sirtuin3依赖的线粒体氧化还原稳态对AGEs诱导的椎间盘退变的保护作用

　　简介

　　脊柱结构的改变在很大程度上导致了腰痛，腰痛是导致椎间盘退变和继发性病理残疾的五大主要原因之一[1]。作为主要的椎间连接点

　　缩写：IVD，椎间盘；NP，髓核；SIRTs，Sirtuins；AGEs，晚期糖基化终产物；NMN，烟酰胺单核苷酸；SKQ1，Visomitin；MitoTEMPO，（2-（2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基-4-基氨基）-2-氧乙基）三苯基氯化膦；AMPK，腺苷一磷酸活化蛋白激酶；PGC-1α，过氧化物酶体增殖物激活受体-γ共激活因子1α；细胞色素c，细胞色素c；SOD2，超氧化物歧化酶2；TRX2，硫氧还蛋白2；TRXR2，硫氧还蛋白还原酶2；VDAC，电压依赖性阴离子通道；GAPDH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶；CCK-8，细胞计数试剂盒-8；EdU，5-乙炔基-2'-脱氧尿苷；TUNEL，TdT介导的dUTP缺口末端标记；MMP，线粒体膜电位；mPTP，线粒体通透性转换孔；ROS，活性氧

　　IVD的纤维软骨特性使其能够缓冲不同形式的机械应力，其中相应的胶质NP组织的重新分布起着重要作用[2]。常驻NP细胞是控制NP组织细胞外基质代谢的主要执行者，其产生的II型胶原和蛋白多糖是维持NP组织凝胶性质的主要分子[3,4]。细胞凋亡导致的NP细胞死亡增加可能与细胞外基质代谢紊乱有关，这种紊乱与IVD退行性变有关[4,5]。此外，越来越多的研究表明，针对NP细胞凋亡的干预可以缓解代谢紊乱和IVD退化[6,7]。因此，进一步研究NP细胞凋亡及其靶向干预，不仅有助于提高对IVD退行性变发病机制的认识，而且有助于提供潜在的治疗策略。

　　最近，越来越多的证据证实老化和退化的IVD中存在氧化应激和氧化产物浓度增加[8–10]。此外，氧化应激和随后的线粒体功能障碍参与了细胞凋亡的内在途径，它们在各种危险因素诱导的NP细胞死亡和IVD变性中的作用已被证实[11–13]。尽管针对氧化应激和线粒体功能障碍的各种干预措施已显示出对NP细胞凋亡和IVD退化的有益影响[14,15]，但这些疾病的具体机制尚不清楚。

　　Sirtuins（SIRTs）包含一类具有7个成员的NAD+依赖性脱乙酰酶，它们共享相同的保守NAD+结合位点和Sir2催化核心结构域，并调节多种生物功能[16]。其中，SIRT3、SIRT4和SIRT5成员主要定位于线粒体，其中SIRT3是最具特征的，并且具有强大的脱乙酰酶活性，与维持线粒体氧化还原稳态和功能完整性密切相关[17]。在与氧化应激和线粒体功能障碍相关的各种疾病中发现SIRT3功能受损，包括心肌肥大、急性肾损伤和骨关节炎[18–20]。此外，烟酰胺单核苷酸（NMN）作为哺乳动物NAD+的关键前体，可使NAD+/NADH比率正常化，其给药通过调控SIRT成员的活性对氧化应激相关疾病具有保护作用[21–23]。此前，我们小组和其他人的研究已经证明，晚期糖基化终产物（AGEs）在NP组织中的积累可以诱导氧化微环境和线粒体功能障碍，这与IVD退化密切相关[24–26]。然而，SIRT3在这一过程中的作用以及调控NP细胞存活和增殖的相关机制尚未被证实。

　　在本研究中，我们报道体外AGEs治疗通过诱导氧化应激和线粒体功能障碍抑制人NP细胞的存活和增殖，其中SIRT3功能和线粒体抗氧化网络的损伤起重要作用。AGEs对AMPK/PCG-1α的抑制参与了这一过程。此外，补充NMN对AGEs诱导的NP细胞凋亡和IVD变性具有保护作用，部分通过SIRT3功能和线粒体氧化还原稳态的恢复。我们的发现为NP细胞氧化应激和凋亡的机制提供了新的见解，对治疗IVD退行性变具有治疗意义。

　　2.1. 研究设计和伦理声明

　　从因腰椎管狭窄症、腰椎间盘突出症或特发性脊柱侧凸而接受椎间融合手术的患者中获取人类NP组织。相应地，还收集了患者的病历，并根据Pfirrmann MRI分级系统使用磁共振图像评估IVD退行性变程度[27]。一旦分离，NP组织样品按照其预期用途进行处理。收集14例16～64岁（平均48.6岁）男性6例，女性8例的NP组织进行免疫组化和westernblotting分析。其中特发性脊柱侧凸患者5例，Ⅲ级3例，Ⅳ级3例，Ⅴ级3例。将它们分为两部分，浸泡在rnaplater稳定液中，液氮冷冻，进行蛋白质和RNA分析，用缓冲甲醛固定（4%，ph7.4）固定，石蜡包埋进行组织学分析。特别是特发性脊柱侧凸患者的NP组织，一般评定为Ⅱ级，也被认为是健康的，另外三个组织被保存下来分离出NP细胞，以备进一步的体外实验。此外，我们使用大鼠尾椎间盘退变模型评估了IVD在体内的退变事件。

　　所有涉及人类IVD的实验方案，包括病历、NP组织采集与分析、NP细胞分离与干预，均获得华中科技大学同济医学院伦理委员会（编号：S214）的批准。动物实验按照华中科技大学动物实验委员会批准的方案进行。

　　2.2. 人NP细胞的分离培养

　　用于NP细胞分离的三种人类NP组织如上所述。Hank的平衡盐溶液用于NP组织运输，随后的细胞分离如前所述进行[28]，方法是在37°C和5%CO2条件下，用含有15%胎牛血清（Gibco，Waltham，MA，美国）和1%青霉素/链霉素（Invitrogen）。使用荧光标记的NP细胞标记抗体[29]（CD24，ab31622；KRT18，ab215839；Abcam，Cambridge，UK）鉴定第二代细胞，并用于进一步的实验。在体外实验中，将NP细胞暴露于等体积的磷酸盐缓冲盐水（PBS）或AGEs（100μg/ml或200μg/ml用PBS缓冲；默克密理博，达姆施塔特，德国）中0、12、24或36小时。用MitoTEMPO（5μM；Sigma，中国上海）或SKQ1（20 nM；美国新泽西MedChemExpress）预处理细胞2小时然后用PBS或AGEs处理，或直接与PBS或AGEs联合培养

　　NMN（100μM）、A-769662（50μM）、化合物C（50μM；MedChemExpress）或RAGE抗体（10μg/ml；美国明尼阿波利斯研发系统公司）。为了抑制SIRT3的表达，用Lipofectamine 2000（Invitrogen）将100 nM SIRT3小干扰RNA（siRNA）或干扰siRNA（GenePharma，Shanghai，China）转染细胞48小时，并立即用PBS或AGEs刺激。此外，从GeneChem（中国上海）购买含有SIRT3表达载体（Lenti-SIRT3）和侧翼序列控制载体（Lenti-vector）的慢病毒质粒，并按照制造商的说明导入人类NP细胞。westernblotting检测转染效果，继续培养3d，传代进行后续实验。

　　2.3. 人NP细胞活性和增殖的评价

　　使用细胞计数试剂盒-8（CCK-8；CK04，Dojindo，Japan）进行细胞活力评估，如前所述[30]。在用PBS或AGEs处理后，向每个孔中添加CCK-8溶液（10μl），并在37℃下进一步培养细胞4小时。使用分光光度计（BioTek，Winooski，VT，USA）在450 nm处测量孔中的吸光度。

　　5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（EdU）掺入法检测NP细胞增殖。按照制造商推荐的程序进行评估，最终通过荧光显微镜（日本东京奥林巴斯IX71）获得荧光图像。

　　2.4. 人NP细胞凋亡分析

　　如前所述，Annexin V-APC/7-AAD凋亡检测试剂盒（40309ES60；Yeasen biotech）用于凋亡分析[28]。标记后，所有样本应用FACSCalibur流式细胞仪（BD Biosciences，San Jose，CA，USA）分析。此外，根据制造商的说明，使用原位细胞死亡检测试剂盒（12156792910；美国印第安纳波利斯罗氏应用科学公司）通过5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（EdU）掺入、末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）染色法鉴定凋亡细胞。荧光图像最终由荧光显微镜（Olympus IX71）获得。

　　2.5. 人NP细胞活性氧（ROS）、线粒体膜电位（MMP）和线粒体通透性转换孔（mPTP）活性的测定

　　分别用2'，7'-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA，S0033；Beyotime，北京，中国）和MitoSOX（40778ES50；Yeasen biotech，上海，中国）染色法测定细胞内总活性氧和线粒体活性氧水平。它们都能被迅速氧化成高荧光化合物。根据制造商的说明对样品进行染色，并通过流式细胞仪（BD Biosciences）进行检测。此外，利用激光扫描显微镜（蔡司LSM780，德国）检测线粒体活性氧（ROS）和线粒体跟踪器（C1048，Beyotime）的共定位强度。

　　使用JC-1（C2006；Beyotime）检测试剂盒检测MMP，如前所述[30]，并通过FACSCalibur流式细胞仪（BD Biosciences）进行分析。红色（JC-1聚集体）与绿色（JC-1单体）的比值降低表明MMP丢失。mPTP检测试剂盒（GMS10095.1；Genmed，上海，中国）用于检测mPTP活性，其中钴离子的荧光猝灭随着mPTP活性的增加而增加。NP细胞染色和固定按照制造商的说明进行。接下来，使用荧光显微镜（Olympus IX71）对载玻片进行观察和成像。

　　2.6. 人NP细胞的Western印迹分析

　　使用相应的试剂盒（Beyotime）提取总蛋白、细胞质蛋白和线粒体蛋白。来自每个样品的蛋白质（40μg）在4–20%预制聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Rad）上电泳并转移到硝化纤维素膜（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）上。一级抗体从1:500-1:1000稀释。使用针对以下蛋白质的一级抗体：切割的半胱氨酸蛋白酶-3（9664）、GAPDH（5174）和SIRT3（2627S）（细胞信号技术；美国马萨诸塞州丹弗斯市）；细胞色素C（ab110325）、Bcl-2（ab32124）和Bax（ab32503）（英国剑桥州阿布坎市）；SOD2（sc-133134）、线粒体硫氧还蛋白2（TRX2，sc-137028），线粒体硫氧还蛋白还原酶2（TRXR2，sc166259）、过氧化氢酶（sc-271358）和VDAC1（sc-32063）（圣克鲁斯生物技术公司；美国德克萨斯州达拉斯）。

　　2.7. 人NP细胞SIRT3脱乙酰酶活性测定

　　按照制造商的方案，使用SIRT3荧光活性测定/药物发现试剂盒（BML-AK557-0001；Enzo Life Sciences，Plymouth Meeting，PA，USA）测定SIRT3的脱乙酰酶活性。简而言之，线粒体提取物（5μg）在37°C下与FLUOR DE LYS-SIRT2缓冲液孵育60分钟，然后在37°C下与FLUOR DE LYS?Developer II缓冲液孵育40分钟。使用微量滴定板荧光计测量荧光强度，激发波长为360 nm，发射波长为460 nm。从所有其他值中减去分析缓冲液的“空白”值。?

　　2.8. 动物模型的外科手术

　　Sprague-Dawley大鼠（3个月大）来自华中科技大学（武汉）实验动物中心。手术过程如前所述[14]。用2%（w/v）戊巴比妥（40mg/kg）麻醉大鼠后，通过尾骨触诊确定尾椎椎间盘（Co6/7、7/8和8/9）的位置，并通过试验放射线摄影证实。针（29g）穿过尾皮，平行于终板穿刺纤维环层。为了确保针头不会穿透太深，根据纤维环和NP的尺寸预先确定了针头的长度，这些尺寸在初步实验中测量，发现约为4 mm。为了评价AGEs对NP细胞存活和IVD退行性变的影响以及NMN在体内的治疗潜力，我们制备了三种椎间盘注射溶液，包括PBS、AGEs（200μg/ml）和AGEs（200μg/ml）与NMN（100μM）的混合物。每个节段注射2μl相关溶液，每根针在椎间盘中保持10s。所有动物允许自由、不受限制地负重和活动。每周注射一次，持续一个月。

　　2.9. 动物模型的磁共振成像与退行性变分级分析

　　术后1个月对靶静脉进行磁共振成像（MRI）。所有大鼠均用2%（w/v）戊巴比妥（40mg/kg）麻醉，放在检查床上伸直尾巴。然后，使用BioSpec MRI（Bruker，7.0t/20cm）在T2加权信号处进行成像。T2加权参数设置如下：快速自旋回波序列，回波时间2000ms，回波时间36ms；256（h）×256（v）矩阵；视野6.00/3.00cm；翻转角度180°。扫描范围包括6个IVD，包括3个靶段。根据Pfirrmann MRI分级系统[27]，利用MR图像分析IVD退行性变分级。简言之，I级：椎间盘均匀，呈明亮的高信号，椎间盘高度正常；II级：椎间盘不均匀，有或无水平条带，呈高信号；III级：椎间盘不均匀，呈中等灰度信号，椎间盘高度稍低；Ⅳ级：椎间盘不均匀，呈低信号灰色或黑色信号，椎间盘高度中度降低；Ⅴ级：椎间盘不均匀，呈低信号黑色信号，椎间盘间隙塌陷。然后处死大鼠，取椎间盘进行组织学和免疫组化分析。

　　2.10. 人NP组织和动物模型的组织学、免疫组织学和western印迹分析

　　对于westernblotting分析，将冷冻组织匀浆并用于提取总蛋白。下一步操作如上所述。为了进行免疫组化分析，组织石蜡块在4μm处切片，并按照前面所述进行处理[28]。切片在4℃下用针对AGEs（ab23722，Abcam）的一级抗体（稀释1:200）过夜探测，彻底清洗，并用适当的二级抗体（稀释1:200；Vector，Burlingame，CA，USA）在37℃下标记40分钟。以1例60岁创伤截肢患者肱动脉组织切片作为阳性对照。阴性对照包括用PBS溶液代替一抗处理的平行切片。使用6.0版的imageproplus软件采集图像并进行进一步分析。

　　大鼠椎间盘用PBS洗涤，缓冲甲醛（4%，ph7.4）固定12h，10%甲酸溶液脱钙，分级乙醇脱水，石蜡包埋。对于4μm的标本进行切片。为了进行组织学分析，对切片进行脱蜡、再水化和苏木精-伊红（HE）和藏红-O（SO）染色。对于免疫荧光染色，用抗SIRT3的一级抗体（10099-1-AP，1:50，Proteintech，China）和裂解的半胱天冬酶-3（1:200）如上所述处理切片。过夜后，用PBST彻底清洗切片，并用适当的二级抗体标记。TUNEL染色采用TUNEL凋亡检测试剂盒（C1088，Beyotime）。最后，将细胞核与0.1 g/ml 40,6-二氨基-2-苯基吲哚共染色5分钟，并用荧光显微镜（Olympus IX71）清洗和成像样品。

　　2.11. 统计分析

　　使用SPSS软件17.0版（IBM，芝加哥，IL，美国）对数据进行分析，并报告为至少三个独立实验的平均值±标准差。采用非参数线性回归分析临床样本中SIRT3水平、Pfirrmann分级和AGEs水平之间的相关性。采用Student t检验、单因素或双因素方差分析对体外实验组的数据进行比较。P<0.05的值被认为是具有统计学意义的差异。

　　3.1. AGEs处理可降低NP细胞的存活率和增殖率，促进细胞凋亡

　　AGEs可以增强蛋白质交联，从而改变细胞外基质的力学性质，并作为配体诱导病理生理反应（如炎症反应、衰老和自噬），这些反应在IVD组织中被部分观察到[24,31]。为了进一步研究AGEs对NP细胞活性的影响，我们首先分离了人NP细胞，并用流式细胞仪对其进行了鉴定。结果显示CD24（94.2%）和KRT18（96.7%）阳性表达（图S1）。然后将人类NP细胞与AGEs（100或200μg/ml）一起培养12、24或36小时，因为该剂量已被证明足以在软骨细胞、真皮成纤维细胞和晶状体上皮细胞中诱导生物事件[32–34]。CCK-8分析显示，AGEs处理后，NP细胞的存活率以时间和剂量依赖性的方式显著降低（图1A）。此外，另一种快速灵敏的DNA合成检测方法（EdU掺入法）被用于观察NP细胞增殖[35]。如图1B所示，AGEs处理组的DNA复制活性显著减弱，表明AGEs对人类NP细胞增殖的抑制作用。

　　据报道，过度凋亡在细胞活力丧失和IVD退化中起重要作用[5]。因此，确定了凋亡在观察到的生长抑制中的作用。annexin V-APC和7-氨基放线菌素D（7-AAD）染色的结果证实AGEs处理显著增加人类NP细胞的凋亡（图1C）。此外，DNA链断裂形成的增加（通过TUNEL染色检测）也表明AGEs处理的人类NP细胞中凋亡发生的增加（图1D）。Western blotting显示，AGEs处理后，人NP细胞中凋亡标记蛋白（切割的半胱天冬酶-3）的水平增加（图1E）。

　　3.2. 线粒体途径参与AGEs诱导人NP细胞凋亡

　　线粒体途径通过线粒体膜通透性和随后促凋亡蛋白的释放内在地调节细胞凋亡事件[36]。首先，我们检测了线粒体内膜通透性，这种通透性可以通过延长mPTP开放而增加。荧光显微镜证实，与PBS处理的人NP细胞相比，AGEs处理的人NP细胞的线粒体中保留的钙黄绿素较少（图2A），表明mPTP开放时间延长。此外，跨线粒体内膜的电化学梯度形成了线粒体膜电位（MMP）的基础，随着mPTP开放时间的延长和线粒体内膜通透性的增强，MMP电位降低。JC-1染色和流式细胞仪分析显示，AGEs处理增强了人NP细胞中MMP的丢失，表现为红绿比的降低（图2B），表明MMP的丢失。其次，我们检测了线粒体中Bcl-2与Bax蛋白的比值，其中的相互作用高度调节线粒体外膜的通透性。western印迹结果显示，AGEs处理显著降低线粒体中Bcl-2与Bax蛋白的比率（图2C）。最后，我们检测了促凋亡蛋白（细胞色素c，Cyt-c）的细胞定位，其释放（从线粒体到细胞质）对caspase激活的凋亡事件至关重要。Western印迹分析表明，AGEs处理显著降低线粒体与细胞质Cyt-c的比率（图2D）。这些数据表明AGEs影响线粒体凋亡途径，参与体外诱导人NP细胞凋亡。

　　3.3. 线粒体抗氧化剂预处理减轻AGEs诱导的人NP细胞氧化应激水平，减少细胞凋亡

　　先前的研究表明，ROS的产生在调节促凋亡Bax蛋白的线粒体定位和延长mPTP激活中起着至关重要的作用[37,38]。用DCFH-DA试剂盒检测ROS水平，流式细胞仪检测ROS水平。我们观察到AGEs处理后细胞间ROS水平的时间依赖性增加，如荧光强度增加所示（图3A）。培养36小时后，与用PBS处理的对照细胞相比，用AGEs处理的NP细胞显示出显著增加的ROS水平（图3A）。为了进一步明确ROS的来源，我们用抗氧化剂MitoTEMPO或SKQ1特异性地清除线粒体ROS。如图所示，经MitoTEMPO或SKQ1预处理后，由AGEs诱导的ROS水平增加得到改善（图3B），这表明线粒体ROS对经AGEs处理的人类NP细胞中的氧化应激有部分贡献。

　　为了研究线粒体活性氧是否参与老年性线粒体功能障碍和人类NP细胞凋亡，我们用MitoTEMPO或SKQ1预处理人NP细胞2小时，然后用AGEs处理36小时。荧光显微镜和流式细胞术结果表明，MitoTEMPO或SKQ1预处理可以减轻AGEs诱导的mPTP活化延长和MMP丢失（图3C和D），以及Bcl-2:BAX比值降低（图3E）。此外，通过western印迹分析检测到线粒体Cyt-c易位减弱（图3F）。最后，annexin VAPC/7-AAD和TUNEL染色证实MitoTEMPO或SKQ1预处理减轻了AGEs诱导的人类NP细胞凋亡（图4A和B）。总之，这些发现表明线粒体氧化还原障碍和氧化应激参与了AGEs诱导的线粒体功能障碍和人NP细胞凋亡。

　　3.4. SIRT3蛋白水平与AGEs累积及IVD退变程度呈负相关

　　稳定的SIRT3功能对于维持线粒体氧化还原稳态和功能非常重要，在各种氧化应激相关疾病中，这些过程中的缺陷或功能障碍已被发现[18,39]。为了研究SIRT3在IVD退行性变中的作用，我们图1。AGEs处理抑制细胞活力和增殖，促进细胞凋亡。用AGEs（100～200μg/ml）或PBS处理人NP细胞0～36h。（A）用CCK-8吸光度法检测细胞活力。*p<0.05与PBS（36h）比较。#p<0.05与0小时比较。**p<0.05与年龄比较（36小时100μg/ml）。（B） 荧光显微镜下EdU染色检测细胞增殖，并对阳性细胞进行定量。*p<0.05与PBS（36h）比较。（C，D）用annexinv-APC/7-AAD和TUNEL染色检测细胞凋亡，流式细胞仪和荧光显微镜分析。（C） annexinv-APC/7-AAD染色的细胞凋亡率及典型散点图的定量分析。测量活细胞（第三象限）、凋亡细胞（第一象限和第四象限）和坏死细胞（第二象限）的比例进行分析。*p<0.05与PBS（36h）比较。#p<0.05与0小时比较。**p<0.05与年龄比较（36小时100μg/ml）。（D） TUNEL染色定量分析TUNEL阳性细胞及典型荧光图像。*p<0.05与PBS（36h）比较。（E） 具有代表性的Western印迹分析和半胱天冬酶3裂解水平的定量分析。*p<0.05与PBS（36h）比较。#p<0.05与0小时标度比较

　　棒材：B，60μm；D，60μm。

　　根据Pfirrmann MRIgrade系统[27]，首先评估了不同程度退化的人类NP组织标本中的SIRT3水平（图5A）。第二次进行SIRT3蛋白水平与IVD退行性变等级之间的非参数线性回归分析，发现显著负相关（图5C）。如上所示，AGEs在很大程度上促进了人类NP细胞氧化应激和凋亡的微环境。以前，有报道称AGEs显示退行性IVD水平升高[40]。在本研究中，我们进一步分析了年龄水平与IVD退行性变等级之间的关系。正如预期的那样，一个显著的积极因素图2。AGEs通过延长mPTP的激活和Bax在线粒体的易位，诱导线粒体功能障碍和细胞色素c的释放。如图1所述处理人类NP细胞。（A） 用钙黄绿素染色的代表性荧光图像和用Image-Pro Plus 6.0定量分析mPTP的荧光强度。绿色荧光显示钙黄绿素信号。细胞核用DAPI染色。*p<0.05与PBS（36h）比较。（B） 用JC-1染色定量分析MMP红荧光（x轴）向绿荧光（y轴）的偏移及流式细胞仪的典型散点图。*p<0.05与PBS（36h）比较。#p<0.05与0h比较。（C）线粒体提取物中Bcl-2/Bax蛋白比值的代表性western印迹分析和定量。*p<0.05与PBS（36h）比较。#p<0.05与0h比较。（D）线粒体细胞色素c（Cyt-c）水平的代表性westernblotting分析和定量

　　以及细胞质提取物。*与PBS相比p<0.05。比例尺：A，60μm。

　　相关分析（图5B和D），阳性对照和阴性对照如图S2所示。此外，在SIRT3和AGEs水平之间观察到显著的相关性（图5E）。这些结果表明AGEs相关的IVD退行性变可能与SIRT3功能受损有关。

　　3.5. SIRT3对AGEs诱导的人NP细胞氧化应激和凋亡的保护作用

　　为了确定AGEs沉积是否会影响IVD退变过程中SIRT3的功能，我们在体外用AGEs或PBS处理人NP细胞36小时，并检测SIRT3蛋白水平和脱乙酰酶活性。Western印迹结果显示AGEs诱导的SIRT3蛋白水平的剂量依赖性降低（图6A）。同样，在AGEs处理后，在人类NP细胞中检测到SIRT3脱乙酰酶活性的抑制（图6B）。我们进一步研究了经AGEs处理的人NP细胞的线粒体抗氧化网络，因为它对维持ROS的生理水平很重要。此外，SIRT3对于维持线粒体抗氧化网络至关重要[18,39]。如图所示，线粒体抗氧化网络的成员，包括SOD2、过氧化氢酶、TRX2和TRXR2，通过AGEs处理以剂量依赖性的方式被显著抑制（图6C）。为了进一步证实SIRT3在调节线粒体氧化还原稳态和凋亡中的作用，我们使用了特异性siRNA图3。通过MitoTEMPO和SKQ1减轻氧化应激抑制线粒体凋亡途径。（A） 用AGEs（100～200μg/ml）或PBS处理人NP细胞0～36h，用DCFH-DA染色，流式细胞仪和定量分析的代表性峰图显示。*p<0.05与PBS（36h）比较。#p<0.05与0h比较。（B）丝裂霉素（5μM）或SKQ1（20nm）预处理人NP细胞2h，再与AGEs（200μg/ml）作用36h，进行流式细胞术和定量分析。*与PBS相比p<0.05。#p<0.05与年龄（200μg/ml）比较。（C–D）通过钙黄绿素和JC-1染色观察，MitoTEMPO或SKQ1预处理显著降低AGEs诱导的人NP细胞mPTP活化（C）和抑制MMP丢失（D）。*与PBS相比p<0.05。#p<0.05与年龄（200μg/ml）比较。（E） 线粒体提取物中Bcl-2/Bax蛋白比值的代表性western印迹分析和定量分析。*与PBS相比p<0.05。#p<0.05与年龄（200μg/ml）比较。（F） 用上述MitoTEMPO或SKQ1预处理对人NP细胞线粒体和细胞质提取物中Cyt-c水平进行代表性western印迹分析和定量。*p<0.05

　　对PBS。#p<0.05与年龄（200μg/ml）比较。比例尺：C，60μm。

　　（siSIRT3）在正常和AGEs处理的人NP细胞中敲低SIRT3表达或SIRT3慢病毒质粒（LETI-SIRT3）过度表达SIRT3。westernblotting结果证实了敲除效率（图6D），同时也检测到SIRT3脱乙酰酶活性的相应降低（图6E）。SIRT3基因敲除不仅部分模拟了正常条件下AGEs对人类NP细胞线粒体抗氧化网络的影响，而且加重了AGEs处理的人类NP细胞的这种影响（图6H）。此外，LESTI-SIRT3感染显著减轻AGEs对人类NP细胞中SIRT3蛋白水平和脱乙酰酶活性的抑制作用（图6F和G），以及对线粒体抗氧化网络的抑制作用（图6I）。这些结果显示了SIRT3在细胞凋亡中的关键作用图4。MitoTEMPO或SKQ1预处理可挽救AGEs诱导的人NP细胞凋亡。流式细胞术和annexinv-APC/7-AAD荧光显微镜分析（A）和TUNEL染色（B）显示MitoTEMPO或SKQ1预处理可降低细胞凋亡率。*p<0.05与

　　公共广播公司。#p<0.05与年龄（200μg/ml）比较。比例尺：B，60μm。

　　维持线粒体抗氧化网络，提示其可能参与AGEs诱导的人NP细胞氧化应激和凋亡。

　　因此，我们通过MitoSOX（红色）和MitoTracker（绿色）双重染色检测线粒体ROS水平。荧光结果显示，在AGEs处理或siSIRT3转染的人NP细胞中观察到更多的MitoSOX和MitoTracker共染色，而在慢SIRT3感染的人NP细胞中观察到较少的共染色（图6J和图S3A）。此外，流式细胞术分析表明，siSIRT3敲除SIRT3可增加正常或AGEs处理的NP细胞的线粒体ROS水平和细胞凋亡（图S3B和图6K），而静子SIRT3过度表达SIRT3图5。SIRT3蛋白水平降低与AGEs累积和IVD退行性变呈负相关。14例不同退行性变程度的NP组织标本分别用westernblotting和免疫组化方法分析SIRT3和AGEs水平。（A） 具有代表性的蛋白质印迹分析和SIRT3水平的定量（下降：具有不同退行性变等级的代表性MR图像）。（B） 用AGEs抗体标记免疫组化图像，用imageproplus6.0平均光密度定量。SIRT3与年龄、Pfirrmann分级的相关性分析

　　连续进行。比例尺：B，100μm。

　　改善AGEs诱导的线粒体氧化应激和细胞凋亡（图S3C和图6L）。这些结果表明SIRT3功能的抑制在AGEs诱导的线粒体氧化应激和NP细胞凋亡中起重要作用，SIRT3功能的恢复可以减轻这些过程。

　　3.6. 给药NMN可恢复SIRT3功能，降低人类免疫力

　　AMPK/PGC-1α途径诱导NP细胞凋亡

　　基于SIRT3基因操作的保护结果，我们进一步研究了药物给药的治疗潜力。先前的研究报道AMPK/PGC-1α途径可以限制骨关节炎进展中的氧化应激[41]，PGC-1α是SIRT3表达的重要转录辅激活因子[19]。在此，我们研究了它们在AGEs诱导人NP细胞凋亡中的相互作用。首先，western blotting结果显示AGEs通过降低AMPK和PGC-1α的磷酸化水平以及SIRT3蛋白水平（图7A）和AMPK激活剂A-769662可显著抑制AMPK/PGC-1α途径（图7B）。此外，受体RAGE可归因于年龄的大多数细胞事件。然而，RAGE中和抗体并不妨碍AGEs诱导的p-AMPK、p-PGC-1α和SIRT3的下调（图7B）。此外，据报道，NMN可作为NAD+的前体并恢复SIRT3功能[21,42]。重要的是，NMN的管理已经经历了一些疾病的临床试验。因此，我们结合AMPK抑制剂（化合物C）研究了它在AGEs处理的人NP细胞中的作用并探讨了其作用机制。如图所示，NMN给药可挽救AGEs诱导的对p-AMPK、p-PGC-1α和SIRT3水平的抑制，而化合物C抑制这种保护作用（图7B）。类似地，给予NMN和A769662的AMPK/PGC-1α途径激活剂均上调AGEs处理的人类NP细胞中线粒体抗氧化成员的水平（图7C）。

　　为了更明确地证实SIRT3在NMN和A-769662诱导的保护作用中的重要作用，我们在NMN和A-769662给药前进行SIRT3敲除。如图7D所示，SIRT3敲除可显著抑制NMN和A-769662对SOD2、过氧化氢酶、TRX2和TRXR2的上调。最后，荧光显微镜和流式细胞术结果表明，NMN和A-769662给药减轻了AGEs诱导的线粒体ROS水平和细胞凋亡，这被SIRT3敲除阻断（图7E和F，图S4）。这些结果表明，AMPK/PGC-1α通路的抑制参与AGEs诱导的SIRT3下调，NMN补充可通过AMPK/PGC-1α通路恢复SIRT3功能，减少人NP细胞凋亡。

　　3.7. NMN对大鼠体内IVD退变的改善作用

　　为了进一步研究NMN对AGEs诱导的IVD退行性变的治疗作用，我们用Sprague-Dawley大鼠建立了IVD退行性变动物模型。通过磁共振成像（MRI，7.0T）检查和Pfirrmann MRI评分确定退变程度。一个月后，MRI检查证实AGEs注射组的IVD强度不均匀，T2加权信号低于PBS注射组（图8A），与之前的观察结果相似[43]。此外，注射AGEs的IVD组正常椎间盘高度、髓核和纤维环边界也消失。同样，在AGEs注射组中，也可以看到Pfirrmann MRI分级系统评估的退行性变分级增加（图8E）。另外，对上述动物模型的IVD标本进行组织病理学分析和评分。如图8B和C所示，HE染色显示，椭圆形NP在中矢状切面上占据了大量椎间盘高度（>50%），并且在中矢状切面上证实了高糖胺聚糖含量图6。SIRT3功能受损与AGEs诱导的人NP细胞氧化应激和凋亡有关，SIRT3过表达可减轻这些过程。（A，B）用AGEs（100–200μg/ml）或PBS处理人NP细胞36小时。（A）代表性的Western印迹分析和SIRT3蛋白水平的定量。（B） 使用线粒体部分分析SIRT3脱乙酰酶活性，如材料和方法中所述。*与PBS相比p<0.05。#p<0.05与年龄（36小时100μg/ml）比较。（C） 具有代表性的蛋白质印迹分析和线粒体抗氧化剂水平的定量分析，包括SOD2、过氧化氢酶、TRX2和TRXR2。*与PBS相比p<0.05。#p<0.05与年龄（36小时100μg/ml）比较。（D） 具有代表性的蛋白质印迹分析和SIRT3蛋白水平的定量。*与PBS+siCON相比p<0.05。#p<0.05与AGEs+siCON比较。（E） 利用线粒体片段分析SIRT3脱乙酰酶活性。*与PBS+siCON相比p<0.05。#p<0.05与AGEs+siCON比较。（F） 具有代表性的蛋白质印迹分析和SIRT3蛋白水平的定量。*p<0.05与PBS+Lenti载体（空白载体）比较。#p<0.05与AGEs+Lenti向量比较。（G） 利用线粒体片段分析SIRT3脱乙酰酶活性。*p<0.05与PBS+Lenti载体比较。#p<0.05与AGEs+Lenti向量比较。（H） 在AGEs治疗前（200μg/ml，36小时）进行干扰siRNA（siCON）或SIRT3 siRNA（sisiirt3）转染。Western印迹法检测SOD2、过氧化氢酶、TRX2和TRXR2蛋白水平。*与PBS+siCON相比p<0.05。#p<0.05与AGEs+siCON比较。（一） 在AGEs治疗前（200μg/ml，36小时）进行慢载体或慢SIRT3感染。Western印迹法检测SOD2、过氧化氢酶、TRX2和TRXR2蛋白水平。*p<0.05与PBS+Lenti载体比较。#p<0.05与AGEs+Lenti向量比较。（J） 有代表性的荧光图像有丝裂素（红色）和丝裂追踪（绿色）双重染色。细胞核用DAPI染色。流式细胞仪检测Annexin V-APC/7-AAD染色检测细胞凋亡。（K） *p<0.05与PBS+siCON相比。#p<0.05与AGEs+siCON比较。（左）

　　*p<0.05与PBS+Lenti载体比较。#p<0.05与AGEs+Lenti向量比较。

　　PBS注射组NP区呈强SO染色。NP组织中可见大量星状细胞，纤维环层结构良好。在AGEs注射组中，椎间盘高度塌陷，NP区细胞明显丢失，组织纤维化增加（图8B）。髓核和纤维环的边界消失，整个纤维环层被破坏（图8B）。相反，与对照组相比，额外给予NMN可减少IVD退行性改变图7。NMN通过AMPK/PGC-1α途径恢复AGEs诱导的人NP细胞SIRT3功能，减轻氧化应激和凋亡。（A） 用AGEs（100–200μg/ml）或PBS处理人NP细胞36小时。AMPK、p-AMPK、PGC-1α、p-PGC-1α蛋白水平的代表性Western印迹分析和定量。*与PBS相比p<0.05。（B） 在存在或不存在A-769662（50μM）、RAGE抗体（10μg/ml）、NMN（100μM）或化合物C（50μM）的情况下，用AGEs（200μg/ml）刺激的NP细胞中AMPK、p-AMPK、PGC-1α、p-PGC-1α水平的Western印迹分析。蛋白质水平的定量：*p<0.05 vs AGEs（200μg/ml）。ns与AGEs（200μg/ml）。#p<0.05与AGEs+NMN比较。（C） 在存在或不存在A-769662（50μM）或NMN（100μM）的情况下，用AGEs（200μg/ml）刺激的NP细胞中SOD2、过氧化氢酶、TRX2和TRXR2水平的Western印迹分析。蛋白质水平的定量：*与年龄相比p<0.05。（D） 在存在或不存在A-769662（50μM）或NMN（100μM）的情况下，用AGEs（200μg/ml）刺激的siRNA转染NP细胞中SOD2、过氧化氢酶、TRX2和TRXR2水平的Western印迹分析。*p<0.05与AGEs+NMN+siCON比较。#p<0.05与AGEs+A-769662+siCON比较。（五）在A-769662（50μM）或NMN（100μM）存在或不存在的情况下，用AGEs（200μg/ml）刺激siRNA转染的NP细胞，用MitoSOX（红色）和MitoTracker（绿色）双重染色的代表性荧光图像。（F） 流式细胞仪检测annexinv-APC/7-AAD染色检测细胞凋亡。*p<0.05与年龄（200μg/ml）比较。#p<0.05与AGEs+NMN+siCON比较。##p<0.05与AGEs+A-769662+siCON比较。图7。NMN通过AMPK/PGC-1α途径恢复AGEs诱导的人NP细胞SIRT3功能，减轻氧化应激和凋亡。（A） 用AGEs（100–200μg/ml）或PBS处理人NP细胞36小时。AMPK、p-AMPK、PGC-1α、p-PGC-1α蛋白水平的代表性Western印迹分析和定量。*与PBS相比p<0.05。（B） 在存在或不存在A-769662（50μM）、RAGE抗体（10μg/ml）、NMN（100μM）或化合物C（50μM）的情况下，用AGEs（200μg/ml）刺激的NP细胞中AMPK、p-AMPK、PGC-1α、p-PGC-1α水平的Western印迹分析。蛋白质水平的定量：*p<0.05 vs AGEs（200μg/ml）。ns与AGEs（200μg/ml）。#p<0.05与AGEs+NMN比较。（C） 在存在或不存在A-769662（50μM）或NMN（100μM）的情况下，用AGEs（200μg/ml）刺激的NP细胞中SOD2、过氧化氢酶、TRX2和TRXR2水平的Western印迹分析。蛋白质水平的定量：*与年龄相比p<0.05。（D） 在存在或不存在A-769662（50μM）或NMN（100μM）的情况下，用AGEs（200μg/ml）刺激的siRNA转染NP细胞中SOD2、过氧化氢酶、TRX2和TRXR2水平的Western印迹分析。*p<0.05与AGEs+NMN+siCON比较。#p<0.05与AGEs+A-769662+siCON比较。（五）在A-769662（50μM）或NMN（100μM）存在或不存在的情况下，用AGEs（200μg/ml）刺激siRNA转染的NP细胞，用MitoSOX（红色）和MitoTracker（绿色）双重染色的代表性荧光图像。（F） 流式细胞仪检测annexinv-APC/7-AAD染色检测细胞凋亡。*p<0.05与年龄（200μg/ml）比较。#p<0.05与AGEs+NMN+siCON比较。##p<0.05与AGEs+A-769662+siCON比较。图7。NMN通过AMPK/PGC-1α途径恢复AGEs诱导的人NP细胞SIRT3功能，减轻氧化应激和凋亡。（A） 用AGEs（100–200μg/ml）或PBS处理人NP细胞36小时。AMPK、p-AMPK、PGC-1α、p-PGC-1α蛋白水平的代表性Western印迹分析和定量。*与PBS相比p<0.05。（B） 在存在或不存在A-769662（50μM）、RAGE抗体（10μg/ml）、NMN（100μM）或化合物C（50μM）的情况下，用AGEs（200μg/ml）刺激的NP细胞中AMPK、p-AMPK、PGC-1α、p-PGC-1α水平的Western印迹分析。蛋白质水平的定量：*p<0.05 vs AGEs（200μg/ml）。ns与AGEs（200μg/ml）。#p<0.05与AGEs+NMN比较。（C） 在存在或不存在A-769662（50μM）或NMN（100μM）的情况下，用AGEs（200μg/ml）刺激的NP细胞中SOD2、过氧化氢酶、TRX2和TRXR2水平的Western印迹分析。蛋白质水平的定量：*与年龄相比p<0.05。（D） 在存在或不存在A-769662（50μM）或NMN（100μM）的情况下，用AGEs（200μg/ml）刺激的siRNA转染NP细胞中SOD2、过氧化氢酶、TRX2和TRXR2水平的Western印迹分析。*p<0.05与AGEs+NMN+siCON比较。#p<0.05与AGEs+A-769662+siCON比较。（五）在A-769662（50μM）或NMN（100μM）存在或不存在的情况下，用AGEs（200μg/ml）刺激siRNA转染的NP细胞，用MitoSOX（红色）和MitoTracker（绿色）双重染色的代表性荧光图像。（F） 流式细胞仪检测annexinv-APC/7-AAD染色检测细胞凋亡。*p<0.05与年龄（200μg/ml）比较。#p<0.05与AGEs+NMN+siCON比较。##p<0.05与AGEs+A-769662+siCON比较。

　　AGEs注射组虽然仍存在一些退行性表型。如图所示，仍有一些疏松的NP组织（>25%），其中有星形细胞，SO染色检测到糖胺聚糖含量（图8C）。髓核和髓环的边界

　　纤维环仍清晰，椎间盘高度适中，纤维环层内半排列紊乱。总的来说，我们使用前面描述的分级标准来评估组织病理学评分[44]。统计结果也证实了NMN图8。NMN给药可改善体内IVD退变。大鼠尾盘注射PBS、AGEs（200μg/ml）、AGEs（200μg/ml）和NMN（100μM）混合液，维持1个月。（A） 在T2加权信号下用MRI检查大鼠尾部，并显示具有代表性的MRI图像，其中白色正方形标记了操作水平。（B，C）HE和SO染色观察整个尾盘。（D） 采用TUNEL染色和荧光显微镜观察大鼠尾盘细胞凋亡。MRI图像按Pfirrmann分级系统（E）定量分析退行性变程度，HE和SO染色图像按组织学分级（F）定量分析退行性变程度，TUNEL荧光图像按阳性细胞率（G）定量分析退行性变程度。*与PBS相比p<0.05。#与年龄相比p<0.05。

　　给药可以改善AGEs诱导的IVD退化（图8F）。

　　此外，如上所述，AGEs可通过诱导NP细胞凋亡促进IVD退变。我们进一步对大鼠IVD标本进行TUNEL染色，并测定相应的阳性细胞比例。如图所示，与PBS注射相比，AGEs注射增加了TUNEL染色的阳性率，NMN给药减弱了阳性率（图8D和G）。同时检测SIRT3和切割的caspase-3水平。正如预期的那样，western印迹和免疫荧光染色均显示AGEs注射诱导SIRT3水平下调和切割的caspase-3上调，而NMN给药可减轻这些反应（图S5）。综上所述，我们的体内研究进一步证实NMN给药可以恢复SIRT3功能，改善AGEs诱导的NP细胞凋亡和IVD退行性变。

　　各种危险因素已被证明与细胞凋亡和合成代谢和分解代谢活动的不平衡有关，这些因素驱动了IVD退行性变的发展[45,46]。尽管已经做出了许多努力来实现IVD退行性变和下背痛疾病的早期诊断和预防[47–49]，但目前用于治疗IVD退行性变相关疾病的治疗方案仅用于缓解症状和无效的IVD功能恢复，并可导致脊柱残疾。在目前的研究中，我们确定AGEs是与IVD退行性变相关的危险分子，这种退行性变产生氧化应激微环境，促进线粒体功能障碍和NP细胞活力的丧失。进一步研究表明，SIRT3脱乙酰化活性的降低在NP细胞氧化应激中起着重要作用。

　　蛋白质的广泛翻译后修饰可影响蛋白质折叠并在蛋白多糖-胶原网络中产生微观解剖变化，这是慢性退行性和代谢性疾病的标志，包括骨关节炎、骨质疏松症和阿尔茨海默病[50–52]。一些研究表明，翻译后修饰不仅可以破坏组织的力学性能[53]，还可以作为损伤相关的分子模式，诱导炎症反应和细胞死亡[54,55]。AGEs是蛋白质翻译后糖基化的主要产物。以往的研究表明，随着年龄的增加和IVD的退化，AGEs在NP细胞中显著沉积，这可能增强炎症反应，破坏合成代谢和分解代谢之间的平衡[24,31,56]。在本研究中，我们进一步证明AGEs治疗显著抑制NP细胞的存活和增殖，在IVD退变中起重要作用。此外，来自我们的体外和体内研究的数据证实凋亡参与了这个过程。

　　线粒体可以通过参与几个关键事件内在地调节细胞凋亡，包括释放促凋亡分子，如Cyt-c、Diablo和HtrA2，伴随着电子传递链的破坏和MMP的丢失[57,58]。尽管Bax-Bak寡聚和向线粒体移位的观察结果表明，Bcl-2家族蛋白是最具特征性的调节因子，直接调节线粒体外膜通透性和Cyt-c的释放。其他机制，如mPTP依赖和丝氨酸蛋白酶（s）依赖过程，最近也得到了承认[37,59,60]。然而，其机制和作用方式是复杂的和细胞类型特异性的。众所周知，Bax–Bak寡聚体介导诱导NP细胞凋亡的各种危险因素的作用[11,14]。此外，考虑到以前发现AGEs可诱导mPTP活化延长[24]，我们进一步研究了线粒体Cyt-c的释放以及Bcl-2:Bax比率和mPTP活化的变化，这表明它们可能通过联合机制诱导人类NP细胞凋亡。

　　线粒体呼吸链的复合物I和III是细胞内活性氧的主要产生位点，是多种细胞过程的重要次级信使[61]。IVD退行性变过程中ROS生成增加，导致NP细胞凋亡和MMP丢失[11,62]。此外，先前的研究也表明，过量的活性氧产生和氧化应激是导致mPTP-和Bax-Bak依赖的线粒体功能障碍和细胞死亡的原因[37,38,63]，尽管该途径是细胞类型特异性的[64]。MitoTEMPO和SKQ1以前被描述为一种针对抗氧化剂的线粒体，能够有效缓解线粒体ROS引起的氧化应激[37,65]。因此，在MitoTEMPO或SKQ1预处理后，研究了ROS在AGEs诱导的人NP细胞mPTP活化延长和Bax-Bak寡聚化中的作用。结果表明，MitoTEMPO或SKQ1预处理可显著降低NP细胞ROS水平和线粒体功能的变化，同时降低mPTP活性、Bax水平和细胞凋亡。这些结果表明，ROS介导的内源性线粒体途径参与AGEs诱导人NP细胞凋亡。此外，RAGE首次被确定为AGEs的受体，并介导了大多数细胞内信号转导，包括人类NP细胞的炎症反应[24]。先前的研究报道，RAGE可介导caspase-8依赖的外源性凋亡途径，以响应AGEs刺激[33]，并且外源性和内源性途径之间的串扰可能是某些细胞类型中凋亡事件的关键[66]。因此，AGEs诱导人NP细胞死亡可能存在着更为详细的内源性和外源性凋亡途径及其相互作用机制，值得进一步研究。

　　SIRT3与多种氧化应激相关疾病有关，其中缺乏或功能损害对线粒体功能障碍和疾病进展至关重要[19,20,67]。考虑到氧化应激和线粒体功能障碍在NP细胞凋亡中的重要作用及机制尚不清楚，我们进一步研究了SIRT3在人类NP组织中的功能及其与AGEs诱导的氧化应激和IVD退行性变的关系。SIRT3蛋白水平与IVD退行性变分级及AGEs沉积呈负相关。此外，体外实验也证实了在AGEs刺激的人NP细胞中SIRT3功能的破坏。在此基础上，我们首次尝试对线粒体SIRT3功能进行基因调控，以阐明其在AGEs诱导人NP细胞凋亡中的作用。最初，SIRT3特异性siRNA被用于抑制正常和AGEs诱导的人类NP细胞中SIRT3的表达，从而导致氧化应激和凋亡事件的加重。此外，静子-SIRT3过度表达SIRT3可改善AGEs诱导的线粒体ROS水平和细胞凋亡。这些结果表明，通过基因操作调节SIRT3功能可能对AGEs相关的IVD退行性变具有治疗潜力，而基因治疗伴随着癌症发展和免疫反应的内在潜在风险[68]。因此，我们进一步探讨了药物干预。NMN作为NAD+的前体，据报道可恢复SIRT成员[21–23]，包括SIRT3[21,42]。在β细胞中，用NMN补充NAD+的恢复减弱了促炎细胞因子对SIRT3表达的抑制[21]。同样，NMN给药也恢复了昼夜节律突变小鼠中SIRT3的脱乙酰化活性[42]。更重要的是，NMN的管理已经经历了一些疾病的临床试验。在本研究中，我们探讨了NMN在IVD退行性变中的潜在应用，结果表明NMN对AGEs诱导的NP细胞氧化应激和凋亡具有保护作用，其中SIRT3功能的恢复参与其中。

　　SIRT3在AGEs诱导的NP细胞凋亡和IVD退行性变中的生物学相关性也被体外研究结果所强调，这些研究结果显示了SIRT3在维持抗氧化网络中的作用。ROS是伴随着电子转移链的电子泄漏而产生的副产物，在正常生理条件下，ROS的水平通常较低，并被细胞内和线粒体内的清除系统所控制。以前的报道表明，线粒体抗氧化网络的损伤发生在许多与氧化应激相关的疾病中，这可能被强大的SIRT3功能逆转[18,39,69]。在本研究中，我们观察到恢复SIRT3功能可以挽救AEGs抑制的线粒体抗氧化网络，这也参与了NMN的保护作用。

　　此外，我们证明了SIRT3功能和AMPK-PGC-1α通路在AGEs刺激下调节线粒体抗氧化网络之间的密切关系（图9）。已有研究表明，AMPK激活可促进PGC-1α与雌激素相关受体α的相互作用，而雌激素相关受体α是SIRT3表达的关键转录因子。同样，我们目前的研究观察到AGEs治疗抑制了AMPK-PGC-1α通路。进一步利用药理作用，本研究首次表明A-769662激活AMPK-PGC-1α可以改善AGEs对SIRT3和线粒体抗氧化网络的抑制作用，而RAGE对这一过程没有影响。此外，化合物C的抑制作用证实AMPK-PGC-1α通路也参与了NMN的保护作用。这些结果表明AMPK-PGC-1α参与了对SIRT3和线粒体抗氧化网络的AGE抑制和NMN保护作用。以前的研究报道AMPK/PGC-1α通路可以限制骨关节炎进展过程中的氧化应激。然而，A-769662和NMN是否通过靶向SIRT3在这个过程中起作用尚不清楚。我们利用SIRT3基因敲除的结果表明SIRT3在AGEs诱导的人NP细胞凋亡中对AMPK/PGC-1α活化的保护作用是必不可少的。

　　在本研究中，我们还建立了一个简单的IVD退变模型，以进一步评价AGEs对NP细胞存活的影响

　　

　　图9。SIRT3和AMPK-PGC-1α介导AGEs诱导和NMN对线粒体氧化应激和NP细胞凋亡的保护作用的信号通路的示意模型。

　　以及IVD退行性变和NMN在体内的治疗潜力。椎间盘局部注射用于诱导AGEs沉积微环境和给予NMN治疗，这也应用于其他疾病模型[70,71]。结果表明，外源性NMN可改善AGEs诱导的NP细胞凋亡和IVD退变，并可恢复SIRT3水平。同时，我们不能忽视这种动物模型的局限性，即局部注射到鼠尾椎间盘，尽管它被广泛使用[14,72]。大鼠IVDs的生物力学特性与人不同。更多使用猴子、山羊或狗的研究可能提供进一步的见解。此外，AGEs注入模型可以模拟其作为生物活性分子的功能，但对AGEs沉积改变的力学微环境的模拟能力较差。

　　本研究的另一个局限性是，使用NMN作为药物干预来调节SIRT3功能没有特异性。尽管我们目前的研究显示SIRT3对AGEs诱导的NP细胞凋亡和IVD退行性变有保护作用，但NMN靶向的分子更多[21–23]，它们与SIRT3的潜在相互作用可能参与了这一过程，需要在未来进行更多的机制研究。

　　目前的研究首次证明了SIRT3在IVD退行性变中的保护作用。先前的数据显示，衰老是促进SIRT3下调和骨关节炎进展的一个危险因素[20]。进一步阐明AGEs是参与IVD退行性变的危险分子，参与抑制SIRT3功能，诱导NP细胞凋亡和IVD退行性变，这可能是线粒体氧化还原障碍和氧化应激所致。此外，NMN通过恢复SIRT3功能和线粒体抗氧化网络，减轻AGE诱导的氧化应激和NP细胞凋亡。因此，我们推测SIRT3在NP细胞中的功能可能成为AGEs相关IVD退变的一个新的有效治疗靶点。

　　本研究得到了国家自然科学基金（81772401u1603121）和湖北省自然科学基金（WJ2017Z016）的资助。