自然突变，又修改并编辑了原有的基因组，真正达成了“编辑基因”。

　　1 研究背景

　　近年来，随着分子生物学的迅速发展，研究人员正通过定点突变的方法使目的基因完全失活来研究特定基因的功能，这是一种最直接有效的研究方法。随着高特异性及更具操作性的人工核酸酶的出现和技术体系的完善，基因编辑技术获得了飞速发展，并将靶向基因操作推向高潮，使得定点基因敲除、敲入变得更为简单且高效。与传统的以同源重组和胚胎干细胞（ES）技术为基础的基因打靶技术相比，基因编辑新技术保留了可定点修饰的特点，并应用到更多的物种上，效率更高，构建时间更短，成本更低。

　　现代基因编辑技术的基本原理是相同的，即借助特异性DNA双链断裂（DSB）激活细胞的天然修复机制，包括非同源末端连接（NHEJ）和同源重组修复（HDR）两条途径。

　　2.1 非同源末端连接

　　非同源末端连接是一种低保真度的修复过程，断裂的DNA修复重连的过程中会发生碱基随机地插入或丢失，造成移码突变，使基因失活，实现目的基因敲除。如果一个外源性供体基因序列存在，NHEJC制会将其连入双链断裂DSB位点，从而实现定点的基因敲入。

　　2.2 同源重组修复

　　同源重组修复是一种相对高保真度的修复过程，在一个带有同源臂的重组供体存在的情况下，供体中的外源目的基因会通过同源重组过程完整地整合到靶位点，不会出现随机的碱基插入或丢失。若在一个基因两侧同时存在DSB及同源供体的情况下，可以进行原基因的替换。

　　目前主要有3种基因编辑技术，分别为人工核酸酶介导的锌指核酸酶（ZFN）技术；转录激活因子样效应物核酸酶（TALEN）技术；RNA引导的CRISPR/Cas核酸酶技术（CRISPR/Cas RGNs）。

　　ZFN技术是第一代基因编辑技术，是基于锌指蛋白发展起来的。1986年，Diakun等首先在真核生物转录因子的DNA结合区域发现了Cys2/His2锌指模块。1996年，Kim等首次人工连接了锌指蛋白与核酸内切酶。2005年，Urnov等发现一对由4个锌指连接而成的ZFN，可识别24 bp的特异性序列，由此揭开了ZFN在基因编辑中的应用。

　　ZFN由锌指蛋白（ZFP）和FokⅠ核酸内切酶组成。其中，由ZFP构成的DNA识别域能识别DNA特异位点并与之结合，而由FokⅠ构成的切割域能执行剪切功能，两者结合可使靶位点的双链DNA断裂。于是，细胞可以通过同源重组修复机制和非同源末端连接修复机制来修复DNA。HDR修复有可能会对靶位点进行恢复修饰或者插入修饰，而NHEJ修复极易发生插入突变或缺失突变。两者都可造成移码突变，由此达到基因敲除的目的。

　　ZFN诱导的基因编辑技术可应用于很多物种及基因位点的编译，具有较好的发展潜力。但是目前有3个缺陷制约了该技术的推广：① 以现有的策略设计高亲和性的ZFN，需投入大量的工作和时间；② 在细胞中持续表达ZFN对细胞有毒性；③ 虽然三联体设计具有一定特异性，但仍存在不同程度的脱靶效应。

　　2009年，研究者在植物病原体黄单胞菌中发现一种转录激活子样因子效应物，是特异识别DNA序列的基础。TALEN识别模块一般由34个氨基酸组成，其中第12、13位氨基酸高度可变，被称为重复可变的双氨基酸残基（RVD）。RVD决定了对特异性核苷酸的识别，其与A、G、C、T有恒定的对应关系，如即NI识别A，NG识别T，HD识别C，NN识别G。随后，TALEN特异识别DNA序列的特性被用来取代ZFN技术中的锌指蛋白。它的可设计性更强，不受上下游序列的影响，具备比ZFN更广阔的应用潜力。

　　TALEN包含2个TALEN蛋白，每个TALEN都是由TALE array与FokⅠ融合而成。在进行基因编辑时，其中一个TALEN靶向正义链上的靶位点，另一个则靶向反义链上的靶位点。然后FokⅠ形成二聚体，在靶向序列中间的spacer处切割DNA，造成双链DNA断裂，随后细胞启动DNA损伤修复机制，FokⅠ针对不同的TALEN骨架，其最适宜的spacer长度不同，其长度范围一般为12～20 bp。实验结果表明，TALEN在靶向DNA时，第一个碱基为T时其结合效果更佳。

　　目前，TALEN已经成功应用于酵母、哺乳动物和植物的特异性位点来进行基因打靶，与锌指核酸酶系统相比有较大的应用优势，但仍然有些问题需要解决，例如脱靶效应、TALEN与基因组进行特异结合受邻近序列影响等。

　　基因编辑范文第3篇

　　继2015年4月，中山大学研究人员利用基因组编辑技术除去了人类胚胎中的一个突变基因后，5月，全球知名期刊《自然》（Nature）称，美国国家科学院（NAS）和国家医学院（NAM）宣布，将推出重大的举措为人类基因组编辑技术制定指导准则。

　　基因组编辑技术，是近年科学界的明星技术，它实现了在生物体基因组水平上进行精确地敲除、插入或置换，意味着人类可按意愿改写DNA，也因此引发巨大的伦理道德争议。

　　核心技术门槛的降低，往往意味着某个行业即将迎来爆发期，比如智能手机的风起云涌。

　　此前，由于技术壁垒与监管成本高昂，转基因育种几乎垄断在以孟山都公司为首的几个大公司手中；而基因组编辑技术应用于种子培育，不仅少了几分改写人类DNA的顾忌，而且这一新的育种技术降低了准入门槛，使一些小公司、校办企业也有了进入的机会。

　　不过，转基因作物始终面临着严厉监管，同样作为基因工程，基因组编辑育种技术的产物，是否也面临一样的命运？如果改变监管策略，又需要如何调整？ 是不是转基因育种？

　　上述一连串的发问，其实指向同一个问题，基因组编辑育种是否应被视作转基因育种？

　　被看好的基因组编辑技术，主要有核酸酶 （ZFNs）、TALE核酸酶（TALENs），以及CRISPR/Cas系统，原理都是在DNA靶位点产生双链断裂，之后进行末端连接或同源重组，以修复损伤的DNA。

　　其中，CRISPR/Cas系统是最新的技术，它不像另外两种技术那样靠蛋白来识别目标，而是靠核糖核酸（RNA）来识别，操作更简捷，应用范围更大。

　　美国一家小公司Calyxt有一个新突破，它利用TALEN技术使土豆耐冷藏，并可减少烹饪时产生的致癌物质。技术原理是，通过降低土豆中天门冬酰胺和单糖的含量，不让切开的土豆变黑和减少高温烹饪时产生的致癌物质丙烯酰胺。

　　TALEN技术由TALE蛋白DNA结合域和核酸酶两部分融合而成，这相当于一场观察员寻找定位、狙击手攻击的游戏，TALE蛋白DNA结合域负责靶序列的特异性识别，而核酸酶负责靶位点的切割。

　　麦当劳等快餐企业的薯条供应商辛普洛特的转基因土豆，也于2014年11月得到美国农业部批准，它同样可以减少土豆擦伤变黑，并在烹饪过程中降低丙烯酰胺的产生。

　　两种土豆的品质类似，但区别在于，辛普洛特土豆嵌入了野生土豆中的基因片段，并采用RNA干扰技术让负责编码特定酶的基因不再表达，Calyxt土豆则只是剔除了土豆本身的基因，没有插入任何外源基因。

　　检测无法发现Calyxt土豆与传统土豆的差别，因为，基因组编辑技术无需引入外源基因，直接可在作物自身基因组上进行操作，与自然突变或物理、化学诱变的机理一样，因此，分子检测无法区分基因组编辑获得的植物突变体与常规突变体。而转基因育种时外源基因的嵌入位置有随机性，需要大量的筛选来获取目标性状。

　　这就是基因组编辑育种不同于转基因育种的重要原因。

　　那么，前者可以替代转基因育种吗？

　　基因组编辑技术至少现在还不能完全替代传统转基因技术，比如，因为Bt基因来源自细菌，基因组编辑尚无法实现在作物自身基因组上产生Bt基因。

　　日本茨城大学农学院教授刀川（Masashi Tachikawa）介绍，一部分人认为基因组编辑育种应按非转基因植物对待，其比转基因更天然，环境风险较小；另一部分认为基因组编辑对基因组重新配置，同时技术门槛的降低会加大环境风险，因此需要更加严格。站在中间路线的人则认为应保持现状，然后再逐步减轻或加强，而操作精准度增加并不会降低风险。 “我受监管吗？”

　　美国农业部认定Calyxt土豆不在转基因法规监管内。2014年8月28日，美国农业部动植物卫生检验局回复Calyxt公司咨询称，该土豆有别于传统的转基因作物，最终产品不含有任何外源的遗传物质，农业部对于转基因作物的管理条例不再适用，因此不受相关条文（即《生物技术监管协同框架》）管理。

　　自2011年7月至2014年11月，美国农业部动植物卫生检验局网站上已有25封来信咨询，均涉及同一个问题：“我受监管吗？”

　　早在四年前美国就《新兴技术监管和监督原则》强调，监管要遵循科学，定量和定性考虑效益与成本，如果没发现重大的监督问题，考虑不予监管。

　　美国农业部海外农业局新技术与生产方式办公室副处长彼得里（Mark Petry）对《财经》记者表示，在美国，基因组编辑产品是遵循个案分析的原则、以科学为基础进行的。与此同时，一些转基因产品被等同于常规育种产品对待。

　　彼得里透露，近期许多业内科学家建议，监管机制应该保持一贯性， 如果在无法区分基因组编辑产品与常规育种产品的情况下，两种产品应该等同对待。

　　此外，如果Calyxt土豆要出口，仅仅拿到美国农业部的许可远不是终点，各个国家的监管都需要协调。

　　6月上旬，由美国、英国、阿根廷、中国多个国家和地区的政府官员、科学家、产业人士参加的新育种技术交流活动接连在菲律宾和中国举行，其目的即是协调各个国家和地区的基因组编辑育种技术监管。

　　美国政府已经将一些产品的安全评价材料在网络上公开，以便各国参考。

　　欧盟的做法则有些费解，欧盟于1998年批准Mon 810转基因玉米、1998年批准了两个康乃馨生物技术品种后，没再批准新的栽培申请。如今主要的生物技术公司退出了欧盟，先正达公司停止在欧洲的基因工程项目，孟山都从欧盟撤走所有栽培档案。如果将基因组编辑育种技术纳入转基因育种范畴，那么这一技术在欧盟将又一次陷入绝境。

　　欧洲食品安全局（EFSA）转基因生物（GMO）小组成员约内斯（Huw D Jones）在北京上述交流活动中透露，欧盟正在考虑这一问题，2015年夏季之前完成转基因生物体定义的法律审查，秋季将提交最终草案给成员国评审，希望在年底之前发表涵盖现有新育种技术的指南。他本人表示，如果产品中不再有重组DNA，且基因组编辑无法与自然突变区分的话，那么不应纳入已定义的转基因育种范畴。

　　阿根廷的做法接近美国。阿根廷国家农业生物技术咨询委员会执行主任、农畜渔业部生物技术主任莱马（Martin Lema）介绍，只要最终产品不含外源基因，则不纳入转基因产品的监管范畴。

　　在日本，申请基因组编辑育种技术品种须在种植以及用于食品和饲料之前咨询主管部门，并请其裁决最终产品是否纳入监管。 中国的政策选择

　　中国并非旁观者。以中国科学院遗传与发育研究所研究员高彩霞等人为代表，中国已经在基因组编辑的小麦育种上做了出色的工作。

　　白粉病是小麦的世界性病害，小麦中的致病基因在其A、B、D基因组上各有一个拷贝。高彩霞与中国科学院微生物研究所研究员邱金龙合作利用TALEN技术，在六倍体小麦中对该基因的3个拷贝同时进行了突变，获得对白粉病具有广谱抗性的小麦材料。该研究结果于去年7月发表在权威生物技术期刊《自然-生物技术》在线版。

　　需要注意的是，这种抗白粉病小麦很难通过杂交育种获得，因为杂交育种利用的是自然突变产生的植株，而六倍体小麦很难发生3个拷贝同时突变。同样，传统转基因技术也不容易实现，因为转基因技术具有插入的随机性，做不到在特定基因上的插入，而六倍体的筛选工作量是无穷大的。

　　高彩霞还利用基因组编辑技术研发了一种带有香味的水稻。不过，这些成果都还没有应用在商业生产中，因为农业部尚未有明确说法。

　　中国在农业生物技术政策制定上是有深痛教训的。作为中国转基因法规的主要起草人之一，中国农业科学院植物保护研究所生物安全研究中心主任彭于发认为，目前看中国转基因政策采取的防守策略并不成功，亟须改进。

　　国务院颁发的《农业转基因生物安全管理条例》（下称《转基因管理条例》）于2001年5月。当时国内在该领域的研发相对落后，于是中国采取了一个防守策略，即设置高门槛，让国外产品进来时，额外增加很多程序。

　　结果出乎意料，按照彭于发的讲法就是，“外面的没挡住，里面的没起来”。以大豆为例，中国没挡住进口，自己的转基因大豆也没发展起来。因为设置高门槛后，没有一个中国的企业和研究院所能达到这样的高标准。

　　此外，还在客观上造成“能试（验）不能用，许吃不许种”现象，因为最后不允许种，投资者没有获得效益，至今只有大北农集团等少数企业开始作为。

　　对于基因组编辑育种技术，彭于发建议，其一，要避免“转基因”字眼引来的公众舆论压力，建议采用“精准育种技术”或“先进育种技术”概念；其二，因为检测不到外源基因，大量的新产品不应作为转基因产品来管理；其三，中国需要一个简化的合理程序。

　　也有不太乐观的看法存在。部分业内人士就认为，这一育种技术恐怕不能逃脱作为转基因的监管。按照《转基因管理条例》第一章第三条，“农业转基因生物是指利用基因工程技术改变基因组构成，用于农业生产或者农产品加工的动植物、微生物及其产品”，基因组编辑技术既然是在作物基因组水平上的遗传修饰，那么则属于基因工程，符合上述定义。

　　基因编辑范文第4篇

　　1987年，一个科学研究小组发现，在一个细菌基因的一端有一个奇怪的重复序列，一个DNA序列紧跟着几乎完全相同但以相反方向构造的序列。这一现象当时并未引起太多人的注意。过了10年，破译微生物基因组的生物学家开始经常发现这类令人费解的DNA重复模式，因为这种重复模式出现在超过40%的细菌和90%的古生菌中。这种DNA的重复序列就是基因编辑器CRISPR。即便如此，研究人员也并不理解基因编辑器的作用。

　　到了2005年，有3个研究小组发现，基因编辑器可能与微生物的免疫作用有关。其中一个研究小组是马里兰州贝塞斯达市美国国家生物技术信息中心的尤金·库宁和其同事。他们发现，基因编辑器能够整合入侵的噬菌体（一种病毒）的少量基因，从而可以参考入侵者的基因来识别和攻击入侵者，就像疫苗一样发挥作用。

　　具体作用是，细菌和古生菌占据入侵的噬菌体的部分DNA，然后将其作为核糖核酸（RNA）分子（能阻止外来DNA的匹配）的一个模板保存起来，就像真核细胞利用一个被称作核糖核酸干扰（RNAi）的系统来摧毁核糖核酸一样。简单地说，基因编辑器能模仿入侵者的基因以干扰入侵者的基因编码，从而抗击入侵者。

　　2007年，总部位于丹麦哥本哈根的食品添加剂公司——丹尼斯克公司（后被美国杜邦公司收购）的鲁道夫·巴兰格等人在研究中证明，他们通过添加或删除与噬菌体DNA相匹配的间隔区DNA，增强了嗜热链球菌对噬菌体攻击的抵抗力。也就是说，通过基因编辑器可以增强细菌防御噬菌体的能力。细菌借助基因编辑器而使自己具备一种有高度适应性的免疫系统，使得它们能击退来自某些噬菌体的多次进攻。

　　当然，基因编辑器更为现实的作用是能够为食品生产培育更强壮的菌株。因为乳品业通常依靠细菌（诸如嗜热链球菌）生产酸奶和乳酪，嗜热链球菌能将牛奶中的乳糖分解为有刺激性的乳酸。但是，噬菌体能攻击嗜热链球菌，从而让后者不能发挥作用，使得制造的酸奶或其他食物的质量或数量遭受严重损害。

　　到了2013年，研究人员对基因编辑器有了更多的了解，他们发现，基因编辑器似乎是一种精确的万能基因武器，可以用来删除、添加、激活或抑制其他生物体的目标基因，这些目标基因包括人、老鼠、斑马鱼、细菌、果蝇、酵母、线虫和农作物细胞内的基因，这也意味着基因编辑器是一种可以广泛使用的生物技术。

　　新生命的诞生

　　利用基因编辑器，研究人员可以更为迅速地改变或删除细胞中的多个基因，从而可以治疗一些遗传性疾病，例如亨廷顿病，甚至可以治疗艾滋病等现在无法治愈的疾病。当然，这一技术还以用来纠正体外受精胚胎的基因缺陷，如此，将可以创造新的健康生命。

　　现在，中国研究人员利用基因编辑器走在了创造新生命的前列。南京医科大学生殖医学国家重点实验室、云南省灵长类生物医药研究重点实验室和南京大学的研究团队利用基因编辑器，首次在全球创造和孕育了两只靶向基因编辑猴。创造靶向基因编辑猴的目的是建立猴子疾病模型。由于人与猴子有较大的相似性，因此可以用猴子来模拟人类，试验药物和治疗遗传病，从而降低以人做试验的风险。

　　基因编辑器可以对目标基因进行插入、删除或重写，类似编辑人员对文字进行编辑、删改和插入一样，是一种对物种基因进行编辑加工的过程，由此不仅可以改变基因的功能，而且能创造新的生命。

　　研究人员先是给猴胚胎细胞注射定制的核糖核酸，然后把基因编辑器中的一种编辑工具DNA切割酶Cas9引导至期望的基因突变位点，修改了3个基因。这3个基因分别是，调节代谢的基因Ppar-γ、调节免疫功能的基因Rag1和调节干细胞和性别决定的基因。研究人员在180多个单细胞期猴胚胎中同时靶向编辑了这3个基因，然后对15个胚胎的基因组进行测序，结果发现其中有8个胚胎显示出两个靶基因同时突变的证据。这两个基因就是调节代谢的基因和调节免疫功能的基因。

　　此后，研究人员将这种经过遗传修饰的胚胎转移到代孕母猴体内，其中一只母猴分娩出了一对孪生猴。对这对孪生猴的基因组进行检测后发现，它们的DNA中确实存在两个突变的靶基因。也因此把这两只猴称为靶向基因编辑猴。

　　当然，现在这两只猴子还处于幼年期，尚无法验证是否经过编辑的靶基因会产生作用，即是否会在猴子的代谢和免疫功能方面出现变化，而检验这些功能需要等到3年后猴子成年时才能观察到。

　　另一方面，人和动物的一些生理功能和病理表现并非只是一两个基因就能决定的，所以，在未来评估这种靶向基因编辑猴时，还要评估和观察其他基因是否起作用，而且要检测是否靶向基因编辑猴的所有细胞中都有这种经过编辑加工过的基因，如此才能全面地评价这种猴子的价值。

　　但不管怎样，靶向基因编辑猴的诞生也提供了改变和修饰基因以治疗疾病的一个新的方向。

　　其实，基因编辑器的原理比较明确，就是找到目标基因并干扰这种基因的表达，或让这种基因处于沉默状态，不能表达。

　　在基因干扰的研究上，研究人员早就有类似的发现。1990年，一个研究小组给矮牵牛花转入一种催生红色素的基因，希望这种转基因矮牵牛花变成鲜红色。但是，事与愿违，矮牵牛花不仅没变成鲜红色，反而完全褪色，花瓣变成了白色。这是为什么呢？

　　1998年美国科学家安德鲁·法尔和克雷格·梅洛揭开了其中的奥秘，原来是核糖核酸干扰造成的。核糖核酸过去被视为从DNA转录遗传信息的“二传手”，蛋白质是根据其转录的信息来生产的，所以它只是一个信使。但是，法尔和梅洛发现，核糖核酸在转录信息时，有时是忠实传递信息，但有时会打折扣，从而使特定基因开启、关闭、更活跃或更不活跃，最终影响到生物的体型、外表、颜色和发育等。正是由于产生了干扰，转入矮牵牛花的红色素基因沉默下来，不能表达，矮牵牛花就不会变成红色。为此，法尔和梅洛共同获得2006年的诺贝尔生理学或医学奖。

　　利用核糖核酸干扰可以让一些致病基因沉默，以治疗疾病，例如，核糖核酸干扰可治愈实验鼠的肝炎。但是，核糖核酸干扰是通过阻断信使核糖核酸（mRNA）来阻止蛋白质生成，这时DNA的信息已经转录到核糖核酸中了，这如同马已离厩，要进行特定的干扰，有时已经太晚。

　　但是，基因编辑器所进行的干扰则是在DNA的信息还未转录到核糖核酸之时，也就是说，是在马还未离厩时对目标马匹（目标基因）的干扰。

　　更有意义的是，基因编辑器也需要核糖核酸协同作用，因为它可以为编辑器中的切割酶Cas9导向（所以基因编辑器又称为CRISPR-Cas9系统），引导其在特异位点裂解完整基因组，这个特异位点就是目标基因的位点，从而修改、修复目标基因序列，或插入新的基因片段，以干扰目标基因。

　　基因编辑范文第5篇

　　[关键词] 基因靶向修饰技术；Cas9；CRISPR/Cas；基因组编辑；基因治疗

　　[中图分类号] Q78 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）08（a）-0154-04

　　Review about CRISPR/Cas system as a new targeted genome editing technology

　　JIA Liangjie

　　College of Life Sciences， Shaanxi Normal University， Shaanxi Province， Xi′an 710119， China

　　[Abstract] CRISPR （clustered， regularly interspaced， short， palindromic repeats）/Cas （CRISPR-associated） systems are a unique prokaryotic defense against foreign genetic elements. It also be considered as a targeted genome editing tool in molecular biology research. Because of its simplicity， high success rate and high efficiency in genome targeting， Cas system became the best genome targeting tools compared with ZFNs （Zinc-finger nucleases） and TALENs （Transcription activator-like effector nucleases）. According to the recent researches， Cas system could be used as an efficient system for site-specific transcriptional repression or activation. Additionally， a specific Cas9 protein has been observed to target an RNA substrate， suggesting that Cas9 may have the same ability as RNAi technology to be programmed to target RNA as well. Overall， the targeted genome editing technology via CRISPR/Cas system has been Widely promoted and applied in many field such as the research on gene functions， the the disease model of gene knock-out animal construction and the gene therapy. So it will have significant impact on future advancements in genome engineering.

　　[Key words] Gene targeting； Cas9； CRISPR/Cas； Genome editing； Gene therapy

　　CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）/Cas（CRISPR-associated）系统是一种原核生物特有的针对外源性遗传物质免疫系统，通过序列特异的RNA介导，切割降解外源性DNA，这些外源性遗传物质包括噬菌体或者外源性质粒[1]。CRISPR/Cas系统可分为三种类型，其中类型Ⅱ CRISPR/Cas系统由于其组成简单，被改造成为基因组靶向编辑的工具。在类型Ⅱ CRISPR/Cas系统中，CRISPR能够转录产生前体crRNA（Pre-CRISPR RNA，Pre-crRNA），Pre-crRNA经过Cas9-tracrRNA复合物加工后产生成熟的crRNA（CRISPR RNA），crRNA的5′端区域能够与靶位点互补配对，而其3′端能够与tracrRNA（trans-activating crRNA）及Cas9蛋白形成复合物，从而引导Cas9蛋白结合于靶位点进行特异性地切割。CRISPR/Cas系统与其他外源核酸防御系统（如限制修饰系统）最重要的区别在于：CRISPR/Cas系统具有记忆性，细菌会记忆首次入侵外源核酸的信息，在其再次入侵时，特异性的识别并切割这些外源核酸酶使其降解，保护自身遗传物质的完整准确[1]。特异的Cas蛋白会识别外源性的遗传物质中具有原型间隔序列毗邻区（protospacer adjacent motifs，PAM）的DN段，通过Cas蛋白将PAM5′端的DNA（即原型间隔序列）加工成短的DN段，插入到其CRISPR序列的重复序列之间，最终使得细菌通过spacer序列识别并且随后靶向这些外来原件进行切除[2]。

　　类型Ⅱ CRISPR/Cas系统组成最为简单，只需要Cas9蛋白、tracrRNA、crRNA、RNase Ⅲ四种成分即可发挥作用[3]。在这一系统中，Cas9蛋白在crRNA的加工以及对外源DNA的特异性切割中都发挥着重要的作用[4]。因此本综述也主要介绍针对类型ⅡCRISPR/Cas改造而来的相关技术。

　　1 CRISPR/Cas系统可以作为一种位点特异性基因编辑平台

　　CRISPR/Cas系统作为一种具有位点特异性的基因编辑系统，其最大的特点在于操作简单，这是因为其识别的特异性是有crRNA序列决定的。有报道称，可以通过人工合成crRNA序列使得Cas9系统识别并结合到与该crRNA互补的DNA序列上，最终介导Cas9蛋白特异性的切割该杂交区域[5]。与crRNA互补的靶位点序列称为原型间隔序列，除了与crRNA存在互补序列外，在互补序列的毗邻区还必须存在原型间隔序列毗邻区（proto-spacer adjacent motif，PAM）。PAM序列对于Cas9系统能够有效稳定的发挥作用有着重要的意义，其使得双链RNA复合体与靶序列精准的结合，并有效地避免了自身结合现象的发生。

　　在Cas9系统发挥识别剪切过程中，tracrRNA首先与crRNA形成crRNA：tracrRNA复合体，Cas9蛋白识别并与crRNA：tracrRNA复合体结合，在crRNA的引导下识别并切割靶位点。为了进一步简化操作过程，研究人员依据crRNA：tracrRNA复合体的结构特征设计了sgRNA（single guide RNA），sgRNA具备crRNA：tracrRNA复合体的功能，能够被Cas9蛋白识别并引导Cas9蛋白结合于靶位点[5]。

　　上述Cas9所具有的这些优点使得其能够成为一种跨平台的基因编辑工具在多种实验模型中发挥价值。最新的研究结果显示，Cas9作为一种基因组编辑工具已经成功的应用在细菌、酵母、植物、线虫、果蝇、斑马鱼、小鼠和人的细胞模型之中（既包括传代细胞系和干细胞中）[5-7]{Cong，2013#427}{Cong，2013#427}{Mali，2013#409}{Mali，2013#409}{Cong，2013#425}{Cong，2013#425}{Cong，2013#425}。这说明了它是一种多物种适应性的，位点特异性的有效基因组编辑工具。Cas9-sgRNA在靶位点切割产生双链DNA断裂（Double strand break，DSB）后，细胞可以通过两种方式对DNA进行修复，非同源末端连接（non-homologous end joining，NHEJ）修复方式和同源重组方式（homology-directed repair，HDR）。非同源末端连接往往使得核酸链被剪切的区域发生基因突变，导致编码的基因会丧失功能[8-9]。而同源重组往往通过供体DNA与基因组DNA之间的同源重组造成靶位点的纠正或者靶向插入外源基因[8-9]。

　　由于sgRNA对靶序列识别的长度只有20个碱基，且Cas9蛋白对sgRNA 5′端序列与靶位点的错配不敏感，这使得Cas9-sgRNA技术的脱靶率比较高。为了提高该技术打靶的特异性，一种突变型的Cas9蛋白（Cas9 D10A）被构建出来[8-9]。这种突变型的Cas9核酸内切酶是将Cas9蛋白的两个核酸内切酶结构域之中的一个（RuvC-Ⅰ）经过点突变的从而失活，另一个切割结构域被保留，从而使得目标序列形成单链断裂（nicked DNA）[5]。这样需要有结合于两条互补的DNA链上相邻位置的一对sgRNA同时引导Cas9 D10A识别并切割靶位点才能造成DSB，从而加大了识别的长度，有效的提高了Cas9-sgRNA技术的特异性[8-9]。

　　2 利用Cas9系统在转录水平对基因表达的调节

　　Cas9-sgRNA作为一种能够与靶位点特异性识别并切割的技术，其用途不仅限于对靶位点的靶向编辑。通过点突变使Cas9蛋白的两个核酸内切酶结构域活性全部丧失获得dCas9，但是dCas9仍保留了与靶位点特异性结合的能力，这样将dCas9-sgRNA作为与DNA特异性识别的平台，同样具有很大的应用价值[5，10]。dCas9-sgRNA结合与DNA上，阻断该位点上基因的转录，可以起到转录抑制的效果。如果在dCas9的C端融合转录抑制结构域KRAB（Krüppel associated box），获得的dCas9-KRAB-sgRNA具有更强的转录抑制效果，将可以替代脱靶效应明显的siRNA技术。如果在dCas9的C端融合转录激活结构域p65AD，则可获得能激活特定基因转录的转录因子[10]。通过以上这两个方面的改造可以使Cas9-sgRNA成为对基因表达的调控工具。由于原核表达系统中，需要依赖于诱导与阻遏调控机制，相反，真核生物中，调控的方式是散在的协同调控方法。所以当我们设计在原核生物中表达一个真核生物的基因或是在真核生物中表达一个原核生物的基因时，这就需要在基因序列前附加一个新的启动子和具有调控作用的小分子进行转录水平的调控，甚至需要对于特定的基因序列设计相应的增强子来对于目标基因的表达进行调控，而利用dCas9-激活或抑制系统就可以绕过这些繁琐的步骤[11-13]。

　　3 利用Cas9系统对目标RNA序列进行操纵

　　最近，相关研究证明了病原体Francisella novicida基因组中编码的Cas9核酸内切酶能够引起一个位点特异性的转录抑制作用[14]。该文章报道了通过tracrRNA和一种新型的小RNA（small CRISPR/Cas-associated RNA，scaRNA）所介导，F.novicida Cas9（FnCas9）能够与靶向的mRNA相结合，从而进一步发生反应的过程。随后，这种Cas9-scaRNA-tracrRNA-mRNA复合结构的各组分之间互作导致了mRNA稳定性衰减从而将靶序列的表达量降低。以此可以推测FnCas9或可能其他的Cas9系统将可以很容易的被介导靶向RNA。事实上，实验还为研究Cas9系统优先靶向RNA或DNA的机制方面提供了启发，也就是FnCas9系统作为Cas9系统的一个个例，具有较强的结构特异性和序列需求性。

　　FnCas9系统靶向特定的RNA序列原理做出第一种推测是， FnCas9系统自身结构的特殊性决定了功能。在目前已知的蛋白结构中没有一个是可以通过保守残基与靶向mRNA结合的[14]。相反，在FnCas9系统中存在一个精氨酸富集基元（arginine-rich motif，ARM）结构域，并被证明是在其结合mRNA的过程中发挥了重要的作用[12]。FnCas9系统可能在tracrRNA和mRNA中间形成了一个简单的脚手架结构，这个结构促使了靶向的核酸内切酶对目标区域RNA的降解[15]。另一种推测是介导RNA和靶向RNA之间的非同源性互作下进行识别并结合。实验证实，这个现象在病原体F. novicida中出现，tracrRNA上与mRNA反向互补的同源序列和非同源序列相互交错结合，从而形成tracrRNA-mRNA复合物。

　　这项新的技术一经提出，预示着FnCas9将会代替shRNA（short hairpin RNA）/siRNA等传统RNAi（small interfering RNA）技术成为一种新型的RNA干扰物而对于不同种类的细胞及动物模型定的基因的下游产物进行RNA干扰[16]。在目前的研究成果看来，并不能确定此系统能否稳定地在真核生物的细胞之中都能发挥降解RNA的作用[23]。当然，FnCas9系统也并不是唯一一个能够与mRNA结合产生干扰作用的Cas9系统一种存在于Pyrococcus furiosus 的CRISPR/Cas蛋白亚型（Ⅲ型）被证明可以靶向消化RNA底物[16]。研究发现，与先前提到的FnCas9相比，这一系统所能够识别并干扰的RNA序列更长，也就表明，这一系统与基于Cas9系统的FnCas9干扰物相比有更高的特异性，这一平台的发现将极大促进RNAi技术的进步。

　　4 展望及结语

　　到目前为止对CRISPR/Cas9技术的开发尚属初步。首先，虽然Cas9系统会被sgRNA引导从而识别出靶序列，但脱靶效应依然存在[11]。为了减少脱靶效应，研究人员得出了很多方法改变现状，如通过改变sgRNA的二级结构、改变sgRNA的长度、或是通过互补的切口酶预先制造双链DNA断裂，这都能有效地减少脱靶效应[11，17-19]。另外，PAM区域与靶片段的同源序列的长短也在近期被报道，在对于Neisseria meningitidis中的Cas9系统（NmCas9）的PAM序列的特异性分析的报道中我们就可以发现，NmCas9系统的PAM区域（5′-NNNNGATT-3′）与Streptococcus thermophilus中的Cas9系统的PAM区域（5′-NNAGAAW-3′）比Streptococcus pyogenes Cas9（5′-NGG-3′）对PAM区域配对的要求严格的多[5，8，20]。

　　从最开始认识到CRISPR作为细菌和古细菌的一种免疫系统，到之后通过观察到这种获得性的免疫能力的细菌或是古细菌也能够生存下来并能将免疫能力传递给下一代，认识到 CRISPR/Cas9是一种能够遗传的免疫系统，这完美地验证了拉马克的获得性遗传理论[21]。通过这种在原核生物中发现的遗传物质靶向操作系统，现在能够很快速地对遗传物质进行操作或修饰，无论是在细胞系中还是在模式动物的胚胎中[22]。CRISPR/Cas9系统在基因治疗方面能够发挥较大的作用。通过导入Cas9系统和相应的靶向致病基因的sgRNA载体，来对遗传缺陷进行纠正或删除，这种技术将在未来几十年之内将会逐步成为一种可靠地治疗手段。当然，与成熟的ZFN 和 TALEN等遗传物质靶向编辑系统相比，CRISPR/Cas9核酸内切酶系统具有得天独厚的优越性，其优越性体现在如构建简单方便快捷、安全性高、毒性小等方面。CRISPR/Cas9系统在临床治疗、基础理论研究和农牧渔业等领域必将会发挥巨大的作用，并且将会对分子生物学研究和基因治疗领域产生深远的影响。

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　　基因编辑范文第6篇

　　早在1987 年，CRISPR序列由日本科学家在大肠杆菌中发现[1]，但由于这段序列的功能无法确定，因此该发现一直未引起人们的注意，随后，研究人员研究发现这种间隔重复序列广泛存在于细菌和古细菌的基因组中，随着人们对该结构的逐渐了解，2002 年，这种结构被正式定义为CRISPR。2005 年，研究人员发现CRISPR的间隔序列可以识别并结合特定的噬菌体DNA 序列，从而使得CRISPR序列在获得性免疫中发挥作用。2008 年，Marraffini 等[2]发现细菌CRISPR 系统能够阻止外源质粒的转移，并首次利用实验验证了CRISPR 系统的功能，科学家们也由此揭开了研究CRISPR 系统作用机制的序幕。

　　1 CRISPR的结构与分类

　　CRISPR 作为一种特殊DNA 重复序列，主要由多段长度为25 50 bp 长度的高度保守重复序列和26 72 bp 长度的间隔序列串联而成。同一个CRISPR位点中的重复序列一般具有极高的保守性，5’端与3’端部分尤为保守，但在微生物种间甚至同一个基因组的不同CRISPR位点间却存在较大的差异。另外，不同的CRISPR位点，其包含的间隔序列的数量差别也很大，从几个到几百个不等。

　　CRISPR/Cas 系统大体上可以分为3大类型：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。其中，Ⅰ型和Ⅲ型在介导外源DNA 降解过程中需要多种Cas 蛋白来参与反应，形成的切割复合体结构复杂，Ⅱ型系统组分则较为简单，只需要一个Cas9 蛋白来切割DNA 双链。一个简易的Ⅱ型CRISPR/Cas 系统必定要含有gRNA 和Cas9，Cas9 蛋白具有改造crRNA 和破坏双链DNA 的双重功能，位于gRNA 5' 端的20 bp左右的碱基决定CRISPR/Cas9 系统在应用时Cas9核酸酶特异性切割的位点，主要负责决定CRISPR/Cas9 系统的特异性。目前以Ⅱ型CRISPR 系统为基础的CRISPR/Cas9 系统在基因组编辑中有较为广泛的应用。

　　2 CRISPR/Cas9的作用机理

　　CRISPR/Cas9 基因组编辑技术的基本原理为，将tracrRNA： crRNA 设计为引导RNA（gRNA），gRNA 包含位于5’端靶DNA 的互补序列以及位于3’端tracrRNA： crRNA 的似序列，利用靶DNA 的互补序列来定位需要编辑的位点，利用该类似序列与Cas9进行结合。该技术仅设计引导RNA 即可实现对含有PAM 序列的任一靶DNA序列进行插入、敲除与定点突变等修饰。由于设计操作简单、通用性好及编辑效率高等优势，CRISPR/Cas9 的基因编辑技术已成为TALEN 与ZFN之后的新一代基因组编辑技术。

　　另外，CRISPR/Cas9 系统还可以实现同时对多个不同靶DNA 序列进行编辑。利用CRISPR 位点自身的特点，设计对应不同靶DNA 序列的间隔序列，插入到重复序列之间，经过转录加工后会形成多个可定位于不同靶DNA 序列的双引导RNA，或者串联不同的sgRNA均可实现对哺乳动物细胞基因组的多个不同基因同时进行编辑。

　　3 CRISPR技术的应用

　　CRISPR/Cas9 系统作为新兴的基因编辑技术，目前已逐步在人类细胞、斑马鱼、小鼠、酵母、果蝇、细菌及水稻等作物中进行研究并报道。

　　在作物新品种培育和改造时，传统的转基因技术培育和改造新品种一般采用利用外源基因随机整合的方式，转基因表达的可控性较差。而CRISPR/Cas9 技术则可以进行定点修饰，达到高效定向。Shan 等用该技术敲掉了小麦的一个基因，得到了耐白粉病的小麦新品种。该团队还利用CRISPR/Cas9 技术定点突变了小麦和水稻两种作物的MLO 和PDS 等5 个基因。

　　在哺乳动物的研究方面，研究人员采用该技术建立基因打靶小鼠，结果证实，采用该技术不仅可以通过非同源末端连接途径实现对多个靶基因的定点敲除，还可以通过同源重组途径对多个靶基因进行靶向修饰。这些成果为其在生物工程、基础医学、医药学科等多种领域中的应用中提供了有力的基础。

　　4 展望

　　CRISPR/Cas9 作为细菌最为简单的Ⅱ型获得性免疫系统，被成功改造为继TALEN 与ZFN 之后新一代基因组编辑技术，为基因组的定向改造调控与应用等带来突破性革命，且相对于TALEN 和ZFN，CRISPR/Cas9有其独特的优势：（1）构建和设计方法简单快捷，成本低廉，适用于任何分子生物实验室；（2）用于基因组的点突变编辑效率优于ZFN和TALEN；（3）可同时实现多个基因的打靶。可见，CRISPR/Cas9 在基础理论研究、农牧渔业和临床治疗等领域必将有越来越广阔的应用前景。当然，目前关于CRISPR/Cas9 系统还有许多亟待解决的问题，相信随着人们逐步深入和全面的研究，CRISPR/Cas9 技术将会展现出其无比强大的生命力。

　　【参考文献】

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　　基因编辑范文第7篇

　　[关键词]基因编辑技术； CRISPR/CAS9； ZFNs； TALENs

　　基因编辑技术是一项对基因组进行精确定点修饰的技术，可对特定DN段进行敲除、加入和替换等，从而在基因组水平上进行精确的基因编辑。此过程模拟了基因的自然突变，修改并编辑了生物的基因组，使研究人员可以在极短时间内模拟自然界漫长时间的基因演变，甚至能够完成自然进化中无法完成的基因组改变。在科研领域，该技术可以快速构建模式动物，节约大量科研时间和经费；在农业领域，该技术可以人为改造基因序列，使之符合人们的要求，研制如改良水稻等粮食作物；在医疗领域，该技术可以更加准确、深入地了解疾病发病机制和探究基因功能，以及改造人的基因，达到基因治疗的目的等。因此，基因编辑技术具有极其广泛的发展前景和应用价值。

　　锌指核酸酶（zincfinger nucleases，ZFN）、转录激活因子样效应物核酸酶 （transcription activatorlike effector nucleases，TALENs）和成簇的、规律间隔的短回文重复序列CRISPR/Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）是三大基因编辑技术。这3种技术皆是通过在特定的靶向序列处引入双链断裂缺口（doublestrand break，DSB），继而通过NHEJ途径（nonhomologous end joining，NHEJ）和HR（homologous recombination，HR）途径这2种细胞内DNA修复机制完成修复。NHEJ途径（nonhomologous endjoining，NHEJ）使基因MDNA缺口处有碱基的插入或者缺失，造成移码突变，导致基因的敲除；HR（homologous recombination，HR）途径在提供外源DNA模板的条件下使基因组DNA得到精确的基因修复或靶向基因的添加[1]。由此可见，这3种基因编辑技术本质上均是利用非同源末端链接途径修复和同源重组修复，联合特异性DNA靶向识别及核酸内切酶完成的DNA序列改变。

　　11ZFNs每个锌指核酸酶单体都是由锌指蛋白（zinc finger protein，ZFP）与非特异核酸酶结合的人工合成酶。此酶的N端部分是能识别含有特定DNA序列的锌指蛋白，C端部分则由非特异性切割结构域Fok I以及连接DNA结合结构域和内切酶的肽段组成[23]。ZFN的特异性取决于ZFP，因此筛选高质量的ZFP是获得高效、特异性的ZFN的前提[47]。ZFP通常由3～6个锌指组成，每个锌指识别基因组中连续的3个碱基。ZFP一旦与基因组中的特定序列结合，Fok I核酸内切酶便会形成二聚体发挥内切酶活性，产生DNA双链断裂的缺口，继而通过细胞内修复机制对断裂部位的基因进行修饰[811]（图1）。ZFN的基因打靶效率一般能够达到30%，可以做到针对特定序列设计ZFN来实现对靶基因的修饰。然而ZFN识别结构域存在的上下文依赖效应大大降低了ZFN设计和筛选效率。目前尚不能针对任意一段序列均可设计出满足要求的ZFN，也不能在每一个功能性染色体区段都能够顺利找到适合的ZFN作用位点。在ZFN的筛选和设计方面存在较大的技术困难之外，其制备价格也比较昂贵。此外，ZFN的脱靶切割也往往会导致细胞毒性。综上这些因素使得ZFN在基因治疗领域的应用有一定的局限性。

　　12TALENsTALEN是植物病原菌黄单胞杆菌Xanthomonas sp.产生的TALE蛋白的中央区域结构域与FokⅠ核酸内切酶结构域组合而成的一类重组核酸酶。TALE蛋白的中央区域结构域是该蛋白识别特异DNA序列的结构域。它包含了155～195个蛋白单元模块，每个模块单元有34个氨基酸残基，其中除第12和13位氨基酸可变外，其他氨基酸都是保守的。因此，这第12和13位氨基酸被称作重复可变的双氨基酸残基（repeat variable diresidues，RVDs） 位点[12]，是靶向识别的关键。由于TALE存在多种变体，所以可以构建出靶向基因组中预设DNA靶位点的多种TALEN。相比ZFN技术，TALEN使用了TALE蛋白的中央区域结构域代替ZFP作为人工核酸酶的识别结构域，更好地解决了DNA序列识别特异性低的问题。TALE蛋白中央区域结构域对碱基的识别只由2个氨基酸残基决定：组氨酸天冬氨酸特异识别碱基C，即HD（His Asp）C；天冬酰胺异亮氨酸识别碱基A，即NI（Asn Ile）A；天冬酰胺甘氨酸识别碱基T，即NG （AsnGly）T；天冬酰胺天冬酰胺识别碱基G或A，即NN（AsnAsn）G或A；天冬酰胺赖氨酸识别碱基G，即NK（Asn Lys）G；天冬酰胺丝氨酸可以识别A，T，G，C 中的任一种NS （AsnSer）A，T，C，G [1314]（图2）。这种与DNA碱基一一对应的方式在设计上相对于ZFN要简单得多。然而，在实际构建过程中，TALE分子的模块组装和筛选过程也比较繁杂，通常需要大量的测序工作。这使得该技术的使用成本较高，对于普通实验室的可操作性较低。此外，TALEN分子比ZFN大得多，因而在不能高效导入细胞方面也限制了它的应用。

　　13CRISPR/Cas9CRISPR/Cas（clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences/CRISPRassociated protein）系统是在细菌和古细菌中发现的一种获得性免疫系统[15]，由成簇的、规律间隔的短回文重复序列CRISPR与Cas蛋白组成，能特异性识别外源病毒或质粒的核酸物质，并对其进行剪切，起到防疫外源核酸入侵的作用[16]。其中CRISPR簇通过转录生成一段非码RNA，即CRISPR前体

　　的靶标可设计为针对一个基因，也为针对多个基因，都能达到有效的特异性位点编辑的效果。CRISPR/Cas9系统已被公认为是继“锌指核酸内切酶（ZFN）”、“类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）”之后出现的第3代“基因组定点编辑技术”。ZNFs和TALENs作用时均是采用蛋白质对DNA序列的识别，而CRISPR/Cas9对靶序列的识别是RNA与DNA的碱基配对过程。该识别方式使得CRISPR/Cas9与前二者相比更为精准，降低了脱靶切割的几率，减低了细胞毒性。CRISPR/Cas9所有成分都可以通过导入质粒进行表达，因此也省去了耗时耗力的蛋白质工程过程。同时，研究人员可以通过生物信息学分析，设计出针对绝大多数基因的特异性靶标识别crRNA。因此，与前2代技术相比，CRISPR/Cas9成本低、制作简便、快捷高效、脱靶率低的优点使其迅速风靡于世界各地的实验室，成为科研、医疗等领域的有效工具，逐渐成为当今分子生物学领域最炙手可热的技术之一。然而CRISPR/Cas9 系统也存在着一些不完美之处：Cas9 蛋白对于目标序列的识别除了依靠crRNA序列的匹配之外，目标序列附近必须存在一些小的前间区序列邻近基序（PAM），因此Cas9 蛋白对于设定序列的切割仍有局限性；另外和ZFNs及TALENs技术一样，CRISPR/Cas9也面临着如何控制双链断裂之后的非同源末端连接修复可能会随机产生细胞毒性的问题。

　　14 NgAgoCRISPR是以RNA为向导寻找靶向序列，而NgAgo则是以DNA来担任向导。韩春雨等的工作显示，NgAgo可结合24个碱基的gDNA，比CRISPR结合19个碱基的gRNA要长5个碱基，因此理论上精确性要高1 024倍，脱靶率也较低。然而，不同于CRISPR/Cas9技术大量运用已获得了实践验证，NgAgo的作用效果还有待于今后工作的检验。

　　2基因编码技术的应用

　　21在基因治疗中的应用随着DNA双螺旋结构的发现和以DNA重组技术为代表的现代分子生物学技术的发展，以及人类对疾病认识的不断深入，越来越多的证据表明，许多疾病都与基因突变、缺失或表达异常有关，由此基因治疗技术顺势而生。基因治疗是指应用基因工程技术将正常基因或有治疗作用的基因引入患者细胞内，以纠正致病基因的缺陷而根治疾病。其最核心的策略是通过细胞内基因修饰来治疗疾病。近两三年来，基因编码技术作为该策略的新生力量开始活跃在基因治疗的舞台上，在癌症、遗传性疾病和逆转录病毒相关的传染病等疾病的治疗方面取得许多堪称跨时代的佳绩。

　　癌症治疗方面：2015年11月英国伦敦大奥蒙德街医院（Great Ormond Street Hospital）的医生第一次依靠使用“分子剪刀”修改基因的疗法，成功地治愈了一名患有“无法治愈的”白血病的1岁女孩“莱拉”（Layla）。其治疗方案是利用TALEN蛋白对异体T细胞进行基因编辑，去除内源性TCR（提高肿瘤杀伤特异性）及CD52（避免药物alemtuzumab的干扰），并命名为antiCD19 CART细胞，再将这些经过设计的“人工培育的免疫细胞”输入患者体内去捕捉和杀伤肿瘤细胞。经过1个月的治疗，这名女孩目前摆脱了癌症，身体状况很不错，成为世界上首次用基因编辑治愈的白血病女孩[18]。此外，科学家们在过去的几十年中已经确定了许多肿瘤治疗中相关的基因，包括原癌基因、抑癌基因、基因组修饰类、基因抗药性基因。近2年，研究者们已经开始利用基因编码技术对上述基因开展了大规模的基因编辑修饰研究，预计今后几年内会出现多项癌症治疗方面的重大突破。

　　遗传性疾病治疗方面：2015年底《Nature》杂志发表的对2016年热点研究领域的展望（The science to look out for in 2016）中提到美国加利福尼亚州里士满Sangamo生物科学公司将计划开展利用ZFN纠正导致血友病基因缺陷的人体试验，并对其研究成果表示非常期待。另外该公司还与马萨诸塞州剑桥市的Biogen公司合作开始了另一项试验，尝试通过该技术提高β地中海贫血患者体内一种血液球蛋白的功能[19]。已有研究证实人β珠蛋白（HBB）基因的突变可能导致地中海贫血症。我国中山大学黄军就和他的团队利用CRISPRCas9基因编辑技术，修改了人类胚胎HBB基因的DNA，为治疗地中海贫血症提供了可能。该研究中一共使用了86个胚胎，48 h后有71个胚胎存活，其中在54个接受了基因测试的胚胎中仅有28个胚胎的基因被成功修改，但其中只有一小部分包含替代的遗传物质。该研究是史上第一例利用基因编辑技术改造人类胚胎细胞的案例。尽管该研究使用的胚胎均为无法发育成婴儿、不能正常出生的胚胎，该成果的伦理问题在西方仍引发巨大争议，由此《Nature》的记者和编辑们最终将黄军就选入了年度十大人物之列[20]。多种肌肉营养障碍症（duchenne muscular dystrophy，DMD）是表达dystrophin蛋白的基因发生移码突变，导致不能形成有功能的抗肌萎缩蛋白dystrophin所引发的一种遗传性疾病。2014年研究者已利用CRISPR技术成功修复了小鼠胚胎中的dystrophin基因缺陷。今年，西南医学中心的Chengzu Long，杜克大学的Charles Gersbach，哈佛大学Amy Wagers 与MIT张锋合作研究组这3个独立的研究组又分别完成了小鼠成年体的基因修复。其中Chengzu Long研究组的研究方案为利用腺病毒将gRNA以及CRISPR/Cas9导入肌肉细胞，利用CRISPR/Cas9切除有缺陷的DN段，使小鼠能够产生较短版本的有功能的dystrophin蛋白[21]。

　　逆转录病毒相关传染病的治疗方面：HIV病毒的基因会整合到病人的基因组上。利用抗逆转录病毒药物治疗仅能抑制HIV病毒的复制但对整合在细胞中的病毒DNA不起作用，一旦停止服用药物这些病毒余孽就会起死回生，开始产生艾滋病原体。因此只有清除整合在宿主靶细胞上的HIV病毒基因才能实现根治艾滋病的梦想。2013 年，朱焕章等设计并获得了一对能特异靶向多数HIV亚型基因保守区LTR （long terminal repeat） 的ZFN，并证实该ZFN能特异性靶向HIV感染及潜伏细胞系上的HIV1前病毒LTR，且介导了HIV1整合基因的高效切除，亩获得了显著抗HIV感染的效果[22]。今年，Rafal等[23]利用CRISPR/Cas9技术使带有HIV病毒的T细胞失去活性，同时病毒复制在受感染细胞中降低了90%。这一治疗方案预计在两三年后开展临床试验。

　　22在新方法学及动物模型制备上的应用当前，各类基因敲除（knockout）和基因嵌入/置换（knockin）基因工程动物及细胞系已经成为现代医学认识疾病发生发展规律、研究疾病预防和治疗的重要实验工具和手段。传统的基因工程动物制备工艺――基因打靶技术是基于胚胎干细胞的一种同源重组技术。利用该技术制备基因修饰动物周期较长且存在生殖系统传递失败的风险。新型的基因编码技术系统可在小鼠受精卵中直接进行基因组编辑，因而快速、高效、低成本、无物种限制地一步生成基因工程动物。复旦大学生命科学学院遗传工程国家重点实验室的研究人员通过CRISPR/Cas9技术进行凝血因子Ⅸ（Factor Ⅸ，FⅨ）基因敲除，快速、高效地构建血友病乙模型小鼠，以期为血友病乙的研究提供更加便捷的途径[24]。Park 等[25]使用TALEN 技术将诱导的多能干细胞中含有F8 基因的140 kb染色体片段倒置，建立了小鼠血友病A模型，并且再次通过TALEN基因编辑工具将其之前倒置的染色体片段再重新恢复到正常。实验结果表明TALEN基因编辑工具既可以建立疾病模型，又可以介导疾病的再次纠正。军事医学科学院的研究人员利用CRISPR/Cas9介导的同源重组，将有丝分裂降解结构域MD（Mitosisspecial degradation domain，MD）插入到进基因组表达框上游，以期周期性持续降解细胞内CTCF（CCCTC binding factor，CTCF）蛋白，从而获得CTCF蛋白特异性降解细胞系，为后续研究CTCF功能奠定基础[26]。

　　此外，随着现代生物技术的不断发展和完善，基因编辑技术已经变为科研人员的新宠，越来越多的科学家运用其与其他技术相结合进行各种学术研究。第三军医大学西南医院和重庆大学的研究人员通过CRISPR/Cas9介导的同源重组修复方法，用GFP标记HCC细胞中的内源多功能性因子Nanog，证明雄激素/雄激素受体轴可以通过直接结合其启动子，增加Nanog的表达，并促进HCC细胞的干性和肿瘤发生[27]，从而初步阐明了肝癌发生的性别差异的机制。CRISPR/Cas9技术的成熟使得利用多重sgRNA载体高效、高通量编辑细胞内基因成为可能，为新型功能遗传筛选创造了条件。IAA2（indole acetic acid 2）是拟南芥Aux/IAA生长素响应基因大家族中的一员。由于没有该基因的失去功能型突变体，其功能和作用机制的研究受到了阻碍。研究人员在GoldenGate克隆技术的基础上，将每3个sgRNA串联到同一个入门载体中，再将入门载体与含Cas9表达框的目标载体LR反应，获得最终的表达载体。结果表明，设计的6个sgRNA有4个发挥了作用，产生了碱基插入突变和大片段缺失突变等多种可遗传的突变，所得到的突变体为后续的IAA2功能研究提供了良好的材料[28]。

　　23其他应用前景目前，世界各地的实验室已将基因编辑技术应用于生物学研究的各个领域。

　　预防疟疾：利用CRISPR/Cas9对蚊子的基因进行改造，使其携带一种抗疟疾的基因，从而对疟原虫产生抑制，进而遏制疟疾的传播[29]。另一种改造为导入不孕基因，使疟蚊灭绝[30]。

　　器官移植：利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，对猪胰岛素基因进行了无痕定点修饰，使猪胰岛素基因编码生产人胰岛素，成功建立了完全分泌人胰岛素的基因编辑猪。这为糖尿病人提供更为理想的临床异种胰岛移植供体。另外，有研究改造了猪肺基因以利于用于人体肺移植，以及去除了猪器官上的内源性逆转录病毒（PERV）以防止移植器官带来的病毒感染[31]。

　　生物制药：北京蛋白质组研究中心张普民教授及其研究团队利用CRISPR/Cas9技术对猪受精卵的基因组进行了基因编辑，在猪白蛋白的基因区域插入了人白蛋白的编码DNA，使猪只产生人白蛋白而不产生猪白蛋白[32]。

　　农业育种改良：利用CRISPR/Cas9技术几年内可实现至少50～100年才能完成的育种改良工作。圣保罗Recombinetics公司利用该技术培育出不会长角的牛，从而使牛无须经历被切去牛角的痛苦过程。目前该公司正致力于培育永远不需要被的猪。

　　灭绝物种复活：加州大学圣克鲁斯分校Ben Novak将灭绝的候鸽的博物馆标本DNA与现存鸽子进行序列比对，并尝试对现存鸽子进行基因改造，使这些鸽子变得更接近灭绝的候鸽。

　　3基因编码技术的争议与思考

　　基因编辑技术可谓当今生命科学界炙手可热的前沿科技。顾名思义，该技术能够对最基本的遗传单位――基因直接进行设计和修改，其意义和价值可想而知。这使得各大公司迅速加入到基因编辑的产业之中。2015年8月，比尔及梅林达?盖茨基金会和谷歌风投基金投资Editas医药公司1.2亿美元；2015年10月杜邦与Caribou生物科学公司达成了合作协议，使用CrisprCas9技术来改进农作物（http：//wwwnaturecom/news/genomeediting7factsaboutarevolutionarytechnology118869）。中国基因编辑技术产业已走在世界的前列：在CRISPR技术数上中国仅次于美国，位居世界第2；目前50多家中国研究机构已提交了基因编辑专利；劲嘉股份与黄军就团队合作开展CRISPR技术治疗地中海贫血在临床应用方面的研究。中泰证券的分析师认为未来5年仅地中海贫血基因治疗的国内潜在市场空间超过500亿元。与此同时，随着基因编码技术的不断发展，CRISPR/Cas9系统相对前两代技术效率提升了10倍以上，操作容易程度提升了100～1 000倍，构建周期缩短至原来的1/12，成本由5 000美元降低至30美元，脱靶率依据最新技术已降低至目前检测技术检测不到的水平。脱靶率、效率、便携性及成本的极大改善，使得该技术更平民化，技术门槛越来越低。它已成为许多车库生物学家/草根生物学家以及生物黑客的新宠。都柏林生物黑客和企业家Andreas Stürmer说，CRISPR是有史以来最了不起的工具，可以在自己的家里玩（http：//wwwnaturecom/news/biohackersgearupforgenomeediting118236）。

　　但任何事物都有其双面性，基因编辑技术产业虽然能够造福于人类，然而上面所述的巨大的经济利益驱动以及越来越低的技术门槛，再加上人类对自身健康改良的迫切心态极可能导致对该技术的滥用，进而对人类和地球环境形成威胁，甚至造成意想不到的生态灾难。在美国国家情报总监詹姆斯?克拉珀的威胁评估报告中，“基因编辑”已经被列入“大规模毁灭性武器和武器的扩散”威胁名单，与核武器并列（https：//wwwtechnologyreviewcom/s/600774/topusintelligenceofficialcallsgeneeditingawmdthreat/）。因此，关于该技术运用的争议从其诞生之日就已出现，并呈愈演愈烈之势。现有争议最集中之处为关于人类胚胎改造的伦理学争议。史上第一、二例基因编辑技术改造人类胚胎细胞的研究皆出现在中国。2015年4月，中山大学黄军就和他的团队利用CRISPRCas9基因编辑技术，为治疗地中海贫血症修改了人类胚胎基因组[33]。2016年4月29日广州医科大学范勇团队，宣布他们用基因编辑技术制造出一个能对艾滋病毒免疫的人类胚胎[34]。尽管这2例基因编辑研究都使用的是人类三核受精卵（不能正常发育的受精卵），但在国际上仍引起了广泛的关注和全球科学家激烈的讨论。讨论的焦点不在于文章的学术价值，而在于改造人类胚胎细胞的伦理问题。由于基因编译技术引发的伦理问题迫在眉睫，2015年12月1日，由美国国家科学院、美国国家医学院、中国科W院和英国皇家学会联合组织召集的人类基因组编辑国际峰会在华盛顿召开。会议重点了解各方对基因编辑技术的伦理问题的态度和想法。美国再生医学联盟主席兰菲尔（Edward Lanphier）等在《Nature》杂志上发表评论文章称，希望研究人员暂时不要对人类生殖细胞进行基因编辑，否则可能对后代产生无法预测的后果[35]。然而，人类胚胎改造的研究终究为大势所趋。2016年2月1日，英国政府批准了伦敦弗朗西斯?克里克研究所 Kathy Niakan研究员对人类胚胎进行编辑的请求。这项研究成为世界首例获国家监管机构批准的人类胚胎编辑研究。

　　综上所述，日渐成熟的基因编辑技术已经成为了强力的生物、医学工具，在癌症、遗传性疾病和逆转录病毒相关的传染病等疾病的治疗方面带了巨大的突破，可以快速构建实验新方法和动物模型，推动科研的发展，并在器官移植、生物制药、农业育种改良、灭绝物种复活和中药现代化等方面具有广阔的应用前景。其价值甚至引起了普通民众的广泛关注。人类畅想将来它不仅可去除遗传缺陷、治疗疾病，还可导入长寿、健康、强力的基因，甚至制造完美人类。当然，任何事物都是一把双刃剑，在乐观畅想基因编辑技术可使人类变得更加完美的同时，也不要忘记滥用技术可能带来的潜在风险和生态灾难。建立针对基因编辑技术安全有效的检测手段，制定合理健全的法律道德制度，才能使这项技术更好地应用和造福人类。

　　4基因编辑在中药发展中的潜在前景

　　如何让传统中药跟上生命科学现代化的步伐，使传统中医药走出国门，让世界接受中草药，是当今中医药工作者面临的难题。长期以来，由于中医药与现代医学、生命科学之间缺乏有效沟通的桥梁，有逐渐被边缘化的趋势。中药基因组计划将现代生命科学的最新技术和研究成果应用于中药研究，有望彻底改变中药研究手段和方法的落后局面，架起传统中医药学与现代生命科学之间沟通的桥梁。中国中医科学院中药研究所陈士林团队在著名植物学杂志《Molecular Plant》发表丹参全基因组[36]，标志着作为常用中药丹参的遗传密码被破译，为揭示丹参主要药理活性成分丹参酮和丹参酚酸生物合成及其调控的分子机制，促进丹参优良品种选育提供了重要的遗传背景基础。该工作构建了世界上首个药用植物基因组框架图，标志着我国中药研究进入了基因组学时代。目前已有多个中草药如印度大麻、赤灵芝、牛耳草、铁皮石斛等完成了基因组测序。中草药基因组研究的飞速发展为基因编辑技术在中草药研究中的应用带来了极佳的时机和广阔的前景。今后研究者们可以以丹参研究为模板，借鉴国外的植物基因组研究计划的经验，对中草药在结构基因组学、功能基因组学和生物信息学等方向展开研究。在此基础上，利用基因编辑技术开展中药药效成分、药材的生长及抗性相关基因的研究和改造工作，结合先进的育种方法，筛选出既保持“道地血统”，又优质、高产、抗病的中药材优良品种。该工作既有利于实现中药标准化生产，使中药质量可控，又有利于解决当前中药材资源面临的“断粮”困境。

　　中药药材是现代药物研发最大的遗传信息资源之一。我国在该方面具有得天独厚的优势。《本草纲目》中记载了1 892种药用植物，1995年出版的《中华本草》收集了8 000多种药用植物，而且其中不乏很多名贵，稀缺的药材如人参，虫草等。另有统计表明，我国中草药已有12 000多种。基因编辑技术的成熟也为开发这个药物基因资源带来了良机。基因编辑技术在中药资源的引入和应用，将会为解决这一问题带来新的前景。通过基因编辑技术可以快速获得药材靶基因的突变或是导入异源基因，从而快速鉴定出该基因产物与药理活性成分的相关性和重要性，发掘出新的或更高效的药物相关基因，并可更清晰地阐明药理活性成分生物合成及其调控的分子机制。

　　尽管将基因编码技术引入中药研究能为传统中草药带来新发展和突破，但与当今各个领域广泛应用基因编码技术相比，其在中药研究中的应用还处于起步阶段，还有许多基础工作有待完善。比如这一技术的应用必须以完善的中药基因资源为基础，如果没有对中药特别是具有丰富药理药效学和临床应用价值的名贵中药的基因资源的研究与开发，基因技术体系的应用必然大打折扣。此外，也不能盲目的为了中药的基因而基因，浪费大量的人力物力资源，应有的放矢的将目标集中在既具有重要临床应用价值的名贵或濒临灭绝的中药基因资源的研究与应用上，为中药现代化搭建良好的基础技术平台，让现代基因技术更好的为传统中药的发展服务。

　　[致x]李连达院士对本文的选题、框架设计等给予了诸多宝贵意见。

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　　基因编辑范文第8篇

　　农业时代的开启

　　“遗传”，听起来是个人人都能理解的名词。中国人说“种瓜得瓜，种豆得豆”，英美人说“like father like son”。这些俗语里反映的生物代际之间的相似性，就是遗传。先人们大概早就发现，不管是动物还是植物，不管是生物的外形、行为，还是性格，这些性状都能在一代代的繁衍中顽强地延续和保留下来。

　　实际上，早在人类文明开始之前，人类就已经充分―尽管也许是下意识―观察到了遗传现象的存在，甚至已经开始利用遗传规律改善自己的生活了。

　　现代人类的祖先可以追本溯源到数百万年前的非洲大陆。在两百多万年的无尽岁月里，先祖们在非洲大陆上采集植物果实、捕获动物，过着靠天吃饭、随遇而安的日子。人类文明的曙光出现在距今十几二十万年前。那时，现代人的直系祖先―人属智人种―出现在非洲大陆，并且很快一批批地走出非洲，在全世界的各个大陆和主要岛屿上开枝散叶，也把采集和狩猎的固有天性带到了世界各地。在那个时候，还压根看不出我们这些身材矮小、面相平凡的先祖会在日后成为整个地球的主宰。

　　然而，就像突然拥有了某种未知的魔力一般，差不多从一万年前开始，在世界各地快乐采集和狩猎的智人先祖们，几乎在一眨眼间就改变了赖以生存的生活方式。这些变化开启了农业时代，也最终催生了今天建立在发电机、汽车、互联网和生物技术基础