移除未分化的万能性干细胞的方法与流程

　　

　　相关申请

　　本申请是依据35u.s.c.§119，主张于2017年6月7日申请的美国暂时专利申请号62/516,437的权益，其揭示内容在此并入本申请以作为参考数据。

　　本发明是有关一种移除未分化的万能性干细胞的方法。具体而言，本发明是有关一种利用强心苷类(cgs)移除致癌的未分化万能性干细胞的方法。本发明亦有关一种制备分化细胞的方法，其中未分化的万能性干细胞予以移除，以及有关一种利用此类分化细胞进行细胞疗法的方法。

　　背景技术：

　　人类胚胎干细胞(hescs)与诱导性万能干细胞(ipscs)为具有独特的自我更新(几乎无限复制的能力)与万能性(除了胎盘细胞以外，能分化成人体所有细胞类型)性质的人类万能性干细胞(hpscs)。这些能力使得hpscs有望用于再生疗法1。然而，在将hpscs应用于细胞疗法之前，仍有实质性的挑战等待克服。hpscs的一个重要安全问题在于其致肿瘤风险，是因为这些细胞在异位点(ectopicsites)进行体内注射后可形成畸胎瘤2,3。存在于数百万分化细胞中的数千个未分化的hpscs足以在小鼠模型中诱导畸胎瘤4。因此，在以hpsc衍生细胞进行临床应用之前，移除所有或大多数具有畸胎瘤可能性的残留未分化hpscs至关重要。

　　有数种策略可选择性地移除hpscs。这些方法包括使用细胞毒性抗体5,6、特异性抗体细胞分选7-9、遗传操作10-12、及药理学方法13-16。然而，每一方法都有一定的缺点，如高成本(细胞毒性抗体与特异性抗体细胞分选)、不同批次间的差异(细胞毒性抗体与特异性抗体细胞分选)17,18、非特异性结合(细胞毒性抗体)18-20、毒性基因的遗传操作与稳定整入的需求(遗传操作)、及耗时的程序(遗传操作、特异性抗体细胞分选、及细胞毒性抗体)。尽管许多研究试图预防或阻止留下的hpscs形成畸胎瘤，但仍有待开发出消除畸胎瘤形成的临床适用策略2,21。

　　相反地，小分子方法具有以下数个优势：这些方法稳健、有效、快速、简单、及便宜，且不需要将基因插入细胞中。已经显示特定小分子可抑制hpscs中的畸胎瘤形成。硬脂酰辅酶a去饱和酶抑制剂plurisin#1可防止畸胎瘤形成15。然而，硬脂酰辅酶a去饱和酶为单饱和脂肪酸生物合成中的关键酵素，且为hpsc存活所必需15。n-芐基壬酰胺jc011通过perk/at4/ddit3途径诱导er应激(stress)22。生存素的化学抑制剂，如槲皮素(quercetin)与ym155，可诱导选择性细胞死亡，且有效抑制畸胎瘤形成14。然而，这些药物皆未取得fda明确定义或许可。

　　强心苷类(cgs)(也称作强心类固醇，css)属于可从天然产物衍生的化合物大家族。尽管这些化合物具有不同的结构，但其具有共同的结构模体。这些化合物为跨膜钠泵(na+/k+-atpase)的特异性抑制剂。cgs抑制na+/k+-atpase，之后增加钙离子的细胞内浓度23。这些化合物可作为正强心剂(positiveinotropicagents)，且此群组成员已用于治疗心脏衰竭超过200年。此家族的一成员，即长叶毛地黄苷(digoxin)，目前仍在临床使用中24。此外，目前认为cgs在癌症疗法中具有潜在治疗上角色25。数个研究报告指出，cgs在诱导数种癌细胞的细胞死亡上扮演重要角色23。癌细胞比正常组织细胞更具易感受性。分子机制可为癌细胞中na+/k+-atpase的特异性α次单元的过度表现26。彼等研究指出，cgs依据细胞类型而有选择性，且能区分正常细胞与转形细胞。

　　尽管强心苷类可作为多重信号传感器，但没有研究调查过这些药物是否可消除未分化的pscs，同时保留其子代或分化的细胞。

　　技术实现要素：

　　在本发明中，意外发现，强心苷类(cgs)可特异性诱导人类胚胎干细胞(hescs)的细胞死亡，但不发生在分化的细胞或hesc衍生性间叶系干细胞(mscs)。亦发现，强心苷类(cgs)显著抑制hescs的肿瘤形成活性，但不影响hescs的万能性。

　　因此，在一方面，本发明提供一种从含有未分化的万能性干细胞样本中移除该细胞的方法，本方法包含将该样本暴露至有效量的强心苷。

　　在一些具体实施例中，本文中使用的强心苷为式(i)化合物或其医药上可接受盐类，

　　其中l为内酯基；

　　r1、r4、及r5独立地为h或oh；

　　r2为ch3或ch2oh；

　　r3于虚线不存在时为h或oh，或r3于虚线形成双键时不存在；

　　r4为h或oh；

　　r5为h或oh；

　　r6为ch3；以及

　　x为–oh或1至6个糖残基的醣苷，每一者未经取代或经取代。

　　在一些具体实施例中，内酯基为不饱和、五或六元内酯环。

　　在一些具体实施例中，糖残基是选自于由鼠李糖、葡萄糖、毛地黄毒糖、毛地黄糖、低格糖(digginose)、蔓茎毒毛旋花子糖(sarmentose)、瓦拉糖(vallarose)、及果糖组成的群组。

　　在一些具体实施例中，糖残基是未经取代的或以酰基、胺基、卤素基、及/或酰胺基取代。

　　在特定具体实施例中，式(i)化合物是选自于由：

　　以及

　　在一些具体实施例中，未分化的万能性干细胞是选自于由胚胎干细胞(escs)与诱导性万能干细胞(ipsc)组成的群组。

　　在一些具体实施例中，未分化的万能性干细胞表现一细胞标记，其是选自于由na+/k+-atpase、nanog、oct4、sox2、ssea3、ssea4、tra-1-60、tra-1-81、及其结合物组成的群组。

　　在一些具体实施例中，样本更包含分化的细胞。

　　在一些具体实施例中，本方法更包含培养分化的细胞，以提供该分化的细胞的细胞群。

　　在一些具体实施例中，分化的细胞为间叶系干细胞(mscs)。具体而言，mscs表现一细胞标记，其是选自于由cd44+、cd73+、cd90+、cd105+、及其结合物组成的群组，且典型上为cd45-、cd34-、cd11b-、cd19-、及/或hla-dr-。

　　在一些具体实施例中，分化的细胞是选自于由成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、内皮细胞、神经细胞、及肝细胞组成的群组。

　　在另一方面，本发明提供一种用于制备分化的细胞的方法，包含：

　　(i)将未分化的万能性干细胞培养于适合分化的条件，以产生包含分化的细胞与未分化的万能性干细胞的细胞群；

　　(ii)将细胞群暴露至有效量的强心苷，以移除未分化的万能性干细胞；以及

　　(iii)可视需要地培养留下的分化细胞。

　　在一些具体实施例中，本文中使用的强心苷为本文所述的式(i)化合物或其医药上可接受盐类。

　　在又一方面，本发明提供一种用于治疗有细胞疗法需求的个体的方法，包含投予个体包含分化细胞的细胞群，其中细胞群在投予至个体之前暴露至强心苷，由此移除，若有的话，细胞群中存在的未分化细胞。在一些具体实施例中，本文中使用的强心苷为本文所述的式(i)化合物或其医药上可接受盐类。

　　本文亦提供一种强心苷的用途，以制造用于诱导未分化万能性干细胞的细胞死亡及/或从分化的细胞移除未分化的万能性干细胞的组合物。进一步提供用于细胞疗法的组合物，其包含强心苷及含有分化细胞的细胞群。在一些具体实施例中，本文中使用的强心苷为本文所述的式(i)化合物或其医药上可接受盐类。

　　进一步提供用于治疗有需求个体的畸胎瘤的方法，包含投予个体有效量的强心苷。

　　下面描述中阐述本发明一或多个具体实施例的细节。基于下列几个具体实施例的详尽描述及所附申请专利范围中，本发明的其他特征或优势将变得显而易见。

　　附图说明

　　当结合附图阅读时，将更好地理解前述发明内容及本发明的以下详尽描述。出于说明本发明的目的，在附图中显示了目前较佳的具体实施例。然而，应理解到，本发明不局限于所示的精确安排与方法。

　　在下图中：

　　图1a至图1e包括图表，显示强心苷类在hescs中诱导细胞毒性作用但在hmscs中则无。图1a显示利用西方墨点法检测的hescs与hmscs中na+/k+-atpaseα1与α2次单元的蛋白表现量。图1b与图1d显示在亮视野下hescs与hmscs的细胞集落与形态。hescs与hmscs是以dmso溶剂对照组、2.5μm长叶毛地黄苷、或2.5μm毛花苷c处理(12小时与24小时)。比例尺：500μm。图1c与图1e显示在hescs与hmscs中测定的ldh释放，以研究在96孔培养皿中的细胞毒性作用。以dmso、2.5μm长叶毛地黄苷、或2.5μm毛花苷c处理hescs或hmscs24小时，且收取上清液用于ldh检测。样本以dmso处理的hescs进行标准化。***p<0.001；**p<0.01；n.s.：无显著性。数据以平均值±sd显示。

　　图2a至图2d包括图表，显示细胞死亡标记在强心苷处理的hescs中上调但在hbmmscs中则无。细胞死亡是以hescs或mscs分析。图2a显示以dmso、1.25μm长叶毛地黄苷、或2.5μm毛花苷c处理hescs24小时。条形图表示流式细胞术数据的统计结果。*p<0.05；数据以平均值±sd显示。图2b显示以dmso、2.5μm长叶毛地黄苷、或2.5μm毛花苷c处理hmscs24小时。细胞以pi与膜联蛋白v染色，并进行流式细胞术分析。活细胞是以pi-/膜联蛋白v-表示；死细胞是以pi-/膜联蛋白v+、pi+/膜联蛋白-、及pi+/膜联蛋白+表示。条形图表示fasc数据的统计结果。n.s.：无显著性。数据以平均值±sd显示。图2c与图2d显示利用西方墨点法检测凋亡标记与万能性干细胞标记的断裂型蛋白量。hescs与hmscs是以dmso、2.5μm长叶毛地黄苷、或2.5μm毛花苷c处理12小时。收取细胞，并检测断裂型与未断裂型的parp、凋亡蛋白酶7、及凋亡蛋白酶3。欲检测万能性干细胞的标记，收取细胞，并检测nanog与oct4。

　　图3a至图3c包括图表，显示以强心苷治疗hbmmscs不影响其分化能力。hbmmscs以dmso、2.5μm长叶毛地黄苷、或2.5μm毛花苷c处理24小时，并移除药物以进一步分化。图3a显示成骨分化。矿化是以茜素红s(alizarinreds)染色，并在o.d570nm下进行定量。图3b显示脂肪形成分化。脂滴以油红染色，并在o.d510nm下进行定量。图3c显示软骨形成分化。糖胺聚醣以艾尔逊蓝(alcianblue)染色，并在o.d650nm下进行定量。比例尺：500μm。n.s.：无显著性。数据以平均值±sd显示。

　　图4a至图4e包括图表，显示强心苷类不影响h9hesc衍生的mscs细胞存活力。图4a显示在亮视野下h9hesc-mscs的细胞形态。hesc-mscs以dmso溶剂对照组、2.5μm长叶毛地黄苷、或2.5μm毛花苷c分别处理12小时与24小时。比例尺：500μm。图4b显示测得的hesc-mscs中ldh的释放，以研究96孔培养盘中的细胞毒性作用。细胞以dmso或药物处理24小时，之后收取上清液进行ldh检测。样本以dmso处理的hescs进行标准化。图4c显示细胞死亡分析的流式细胞术。hesc-mscs以dmso、2.5μm长叶毛地黄苷、或2.5μm毛花苷c处理24小时。细胞以pi与膜联蛋白v染色，且利用流式细胞术分析。条形图表示流式细胞术数据的统计结果。n.s.：无显著性。数据以平均值±sd显示。图4d显示以dmso、2.5μm长叶毛地黄苷、或2.5μm毛花苷c处理12小时的hescs与hesc-mscs。收取细胞，并利用西方墨点法检测断裂型与未断裂型的parp、凋亡蛋白酶3、及凋亡蛋白酶7。

　　图4e显示利用西方墨点法检测的hescs与hesc-mscs中na+/k+-atpaseα1与α2次单元的蛋白质表现量。

　　图5a至图5c包括图表，显示强心苷类处理可防止nsg小鼠hescs中畸胎瘤形成。将nsg小鼠的肿瘤移植dmso、长叶毛地黄苷、或毛花苷c处理的细胞二个月(各组n＝8)。比例尺：10mm。图5a显示该图。图5b显示畸胎瘤重量的量化。点：dmso；方形：长叶毛地黄苷；三角形：毛花苷c。****p<0.0001。数据以平均值±sd显示。图5c显示彼等dmso处理的hesc衍生的畸胎瘤影像。彼等畸胎瘤石蜡切片是以h&e染色法(上图)与ihc染色法进行三个谱系标记(下图)的染色。afp(α胎蛋白)：内胚层标记。sma(平滑肌肌动蛋白)：中胚层标记。tuj1(β-iii微管蛋白)：外胚层标记。比例尺：50μm。

　　图6a至图6b包括图表，显示强心苷类导致hues6hescs细胞毒性。图6a显示hues6在亮视野下的细胞集落与形态。s6hesc以dmso、2.5μm长叶毛地黄苷、或2.5μm毛花苷c处理12小时与24小时。细胞变圆且死亡。图6b显示s6hescs以dmso、2.5μm长叶毛地黄苷、或2.5μm毛花苷c处理24小时。收取培养物上清液用于ldh释放检测。***p<0.001。数据以平均值±sd显示。

　　图7显示强心苷类的蟾蜍强心苷(bufadienolide)亚群，即蟾蜍灵与前海葱苷原a，在hescs中诱导细胞毒性作用但不影响hbmmscs。hescs(上图)与hbmmscs(下图)分别以不同的强心苷类处理，最终浓度为2.5μm，且持续24小时。利用ldh释放试验测定细胞毒性作用，并将所有数据与dmso溶剂对照组进行比较。强心苷类：长叶毛地黄苷与毛花苷c；蟾蜍强心苷类：蟾蜍灵与前海葱苷原a。****p<0.0001；n.s.：无显著性。数据以平均值±sd显示。

　　图8a至图8d包括图表，显示细胞毒性试验结果。图8a显示分化过程示意图，且mscs衍生自h9hescs。图8b显示以cd73与cd105分析和分选的第1代hesc-mscs表型。图8c显示在hesc-mscs中分析的一般msc阳性与msc阴性标记。阳性标记：cd73、cd90、cd44、及cd105；阴性标记：cd45、cd34、cd11b、cd19、及hla-dr。图8d显示hesc-mscs分别以2.5μm最终浓度的不同强心苷类处理24小时，之后测定细胞毒性试验中ldh释放量。n.s.：无显著性。数据以平均值±sd显示。

　　图9a至图9g包括图表，显示强心苷类不会或轻微影响hpsc衍生细胞存活。图9a显示内皮细胞标记cd34与cd144的fasc分析，其显示hipsc内皮细胞中有超过90％的cd34+/cd144+群体。图9b与9c显示细胞以2.5μm长叶毛地黄苷与2.5μm毛花苷c处理24小时的细胞毒性试验结果，以及在细胞毒性试验中测定的ldh释放量。强心苷类在未分化的hipscs中诱导细胞毒性，但不影响hipsc-内皮细胞的存活力。图9d显示hesc-神经元中神经元标记tuj1的免疫荧光染色。绿色：tuj1；dapi(蓝色)：细胞核。图9e显示hesc-神经元以2.5μm长叶毛地黄苷与2.5μm毛花苷c处理24小时，且依据测定的ldh释放，未诱导细胞毒性。图9f显示hesc-肝细胞内胚层中肝细胞标记afp的免疫荧光染色。绿色：α-胎蛋白；dapi(蓝色)：细胞核。

　　图9g显示以2.5μm长叶毛地黄苷与2.5μm毛花苷c处理hesc-肝细胞内胚层细胞24小时，且依据测定的ldh释放，轻微诱导细胞毒性。比例尺：200μm。**p<0.01；*p<0.05；n.s.：无显著性。数据以平均值±sd显示。

　　图10显示强心苷处理的畸胎瘤的免疫组织化学影像。这些影像代表石蜡切片，显示强心苷处理的畸胎瘤的三个胚层谱系。长叶毛地黄苷处理的畸胎瘤切片是以h&e染色(上图)，并对三个谱系标记进行ihc染色(下图)。毛花苷c处理的畸胎瘤切片是以h&e染色(上图)，并对三个谱系标记进行ihc染色(下图)。afp(α-胎蛋白)：内胚层标记。sma(平滑肌肌动蛋白)：中胚层标记。tuj1(β-iii微管蛋白)：外胚层标记。比例尺：50μm。

　　图11a至图11c包括图表，显示药物处理的hbmmscs在细胞移植后仍保留在nsg小鼠中。图11a显示将过度表现gfp的hbmmscs进行肾囊下注射，且以gfp抗体进行hbmmscs染色，以证明细胞仍保留在nsg小鼠中。图11b显示左图：nsg小鼠肾囊下的畸胎瘤切片，得自未分化的hescs与过度表现gfp的hbmmscs的混合物，两者以dmso、长叶毛地黄苷、或毛花苷c处理；以及右图：利用影像显示软件量化肾组织的肿瘤面积(n＝3)。比例尺：2mm。图11c显示以gfp抗体(上图)与h&e(下图)进行畸胎瘤切片染色，其显示药物处理的hbmmscs仍保留在移植位点。比例尺：50μm。

　　图12显示强心苷类(长叶毛地黄苷、毛花苷c、前海葱苷原a、毛地黄毒苷、毛地黄毒配质、乌巴苷)在hescs中以剂量依赖方式诱导细胞毒性作用。

　　具体实施方式

　　除非另有定义，否则本文中使用的所有技术与科学术语具有与本发明所属领域的技术人员普遍理解的相同的含义。“”

　　1.定义

　　除非上下文另外明确指出，否则本文中使用的单数形式“一”、“一者”、及“该”包括复数参考物。因此，举例而言，“一组分”的引用包括复数个此类组分及本领域技术人员熟知的其等同物。

　　“包含”或“含有”等词通常用在包括/涵盖的意义上，其意指容许存在一或多个特征、成分、或组分。“包含”或“含有”等词涵盖“组成自”或“由…组成”等词。

　　本文中使用的“未分化的万能性干细胞”一词意指能自我更新且万能性的细胞。“万能性”一词意指细胞分化成除了胎盘以外的所有细胞系的能力。特定而言，万能性细胞包括这些可分化成三个主要胚层(germlayers)，即内胚层、外胚层、及中胚层，的细胞。一般而言，未分化的万能性干细胞为胚胎干细胞(escs)，其可源自胚胎源，如受精后任何时间的胚胎前、胚胎、或胎儿组织。未分化的万能性干细胞亦可包括诱导性万能干细胞(ipscs)，其以人工方式源自非万能性细胞(如体细胞)，其利用插入一或多个特定基因或利用化学物质刺激。诱导性万能干细胞被视为与万能性干细胞(如胚胎干细胞)相同，是因为诱导性万能干细胞具有两个独特的特征，即自我更新能力与万能性。escs或ipscs能形成畸胎瘤。escs或ipscs更习知能表现特定细胞标记，如na+/k+-atpase、nanog、oct4、sox2、ssea3、ssea4、tra-1-60、tra-1-81、碱性磷酸酶。

　　本文中使用的“间叶系基质/干细胞(mscs)”可自我更新且为多能性(multipotent)。本文中的“多能性”一词意指干细胞具有分化成多种细胞类型的能力。多能性干细胞不能在体内产生任何类型的成熟细胞；其仅限于局限范围的细胞类型。举例而言，mscs可分化成成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、神经元、β胰岛细胞、肠细胞。mscs可取自各个来源，如骨髓、脂肪、或牙齿组织，之后培养扩增。mscs亦可源自escs或ipscs。然而，不同于escs或ipscs具有致癌性，mscs不具致癌能力，因此被认为具有更高的生物安全性。特定而言，习知mscs表现特定细胞标记，如cd44+、cd73+、cd90+、cd105+，且为cd45-、cd34-、cd11b-、cd19-、及/或hla-dr-。

　　本文中使用的“分化”一词是指万能性干细胞分化成子代的过程，其中细胞富集特定形式或功能。分化是一相对过程。举例而言，相较于escs，mscs相对分化，但仍具有分化成多种细胞类型的能力。成熟的体细胞，如成骨细胞(骨)、软骨细胞(软骨)、脂肪细胞(脂肪)、肝细胞(肝)可为最终分化形式，其失去分化成不同细胞类型的能力。因此，“分化的细胞”一词可指相对分化的细胞，如mscs或最终分化细胞，如成熟体细胞。

　　当用于与未分化的万能性干细胞相关时，本文中使用的“移除”或“消除”等词意指将此类细胞与原始样本中的其他组分或在一或多个加工步骤后样本中留下的组分分离或分开。其他组分可包括例如，其他细胞，具体而言是分化的细胞。移除或消除目标细胞可包括通过应用本文中使用的化合物杀死、抑制、或消耗样本中的目标细胞，举例而言，如此一来，样本中将富集其他组分，如分化的细胞。杀死目标细胞可包括引发细胞凋亡或细胞毒性。抑制或消耗靶细胞可包括利用可测定的量减少数量、比例、增殖、或活性(万能性能力或肿瘤形成活性)。移除可为部分的或完全的。本文中使用的样本或培养物是实质上无未分化的万能性干细胞，举例而言，可含有小于约10％、约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％、或未测得的未分化的万能性干细胞。

　　本文中使用的“培养物”一词是指一群以培养基培养的细胞。细胞可传代培养(passage)。细胞培养可为初代培养，其从动物组织分离后未经传代培养，或可传代培养多次(继代培养一或多次)。

　　本文中使用的“约”一词是指所用数字的数值的正负5％。

　　本文中使用的“个体”一词包括人类与非人类动物，如伴侣动物(如狗、猫、及其类似物)、农场动物(如牛、羊、猪、马、及其类似物)、或实验动物(如大鼠、小鼠、天竺鼠、及其类似物)。

　　本文中使用的“治疗”一词是指将包括一或多个活性剂的组合物应用或投予至个体，该个体患有疾病、疾病的症状或病况、或疾病进展，目的在于治疗、治愈、减轻、缓解、改变、补救、改善、改进、或影响该疾病、疾病的症状或病况、疾病引起的残疾、或疾病进展。

　　本文中使用的“有效量”一词意指在受处理细胞或个体中赋予生物效应的活性成分的量。有效量可取决于各种原因而变，如治疗途径与频率、体重、及细胞种类或接受该活性成分的个体。

　　本文中使用的“内酯”基团为环酯类。特定而言，内酯可以下式表示：

　　其中r1与r2一起与其所连接的碳原子与氧原子形成一可视需要地经取代的环状基团，其可为饱和、不饱和、或芳族。r1与r2独立地为氢或可视需要地经取代的烃部分。内酯的最稳定结构为5元γ-内酯类与6元δ-内酯类。

　　“烃”是指由氢与碳组成的有机化合物，其可为直链、支链、或环状，且可包括烷烃、烯烃、炔烃、芳烃、或其结合物。

　　“醣苷”一词是指一化合物，其中糖基或糖残基与非碳水化合物部分结合。典型上，糖基团(糖基(glycone))通过其首旋异构碳(anomericcarbon)与另一基团(糖苷配基(aglycone))键合，其是经由糖苷键，且具有氧、氮、或硫原子作为连接符。

　　本文中使用的糖基或糖残基可为简单糖、胺基糖、脱氧糖、糖酸、或糖醇。

　　本文中使用的“可视需要地经取代”一词意指本术语所指的基团可为未经取代或可以一或多个取代基取代。取代基的实例可包括烷基、烷氧基、羟基、酰基、卤素基、及/或酰胺基。烷基的实例包括c1-6烷基，如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、第三丁基、正戊基、及正己基。烷氧基的实例包括c1-6烷氧基，如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、异丁氧基、及第三丁氧基。酰基的实例包括甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、戊酰基、异戊酰基、己酰基、辛酰基、癸酰基、月桂酰基、及苯甲酰基。卤素原子的实例包括氟原子、氯原子、溴原子、及碘原子。

　　本文中使用的“医药上可接受盐类”一词包括酸加成盐类。“医药上可接受酸加成盐类”是指这些保留游离碱的生物有效性与性质的盐类，其由无机酸如氢氯酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、及其类似物，以及有机酸如乙酸、丙酸、丙酮酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸、三氟乙酸、及其类似物形成。

　　2.化合物

　　依据本发明，本文中使用的活性化合物为强心苷。

　　本文中使用的强心苷为细胞膜na+/k+atpase(atp磷酸水解酶(atpphosphohydrolase))的抑制剂。具体而言，强心苷类包含类固醇核心，其中c17位置具有哌喃酮(pyrone)或丁内酯取代基(“哌喃酮形式”与“丁内酯形式”)，且典型上c3位置是经醣苷化的(glycosylated)。大多数强心苷类包括一至四个糖连接在3β-oh基团。

　　在一些具体实施例中，强心苷为式(i)所表示的化合物：

　　及其医药上可接受盐类，

　　其中l为内酯基；

　　r1、r4、及r5独立地为h或oh；

　　r2为ch3或ch2oh；

　　r3于虚线不存在时为h或oh，或r3于虚线形成双键时不存在；

　　r4为h或oh；

　　r5为h或oh；

　　r6为ch3；以及

　　x为–oh或1至6个糖残基的醣苷，每一者未经取代或经取代。

　　在一些具体实施例中，内酯基为不饱和、五或六元内酯环。

　　在一些具体实施例中，糖残基是选自于由鼠李糖、葡萄糖、毛地黄毒糖、毛地黄糖、低格糖、蔓茎毒毛旋花子糖、瓦拉糖、及果糖组成的群组。

　　在一些具体实施例中，x为1、2、3、4、5、或6个糖残基的醣苷。在一些具体实施例中，x为二份毛地黄毒糖、一份乙酰基毛地黄毒糖、及一份葡萄糖的醣苷；或者x为三份毛地黄毒糖的醣苷；或者x为一份鼠李糖的醣苷。

　　在一些具体实施例中，糖残基是未经取代的'或以酰基、胺基、乙酰基、卤素基、及/或酰胺基取代。

　　本领域有大量已知的强心苷类。示例性强心苷包括但不局限于，长叶毛地黄苷(digoxin)、毛花苷c(lanatosidec)、乌巴苷(ouabain)、毛地黄毒苷(digitoxin)、毛地黄毒配质(digitoxigenin)、蟾蜍灵(bufalin)、前海葱苷原a(proscillaridina)、夹竹桃苷(oleandrin)、夹竹桃苷(neriin)、欧夹竹桃苷甲(neriantin)、奥多诺苷a与b(odorosideaandb)、乌巴苷(g-毒毛花苷(g-strophantin))、磁麻苷(cymarin)、蔓茎毒毛旋花子苷(sarmentocymarin)、杠柳麻苷(periplocymarin)、k-毒毛花苷(k-strophantin)、乌巴苷、夹竹桃糖苷(thevetin)、海芒果苷(cerberin)、黄夹次苷(peruvoside)、夹竹糖苷(thevetosin)、夹竹桃糖苷a(thevetina)、海芒果苷(cerberin)、毒海芒果碱(tanghinin)、去乙酰基毒海芒果碱(deacetyltanghinin)、海芒果苷(cerberin)、箭毒苷(echujin)、灰干苏铁g(honghelosideg)、杠柳苷(periplocin)、毒毛旋花子苷元(strophantidin)、羊角拗醇(strophantidol)、黑柳苷(nigrescin)、乌沙苷(uzarin)、牛角瓜苷(calotropin)、桂竹香苷a(cheirosidea)、墙花毒苷(cheirotoxin)、依诺苷(eounoside)、依派苷(euobioside)、依莫诺苷(euomonoside)、毒根子素苷a与b(lancetoxinaandb)、落地苷(kalanchoside)、毒藓苔苷a-c(bryotoxina-c)、毒藓苔苷c(bryotoxinc)、环落地生根素b(bryophyllinb)、子叶苷(cotiledoside)、泰勒苷a-d、f与g(tyledosidea-d、fandg)、圆形苷a-c(orbicusidea-c)、异白毒素(alloglaucotoxin)、芋螺毒素(corotoxin)、海罂粟碱(coroglaucin)、白苷(glaucorin)、红海葱苷元衍生物(scillirosidinderivatives)、波托皂苷元a衍生物(bovogeninaderivatives)、海葱苷a与b(scillareneaandb)、海葱糖苷(scilliroside)、海葱苷(scillarenia)、细海葱苷(scilliacinoside)、白海葱苷(scilliglaucoside)、白海葱苷元(scilliglaucosidin)、暗海葱苷元(scilliphaeosidin)、暗海葱苷(scilliphaeoside)、红海葱苷元(scillirosidin)、红核海葱苷元(scillirubrosidin)、红核海葱苷(scillirubroside)、前海葱苷原a、鲁贝尔(rubelin)、铃兰毒苷(convalloside)、铃兰毒素(convallatoxin)、波托皂苷(bovosidea)、糖波托皂苷a(glucobovosidea)、红波托皂苷(bovoruboside)、见血封喉苷α(antiarinα)、嚏根草苷(helleborein)、嚏根草因(helleborin)、嚏根因(hellebrin)、福寿草苷(adonidin)、阿多宁(adonin)、磁麻苷(cymarin)、福寿草毒素(adonitoxin)、杀草苷(thesiuside)、毛地黄毒苷、羟基洋地黄毒苷(gitoxin)、洋地黄全苷(gitalin)、长叶毛地黄苷、f-吉托皂苷(f-gitonin)、毛地黄皂苷(digitonin)、毛花苷a-c、蟾毒灵(bufotalin)、蟾蜍他里宁(bufotalinin)、蟾蜍他里定(bufotalidin)、蟾蜍精(gamabufagin)、华蟾蜍精(cinobufagin)、海蟾蜍精(marinobufagin)、蟾蜍毒素(arenobufagin)、正规蟾蜍精(regularobufagin)、垣头蟾蜍精(vallicepobufagin)、槲皮素(quercicobufagin)、维迪布法芬(viridibufagin)、假蟾毒灵(pseudobufotalin)、牛角瓜苷(calotropin)、卡拉定(calactinu)、斯卡林(scharin)、弗如斯卡林(voruscharin)、2“-氧基弗如斯卡林(2“-oxovoruscharin)、16-氧基弗如斯卡林(16-oxovoruscharin)、蟾蜍他里因(inubufotalin)、垣头蟾蜍精、槲皮-5α-4,5-二氢红海葱苷元(quercicobuy-5α-4,5-dihydro-scillirosidin)、165α-4,5-二氢红海葱苷元(165α-4,5-dihydro-scillirosidin)、垣头蟾蜍精、槲皮素、糖苷a-c(osidea-c)、嚏根因、福寿草苷、阿多宁、磁麻苷、福寿草毒素、杀草定(thesiusidein)、暗海葱苷、(schaeosidine)、及12β-羟基去乙酰基红海葱苷元(12β-hydroxy-desacetyl-scillirosidine)。

　　在一些实例中，化合物是选自于由

　　以及

　　本发明化合物可利用常规方法制备或商业上购得。

　　3.活性化合物的用途

　　依据本发明，强心苷可用于诱导未分化的万能性干细胞的细胞死亡，因此可选择性地从分化的细胞中移除未分化的万能性干细胞。

　　具体而言，本发明提供一种从含有未分化的万能性干细胞样本中移除该细胞的方法，包含将该样本暴露至有效量的强心苷。

　　在一些具体实施例中，样本为细胞样本，包含欲转移至有细胞疗法需求的病患的培养细胞(体外)。

　　具体而言，本发明亦提供一种制备分化的细胞的方法，包含：

　　(i)将未分化的万能性干细胞培养于适合分化的条件，以产生包含分化的细胞与未分化的万能性干细胞的细胞群；

　　(ii)将该细胞群暴露至有效量的强心苷，以移除该未分化的万能性干细胞；以及

　　(iii)可视需要地培养该留下的分化细胞。

　　在一些具体实施例中，未分化的万能性干细胞是选自于由胚胎干细胞(escs)与诱导性万能干细胞(ipscs)组成的群组。较佳地，万能性干细胞是源自人类。可使用本领域熟知的技术从人类囊胚细胞获得人类escs。人类ipscs可利用分离与培养合适的体细胞供体细胞(如人类纤维母细胞)而制备，并以本领域熟知的技术进行基因工程。

　　在一些具体实施例中，未分化的万能性干细胞培养于培养基，其所处条件容许一部分未分化的万能性干细胞分化成感兴趣的分化细胞，之后添加有效量的强心苷至培养基，使得留下的未分化万能性干细胞死亡，且可视需要地留下的分化细胞进一步培养扩增，随后投予至有细胞疗法需求的个体。

　　在一些具体实施例中，适于培养本发明未分化的万能性干细胞及/或分化的细胞的培养基是本领域可得，如dmem、mem、或imem培养基，内含10％胎牛血清。细胞培养可于正常条件下进行，例如，在37℃的1-5％co2条件下。典型上，将适量的强心苷添加至培养基，达到浓度0.1μm至100μm，之后细胞在强心苷存在下培养至少3小时、至少6小时、较佳地12小时、更佳地24小时，以使留下的未分化的万能性干细胞死亡。可添加培养基组分促进分化作用，其促使分化成所需细胞系(celllineage)。

　　通过以强心苷处理，留下的未分化的万能性干细胞可选择性死亡，并从其分化的后代中移除，使得含有分化的后代且留下的未分化的万能性干细胞移除后的样本可用于细胞疗法，其致肿瘤风险(tumorigenicrisk)降低。具体而言，活的未分化万能性干细胞在以强心苷处理后的量低于对照组(如未经此处理的相同细胞)达约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或90％。更具体而言，移除动作完全；亦即，未分化的万能性干细胞在此处理后完全死亡，且未检测到留下的未分化的万能性干细胞。

　　因此，本发明进一步提供用于治疗有细胞疗法需求的个体的方法，包含投予个体有效量的包含分化细胞的细胞群，其中细胞群在投予至个体之前暴露至强心苷，由此实质上移除，若有的话，细胞群中存在的未分化万能性细胞。典型上，细胞群进一步以不含强心苷的新鲜培养基置换，以使细胞群在投予个体之前不含强心苷。

　　亦提供一种组合物，其包含强心苷与含有分化的细胞的细胞群。特定而言，细胞群在投予个体之前已暴露于强心苷，由此实质上移除，若有的话，细胞群中存在的未分化细胞。

　　典型上，就输送与功效的目的，组合物以医药上可接受载体配制。本文中使用的“医药上可接受”意指载体兼容于组合物中的活性成分，且较佳地可稳定该活性成分，以及对接受治疗的人是安全的。该载体可为活性成分的稀释剂、载剂、赋形剂、或基质。本发明的组合物可经由任何生理学上可接受途径传输，如口服、非经口(如肌肉、静脉、皮下、及腹腔)、透皮、栓剂、及鼻内方法。关于非经口投予，较佳的使用形式为无菌水溶液，其可含有足以使溶液与血液等张的其他物质，如盐类或葡萄糖。水溶液可视需求适当缓冲。

　　在一些具体实施例中，有细胞疗法需求的个体是患有疾病或病况，包括但不局限于，黄斑点退化(maculardegeneration)、移植物抗宿主病、心脏病(如周边动脉疾病、缺血、中风、心肌梗塞)、急性肺损伤(ali)、克隆氏症(crohn’sdisease)、第一型糖尿病、多发性硬化症、神经系统疾病、成骨不全(osteogenesisimperfecta)、缺血、纤维化、及遗传性疾病，如胡勒氏症候群(hurler’ssyndrome)、抗发炎反应(免疫调节能力)、心血管疾病、神经退化性疾病、组织工程、及其类似物。依据本领域熟知的任何方法，治疗可使用细胞构筑新组织(有或无生物材料)。可将细胞注射或移植至组织损伤部位，以便其在体内产生新组织。举例而言，mscs可应用在软骨与骨再生，用于治疗关节炎、下背痛(lbp)、软骨退化、骨折、或骨质疏松症。此外，由于mscs可分化为脂肪与软骨，mscs亦可应用于整形手术，如自体脂肪移植手术与鼻腔增强手术中的软骨移植。

　　本发明将利用以下实施例进一步说明，其被提供旨在说明而非局限。本领域技术人员应理解到，鉴于本发明的揭示，在特定具体实施例中可进行许多改变，且仍能取得相似或类似的结果，而不脱离本发明的精神与范畴。

　　实施例

　　使用人类万能性干细胞(hpscs)的一个重要安全考虑是致肿瘤风险，是因为这些细胞于体内注射后在异位点可形成畸胎瘤。数千个未分化的hpscs足以在小鼠模型中诱导畸胎瘤。因此，在临床应用hpsc衍生细胞之前，移除具有畸胎瘤潜力的所有残余未分化的hpscs至关重要。在本研究中，发明人的数据证实在未分化的人类胚胎干细胞(hescs)中，强心苷类的细胞毒性作用，如长叶毛地黄苷、毛花苷c、蟾蜍灵、前海葱苷原a、毛地黄毒苷、毛地黄毒配质、及乌巴苷。在人类骨髓间叶系干细胞(hbmmscs)中未观察到此现象。最重要的是，长叶毛地黄苷与毛花苷c不影响干细胞的分化能力。一致地，hesc衍生的mscs、神经元、及内皮细胞、肝细胞内胚层的存活力不受或轻微受到长叶毛地黄苷与毛花苷c处理的影响。此外，体内实验证明，长叶毛地黄苷与毛花苷c可防止畸胎瘤形成。依据本发明，此为首次描述强心苷类在hescs中的细胞毒性与肿瘤预防作用。长叶毛地黄苷与毛花苷c亦为首个fda许可的在未分化的hescs中具有细胞毒性的药物。

　　1.材料与方法

　　所有方法均按照相关指南与法规进行。所有实验均由中央研究院(台北，中国台湾)人类个体研究伦理委员会(as-irb02-106069)及机构动物照护与使用委员会(iacuc，14-03-684)批准。除非另有说明，否则所有培养基与补充物皆购自thermofisherscientific(wilmington，de，usa)。除非另有说明，所有化学品均购自sigma(st.louis，mo，usa)。

　　1.1细胞株与培养条件

　　hesc细胞株h9购自wicells(madison，wi，usa)27。另一hesc细胞株hues6赠自dr.douglasa.melton(harvarduniversity，boston，ma，usa)28。在饲养(feeder)细胞培养方面，以dulbecco氏改良eagle培养基(dmem)/f12培养，其中补充20％剔除血清替代物、2mml-麸酰胺酸、1％非必需胺基酸、4ng/ml人类bfgf、及0.1mm2-巯基乙醇。在饲养细胞培养方面，将c57bl/6小鼠胚胎纤维母细胞(mef)培养在含有10％fbs的dmem中，并以0.01mg/ml丝裂霉素c处理2-6小时使细胞失活。针对无饲养细胞培养，将hescs接种在涂布matrigelmatrix(bdbiosciences，sanjose，ca，usa)的培养盘上，并以mef(c57bl/6)条件培养基培养。将hbmmsc培养在mesenprorstm试剂盒(lifetechnologies，camarillo，ca，usa)中。所有细胞培养在含有5％co2的37℃潮湿环境中。

　　1.2乳酸脱氢酶(ldh)细胞毒性试验

　　收取以长叶毛地黄苷2.5μm、毛花苷c2.5μm、或dmso溶剂对照组处理24小时的细胞上清液。依据制造商的说明书(promega，southampton，uk)，以cytotox96非细胞毒性试验测定释放的ldh。在室温下将上清液与试剂培养20分钟，之后以终止溶液终止反应。利用读盘分光亮度计(benchmarkplusmicroplatespectrophotometersystem，bio-rad，ca，usa)测定490nm时的吸亮度。

　　1.3西方墨点法分析

　　利用ripa缓冲液收取细胞裂解物(ripa缓冲液：nacl150mm、trisph8.050mm、edtaph8.05mm、np-401.0％、sds0.5％、脱氧胆酸钠0.1％)。如先前所述，以不同类型的一次抗体进行西方墨点法分析29。所使用的一次抗体包括抗β肌动蛋白(a5441；sigma)、抗oct4(sc-9081；santacruzbiotechnology，santacruz，ca，usa)、抗nanog(3580；cellsignalingtechnology，danvers，ma，usa)、细胞凋亡抗体试剂盒(9915；cellsignalingtechnology)、atp1a1(3010；cellsignalingtechnology)、及atp1a2(16836-1-ap；proteintechtm)。在4℃反应整夜后，将印迹培养于键接辣根过氧化酶(jacksonimmunoresearchinc)的山羊抗小鼠或山羊抗兔抗体。利用化学发光受质(wbkls0500；millipore，darmstadt，germany)检测印迹。利用fujifilmlas-4000(fujifilm，tokyo，japan)拍摄影像。

　　1.4流式细胞术

　　在细胞死亡试验方面，依据制造商的说明(alexa488膜联蛋白v/死亡细胞凋亡试剂盒；lifetechnologies)进行碘化丙啶/膜联蛋白v试验。简言之，以胰蛋白酶分离活细胞，并以膜联蛋白v抗体与pi操作溶液培养15分钟。发明人添加400μl1x膜联蛋白结合缓冲液，并利用facscantotm(bectondickinson，franklinlakes，nj，usa)分析染色细胞。在分析mscs的表型特征方面，发明人使用stemflowtmhmsc分析试剂盒(bdbiosciences)与facscantotm。所有流动数据皆利用facsdivatm软件(bdbiosciences)与flowjotm(flowjo，llc，ashland，usa)分析。

　　1.5hesc衍生的mscs

　　依据dr.xu及其同事的报告30，将hescs与10ng/mlbmp4和1μm的a8301一起培养5天。接着，将细胞在明胶涂布的培养盘上传代，并将培养基转换为msc培养基[补充20％胎牛血清(fbs)、l-麸酰胺酸(gluta-max)、1x非必需胺基酸的最低必需培养基eagleα改良(αmem)培养基]。细胞在第5传代之内扩增，并分选出cd73+(11-0793，thermofisherscientific)和cd105+(12-1057，thermofisherscientific)双阳性细胞。

　　1.6细胞分选

　　以胰蛋白酶分离hesc衍生的mscs，并以pbs清洗。然后，细胞在4℃下以抗人类cd73fitc(thermofisherscientific)与抗人类cd105pe(thermofisherscientific)培养15分钟。细胞以pbs清洗三次。以细胞分选仪(bdfacsariaii，bdbiosciences)分选cd73+/cd105+细胞。将分选的细胞培养在msc培养基。

　　1.7骨原性分化与茜素红s(alizarinreds)染色

　　以长叶毛地黄苷(2.5μm)、毛花苷c(2.5μm)、或dmso溶剂对照组处理bmmscs24小时。将药物移除，且细胞以pbs清洗并培养在mscgotm骨原性分化培养基(biologicalindustries，kibbutzbeit-haemek，israel)31。每周更换培养基两次，持续14-21天。接着，细胞在-20℃下以冰冷的70％乙醇固定1小时。在以水清洗三次后，细胞随后在室温下以40mm茜素红s(ars)(ph4.2)染色10分钟。接着，细胞以pbs清洗五次。利用olympusck-40显微镜拍摄影像。在定量方面，染剂以含10％(w/v)氯化十六烷基吡啶(sigma0732)的磷酸钠缓冲液(ph7.0)萃取15分钟，并测定570nm下的o.d.值。

　　1.8脂肪生成与油红o试验

　　以长叶毛地黄苷(2.5μm)、毛花苷c(2.5μm)、或dmso溶剂对照组处理hbmmscs24小时。接着，将药物移除，并将细胞培养在mscgotm脂肪生成分化培养基(biologicalindustries)。培养基每3-4天更换一次，持续8-12天。在诱导脂肪生成后，发明人以msc维持培养基替换mscgotm脂肪生成完全培养基，共6-9天。在室温下，细胞以4％甲醛小心固定1小时、以60％异丙醇清洗、及风干。脂滴(lipiddrops)以油红o操作液(30ml溶于异丙醇的0.35％油红溶液，其以20ml蒸馏水稀释)染色10分钟。接着，细胞以水清洗4次。在定量方面，以100％异丙醇萃取油红o染剂，并检测510nm时的吸亮度。

　　1.9软骨诱导(chondrogenicinduction)与艾尔逊蓝(alcianblue)测定

　　以长叶毛地黄苷(2.5μm)、毛花苷c(2.5μm)、或dmso溶剂对照组处理bmmscs24小时。接着，将药物移除，并将1x105个细胞种植在96孔u型底培养盘。在24小时后，发明人改成完整mscgotm软骨诱导培养基(biologicalindustries)，共21天。培养基每3-4天更换一次。接着，经沉淀的细胞以4％甲醛固定1小时、以ddh2o清洗两次、及以含1％艾尔逊蓝溶液的0.1nhcl染色30分钟。针对艾尔逊蓝的洗脱(elution)，发明人添加8m胍氢氯酸溶液，并在室温下培养整夜。检测650nm时的吸亮度。

　　1.10体内致肿瘤性试验与免疫组织化学

　　以长叶毛地黄苷(2.5μm)、毛花苷c(2.5μm)、或dmso对照组处理hescs24小时。在50μlpbs中，将约106个经处理细胞与105个mefs混合，以促进畸胎瘤形成32。将细胞混合物与1xmatrigelmatrix充分混合，并将细胞皮下注射至nodscidγ小鼠(nsg小鼠)，共8周。在8周后，牺牲动物，并移除畸胎瘤、以10％福尔马林固定、包埋在石蜡中、及以苏木精与曙红染色。h&e染色方法是依据之前的研究进行了修改33。在免疫组织化学方面，畸胎瘤切片以5％牛奶阻断1小时，并在4℃下以一次抗体染色整夜，之后在室温下以二次抗体(dako，santaclara，ca，usa)处理1小时，以及dab增强剂(dako)。一次抗体：用于内胚层谱系的抗人类α-1-胎蛋白(a0008，dako)；用于中胚层谱系的抗人类平滑肌肌动蛋白，殖株1a4(m0851，dako)；用于外胚层的抗tuj1(mab1637，emdmillipore，darmstadt，germany)。

　　1.11hipsc细胞分化成内皮细胞

　　hipsc衍生的内皮细胞是依据先前的报告制备34。将hipsc维持在涂布vtn-n的培养盘(thermo，wilmington，de，usa)上的mtesr1培养基中(stemcelltechnologies，vancouver，canada)。首先，欲逐步诱导分化，发明人对种植在中胚层诱导培养基中48小时的hipscs进行中胚层诱导作用(基础培养基含有10mm的y-27632、3mm的chir99021、及2ng/ml的活化素a；基础培养基是由12g/l的dmem/f-12、3.56g/l的hepes、1.742g/l的碳酸氢钠、14μg/l的亚硒酸钠、10.7mg/l的重组型转铁蛋白、19.4mg/l的重组胰岛素、及64mg/l的l-抗坏血酸2-磷酸倍半水镁盐水合物组成)。再者，针对中胚层至内皮细胞的转变，将中胚层细胞重新种植于血管生成培养基(其是基础培养基添加2mg/ml的pva，再加上20ng/ml的hvegf-a)中额外72小时。将所有分化的细胞分盘在预先涂布vtn的培养盘上。在第5天，以流式细胞术分析cd31抗体(pecam1，thermofisherscientific，wilmington，de，usa)与cd144抗体(cdh5，thermofisherscientific)染色的内皮细胞。

　　1.12hescs分化成神经元

　　神经元诱导方法是依据先前的研究35。简言之，以1mg/ml的胶原蛋白酶iv处理1小时，将hescs分离，且重新悬浮于胚状体(eb)培养基中(其为不含bfgf的hescs培养基，内含2μm的反吗啡(dorsomorphin)与2μm的a-83-01b)，并于未经处理的聚苯乙烯培养盘中培养7天。然后，将ebs种植在matrigel涂布的6孔培养盘上，并将培养基更换成神经先驱细胞(npc)培养基，其由dmem/f12：神经基础物＝1:1、1％n2、1％b27、1％neaa、1％glutamax、2μg/ml肝素、及2μm环巴胺组成。附着的ebs以npc培养基培养14天，且每隔一天更换培养基。以机械方式选择神经先驱细胞，之后重新悬浮于npc培养基中，所使用的6孔培养盘以超低附着面(cat.no.3471，corning，ny)涂布。针对神经元分化，以accutase处理悬浮的神经先驱细胞球用10分钟，并置于神经元培养基中的聚-d-离胺酸涂布盖玻片上，其中神经元培养基为补充了1％glutamax、1％b27、10ng/mlbdnf、及10ng/mlgdnf的神经基础培养基。每周更换培养基，并于3周后以神经元进行接下来的实验。利用if染色评估神经细胞中tuj1(801202，biolegend)的表现。

　　1.13hescs分化成肝细胞

　　本方法遵照先前发表于natureprotocols的方法36。利用0.5mmedta(lifetechnologies，camarillo，c，usa)分离hescs、接种在涂布vtn-n的培养盘(corning)、并在mtesr1培养基中培养48小时。然后，每天更新培养基，以用于所有后续步骤。在第1-2天，培养基以新鲜的cdm-pva替换(其由溶于250mlimdm/f-12的0.5gpva(sigma)、glutamax(invitrogen)、250mlimdm(invitrogen)、5ml化学上定义的脂质浓缩物(invitrogen)、20μl的硫代甘油97％(sigma)、350μl的胰岛素(10mg/ml；roche)、250μl转铁蛋白(30mg/ml；roche)加上活化素a(100ng/ml；r&d)、bfgf(80ng/ml；r&d)、bmp4(10ng/ml；r&d)、及10mm的ly-294002(promega)组成)。在第3天，细胞在补充有活化素a(100ng/ml)与bfgf(80ng/ml)的rpmi培养基中分化。在第4-6天，细胞在补充有活化素a(50ng/ml)的rpmi培养基中扩增。在第7天，将细胞传代，并将每平方公分105,000个细胞重新分盘于含有活化素a(50ng/ml)与y-276322hcl(10μmselleck-chem，houston，tx，usa与munich，germany)的rpmi中，其中培养盘以vtn-n涂布。然后，在第8-11天，将细胞培养于rpmi+活化素a(50ng/ml)中。细胞分化成肝细胞内胚层，并在药物处理后进行分析。利用免疫荧光染色法，分析肝细胞内胚层中α-胎蛋白(a0008，dako，santaclara，ca，usa)的表现。

　　1.14免疫荧光试验

　　免疫荧光试验的进行如先前所述29。简言之，细胞以pbs清洗、以含4％甲醛溶液的pbs固定10分钟、及以0.3％tritonx-100通透化10分钟。然后，细胞以一次抗体在4℃下染色整夜。在以pbs清洗后，细胞在室温下以alexa488抗兔igg或抗小鼠igg培养1小时。细胞核以4,6-二甲脒基-2-苯基吲哚(dapi，1μg/ml)染色。

　　1.15慢病毒(lentivirus)产生与细胞感染

　　293t细胞以每孔106个细胞种植在6孔培养盘中，以产生慢病毒。在24小时后，利用turbofect转染试剂(thermofisherscientific)，将1μg的plko_as3w.egfp.bsd、0.9μg的pcmvr8.91、及0.1μg的pmd.g(nationalrnaicorefacility，taipei，taiwan)转染至293t细胞。在转染后24小时，将培养基更换成病毒收取培养基，其含有hg-dmem、10％fbs、及1％bsa。将hbmmsc种植在6孔培养盘中，之后与慢病毒(感染复数＝10)一起培养一天。在隔天，以10μg/ml杀稻瘟菌素(blasticidin)(thermofisherscientific)选择细胞。然后，以细胞分选仪(facsariatmii，bdbiosciences)分离过度表现gfp的hbmmscs，并培养在含有10μg/ml杀稻瘟菌素的培养基中，用于后续实验。

　　1.16肾囊(kidneycapsule)移植

　　将约8x105个hescs与8x105个hbmmscs的混合物注射至6周大雄性nsg小鼠的肾胶囊下。移植5周后，牺牲动物，并取出组织，以10％福尔马林固定、石蜡包埋、h&e染色或进行ihc染色。染色方法在材料和方法部分描述。抗鸡gfp抗体(ab13970，abcam，cambridge，ma，usa)是用于gfp过度表现的hbmmscsihc染色。

　　1.17阿拉马尔蓝(alamarblue)试验

　　阿拉马尔蓝(alamarblue)试验可测定相对细胞数。在细胞中，发明人将1/10的阿拉马尔蓝存活试验试剂加入总体积的混合物中(biotium；fremont，ca，usa)。细胞在37℃下培养整夜。利用测定570nm与600nm时的析亮度(od)量化所得产物，并计算相对细胞数。

　　1.18统计分析

　　所有统计数据的表示，皆为至少三次生物学重复数的平均值±标准偏差(s.d.)。利用t检定或单因子变异数分析评估统计学上显著性差异，其中p值<0.05被视为具有显著差异。

　　2.结果

　　2.1hescs与hbmmscs中na+/k+-atpase的α次单元的差异性表现

　　由于并非所有癌症信号都与hesc信号重迭，发明人确定了强心苷类靶基因na+/k+-atpase的表现量，以评估其是否可消除未分化的hescs。先前报告指出，强心苷类通过靶向na+/k+-atpase而具有抗癌作用25,26。经由西方墨点法分析，发明人发现hescs比成人干细胞，如人类骨髓间叶系干细胞(hbmmscs)，更丰富地表现na+/k+-atpase(图1a)。此发现表明，hescs可能比hbmmscs对强心苷类更敏感，是因为其na+/k+-atpase的差异性表现。

　　2.2长叶毛地黄苷与毛花苷c诱发hescs细胞凋亡而非hbmmscs

　　发明人研究是否强心苷类影响hescs或其他细胞类型的存活力。首先，发明人以长叶毛地黄苷与毛花苷c分别处理未分化的hescs达12小时与24小时。长叶毛地黄苷(2.5μm)与毛花苷c(2.5μm)两者在hescs中诱导显著的细胞死亡(图1b)。欲研究强心苷类的细胞毒性作用，发明人测定了以长叶毛地黄苷或毛花苷c处理24小时后的hescs培养物上清液中ldh的释放(图1c)。两种药物皆显著诱导hescs中的细胞毒性作用(图1c)。一致地，在另一株hescs细胞中，即hues6，长叶毛地黄苷(2.5μm)与毛花苷c(2.5μm)皆诱导细胞死亡(图6a)与细胞毒性(图6b)。

　　相反地，长叶毛地黄苷与毛花苷c不影响hbmmscs存活(图1d)。两种药物对hbmmscs没有细胞毒性作用，如ldh细胞毒性试验的测定所示(图1e)。

　　强心苷类可依其内酯部分的天然结构分为二个亚群23,26。长叶毛地黄苷与毛花苷c属于具有丁基内酯的强心苷(cardenolides)亚群23。发明人在蟾蜍强心苷(bufadienolides)亚群中选择二个具有吡喃酮环的药物23。发明人以蟾蜍灵或前海葱苷原a处理hescs与hbmmscs。结果类似于长叶毛地黄苷与毛花苷c处理的细胞结果，其中蟾蜍灵或前海葱苷原a在hescs中诱导细胞毒性，而在hbmmscs中则无(图7)。

　　欲确定强心苷类的细胞毒性作用是否对hescs具有选择性，发明人亦进行pi/膜联蛋白流式细胞术分析。在处理细胞24小时后，长叶毛地黄苷处理后的细胞死亡率达到70％，而毛花苷c处理后细胞死亡率达到82％(图2a)。相反地，在长叶毛地黄苷或毛花苷c处理的hbmmscs中，98％以上的细胞存活(图2b)。此外，发明人观察到，在长叶毛地黄苷与毛花苷c处理的hescs中，parp、凋亡蛋白酶-3、及凋亡蛋白酶-7的断裂型增加(图2c)。相反地，在以长叶毛地黄苷或毛花苷c处理的hbmmscs中，未检测到断裂型的凋亡标记(图2c)。除了诱导细胞死亡之外，其余hescs的致肿瘤潜力在细胞分化时被消除。在以长叶毛地黄苷或毛花苷c处理hescs12小时之后，nanog的蛋白量下调(图2d)。nanog为escs中核心转录调控网络的一部分。hesc中nanog的缺失可诱导胚外谱系分化37。据报告，nanog在hesc万能性与自我更新中扮演关键作用38。这些结果表明，强心苷类在hescs中诱导细胞死亡，而在hbmmscs中则无。

　　此外，进行阿拉马尔蓝(alamarblue)试验。长叶毛地黄苷、毛花苷c、前海葱苷原a、毛地黄毒苷、毛地黄毒配质、及乌巴苷以剂量依赖性方式诱导hescs细胞死亡(图12)。

　　2.3hbmmscs分化为三个谱系的分化能力不受长叶毛地黄苷或毛花苷c处理的影响

　　我们证实，强心苷类不影响hbmmscs的存活。mscs为多能性细胞，有望用于再生医学。mscs可特异性地诱导成为成骨细胞、脂肪细胞、及软骨细胞39。欲确定hbmmscs的分化能力是否受长叶毛地黄苷或毛花苷c的影响，发明人进行分化试验。在处理hbmmscs24小时后移除长叶毛地黄苷或毛花苷c，细胞分化成三个谱系。值得注意的是，长叶毛地黄苷与毛花苷c皆未影响hbmmscs分化成为成骨细胞(图3a)、脂肪细胞(图3b)、及软骨细胞(图3c)的能力。基于这些结果，强心苷类不影响hbmmscs的多能性。

　　2.4长叶毛地黄苷或毛花苷c在hesc衍生的mscs中不会诱导细胞毒性作用

　　欲进一步验证强心苷类在hescs与hesc衍生的细胞类型中的作用，发明人首先选择hesc衍生的mscs(hesc-mscs)做为模型。dr.xu和同事提供简单和快速的方法以用两步法诱导hescs成为hmscs30(图8a-图8c)。发明人分化h9hescs为mscs并检验强心苷类是否影响hesc-mscs的存活力。将hesc-mscs分别以长叶毛地黄苷和毛花苷c处理12小时和24小时。长叶毛地黄苷(2.5μm)或毛花苷c(2.5μm)都没有诱导h9hesc-mscs中的细胞死亡。为了调查强心苷类的细胞毒性作用，发明人测定以长叶毛地黄苷或毛花苷c处理h9hesc-mscs24小时后，培养物上清液中的ldh释放。长叶毛地黄苷与毛花苷c皆未影响h9hesc-mscs的存活(图4b)。除了长叶毛地黄苷与毛花苷c之外，发明人亦发现，蟾蜍灵或前海葱苷原a不会诱导细胞毒性(图8d)。此结果与hbmmscs中观察到的效果一致(图7)。

　　欲研究强心苷类是否在h9hesc-mscs中诱导细胞死亡，进行pi/膜联蛋白流式细胞术与西方墨点法分析。在以长叶毛地黄苷或毛花苷c处理hesc-mscs24小时之后，细胞死亡率小于2％(图4c)。一致地，在以长叶毛地黄苷或毛花苷c处理的hesc-mscs中未检测到断裂型的凋亡标记(图4d)。这些结果表明，强心苷类在h9hesc-mscs中不会诱导细胞死亡。此外，na+/k+-atpase在未分化的hescs中大量表现，但在hesc-msc中则无(图4e)，这可能证实强心苷类的毒性仅限于未分化的hescs。

　　2.5长叶毛地黄苷与毛花苷c在hpscs衍生的内皮细胞、神经元、或肝细胞内胚层中不会或轻微诱导细胞死亡

　　发明人接着测试长叶毛地黄苷与毛花苷c是否影响其他hpsc分化的细胞类型。cd34+/cd144+hipsc衍生的内皮细胞中胚层谱系是赠自dr.chiang及其同事(nationalchengkunguniversity，tainan，taiwan)(图9a)。未分化的hipscs与hipscs衍生的内皮细胞暴露于长叶毛地黄苷或毛花苷c中24小时。在处理后，长叶毛地黄苷与毛花苷c于hipscs中诱导细胞毒性(图9b)，但hipsc衍生的内皮细胞仍存活(图9c)。发明人将h9hescs分化成tuj1阳性神经元，其属于外胚层(图9d)，之后以长叶毛地黄苷或毛花苷c处理这些hesc神经元24小时。长叶毛地黄苷与毛花苷c在神经元细胞中不会诱导细胞毒性(图9e)。此外，发明人将hescs分化成表现afp的肝细胞内胚层，其属于内胚层(图9f)。结果显示，药物可轻微(若有的话)在肝细胞内胚层细胞中诱导任何细胞死亡(小于10％)(图9g)。基于上述结果，长叶毛地黄苷与毛花苷c可能在未分化的hpscs中特异性地诱导细胞死亡，但在其分化的子代中则无。

　　发明人亦测试其他强心苷类(包括乌巴苷、毛地黄毒苷、毛地黄毒配质、前海葱苷原a、及蟾蜍灵)对于未分化的万能性干细胞、hescs与hpscs、及各种分化的细胞(包括mscs、神经细胞、肝细胞内胚层细胞)的细胞毒性作用。结果总结如下。

　　表1

　　2.6长叶毛地黄苷与毛花苷c防止nsg小鼠的畸胎瘤形成

　　欲研究以强心苷类处理的hescs是否丧失形成畸胎瘤的能力，将dmso、长叶毛地黄苷、或毛花苷c处理的hescs单独移植至nsg小鼠中进行异种移植(xenograft)。发明人发现，强心苷药物治疗组的肿瘤重量明显减少(图5a与图5b)。因此，长叶毛地黄苷与毛花苷c严重阻止hescs中大部分的肿瘤形成能力。hescs以dmso、长叶毛地黄苷、或毛花苷c处理的畸胎瘤形成显示包含所有三个胚层(图5c与图10)。这些结果证实该些hescs的万能性。发明人证实，强心苷类有效地防止体内肿瘤形成。

　　最后，欲研究长叶毛地黄苷或毛花苷c处理的hbmmscs是否仍留在体内，发明人构筑了gfp过度表现的hbmmscs。过度表现gfp的hbmmscs在nsg小鼠肾囊下未形成肿瘤(图11a)。gfp-hbmmscs保留在移植位点，其可通过gfpihc染色观察到(图11a)。然后，将药物处理的hescs与hbmmscs的混合物注射至nsg小鼠肾囊下。长叶毛地黄苷或毛花苷c处理组(图11b)的肿瘤面积显著受抑制，且发明人仍观察到gfp阳性hbmmscs(图11c)。这些结果证实，长叶毛地黄苷与毛花苷c处理的hbmmscs保留在nsg小鼠肾囊下。

　　3.摘要与讨论

　　在细胞疗法中，留下的未分化escs或ipscs在其分化后代中会引发对使用psc衍生细胞的安全性疑虑(畸胎瘤)。未分化的pscs在最终分化时丧失致肿瘤能力。然而，留下的未分化pscs必须在应用于escs及ipscs细胞疗法之前移除40。在本研究中，发明人的数据证实强心苷类在hescs中的细胞毒性作用(图1b、图1c、图2a、图2c、图6、图12)。在hbmmscs中未观察到此现象(图1d、图1e、图2b、图2c)。最重要的是，这些药物不会影响干细胞的分化能力(图3)。强心苷类的类似效果显示在hesc衍生的子代中。hesc-mscs、hesc-神经元、及hipsc-内皮细胞的存活力亦不受长叶毛地黄苷与毛花苷c的影响(图4、图9)。此外，体内实验证实，长叶毛地黄苷与毛花苷c有效防止畸胎瘤形成(图5)。发明人的工作首次描述了强心苷类在hescs中的细胞毒性作用与肿瘤预防能力。长叶毛地黄苷与毛花苷c也是fda批准的第一个在hescs中具有细胞毒性的药物。

　　欲克服再生医学中形成畸胎瘤的风险，已提出数个策略41,42。抗体分选与细胞毒性抗体策略可能很简单，但由于单细胞分离需求或抗体批次变异，其效率受限7,17,18,43。这些方法的成本亦高。另一策略是基于可追踪靶细胞的基因操作10,12,44,45，但这些方法费力且昂贵。最重要的是，插入突变是临床使用上这些基因改变细胞的生物安全威胁42。化学消去法(chemicalablation)策略快速、稳健、及有效，且其亦为最具成本效益的方法。化学方法不需要细胞分选与任何基因操作。

　　除了小分子方法之外，一项研究还使用代谢选择(metabolicselection)富集psc衍生的心肌细胞13。作者提供一个有趣的方法，其以消耗葡萄糖与富含乳酸的培养条件，从pscs中纯化心肌细胞。此方法非常适合于产生高纯度的心肌细胞。然而，其他细胞类型可能需要更多测试，以确定细胞类型的特定代谢功用。此策略很有吸引力，但仅适用于极少数细胞类型。发明人以cg药物消除未分化的hescs，且这些药物不影响数种不同细胞类型(即mscs、内皮细胞、神经元)的存活力。由于cgs易于购买且成本划算，此方法对于将来的应用相当方便。长叶毛地黄苷与毛花苷c为有效的小分子，其抑制培养基中的致肿瘤性hescs，其结果如畸胎瘤形成试验所示(图5)。na+/k+-atpase次单元的表现量在癌症与正常细胞或组织之间各异23。此外，发明人的数据表明，na+/k+-atpase次单元的表现量在未分化与分化细胞之间亦不同(图1a、图4e)。在本研究中，发明人揭示强心苷类的新颖应用，其可通过防止畸胎瘤形成，改进hpscs细胞疗法的主要疑虑。

　　参考文献

　　1.ben-david,u.,kopper,o.&benvenisty,n.expandingtheboundariesofembryonicstemcells.cellstemcell10,666-677,doi:10.1016/j.stem.2012.05.003(2012).

　　2.knoepfler,p.s.deconstructingstemcelltumorigenicity:aroadmaptosaferegenerativemedicine.stemcells(dayton,ohio)27,1050-1056,doi:10.1002/stem.37(2009).

　　3.ben-david,u.&benvenisty,n.thetumorigenicityofhumanembryonicandinducedpluripotentstemcells.natrevcancer11,268-277,doi:10.1038/nrc3034(2011).

　　4.lee,a.s.etal.effectsofcellnumberonteratomaformationbyhumanembryonicstemcells.cellcycle8,2608-2612,doi:10.4161/cc.8.16.9353(2009).

　　5.tan,h.l.,fong,w.j.,lee,e.h.,yap,m.&choo,a.mab84,acytotoxicantibodythatkillsundifferentiatedhumanembryonicstemcellsviaoncosis.stemcells(dayton,ohio)27,1792-1801,doi:10.1002/stem.109(2009).

　　6.choo,a.b.etal.selectionagainstundifferentiatedhumanembryonicstemcellsbyacytotoxicantibodyrecognizingpodocalyxin-likeprotein-1.stemcells(dayton,ohio)26,1454-1463,doi:10.1634/stemcells.2007-0576(2008).

　　7.tang,c.etal.anantibodyagainstssea-5glycanonhumanpluripotentstemcellsenablesremovalofteratoma-formingcells.natbiotechnol29,829-834,doi:10.1038/nbt.1947(2011).

　　8.ben-david,u.,nudel,n.&benvenisty,n.immunologicandchemicaltargetingofthetight-junctionproteinclaudin-6eliminatestumorigenichumanpluripotentstemcells.natcommun4,1992,doi:10.1038/ncomms2992(2013).

　　9.fong,c.y.,peh,g.s.,gauthaman,k.&bongso,a.separationofssea-4andtra-1-60labelledundifferentiatedhumanembryonicstemcellsfromaheterogeneouscellpopulationusingmagnetic-activatedcellsorting(macs)andfluorescence-activatedcellsorting(facs).stemcellrev5,72-80,doi:10.1007/s12015-009-9054-4(2009).

　　10.blum,b.,bar-nur,o.,golan-lev,t.&benvenisty,n.theanti-apoptoticgenesurvivincontributestoteratomaformationbyhumanembryonicstemcells.natbiotechnol27,281-287,doi:10.1038/nbt.1527(2009).

　　11.menendez,s.etal.increaseddosageoftumorsuppressorslimitsthetumorigenicityofipscellswithoutaffectingtheirpluripotency.agingcell11,41-50,doi:10.1111/j.1474-9726.2011.00754.x(2012).

　　12.schuldiner,m.,itskovitz-eldor,j.&benvenisty,n.selectiveablationofhumanembryonicstemcellsexpressinga"suicide"gene.stemcells(dayton,ohio)21,257-265,doi:10.1634/stemcells.21-3-257(2003).

　　13.tohyama,s.etal.distinctmetabolicflowenableslarge-scalepurificationofmouseandhumanpluripotentstemcell-derivedcardiomyocytes.cellstemcell12,127-137,doi:10.1016/j.stem.2012.09.013(2013).

　　14.lee,m.o.etal.inhibitionofpluripotentstemcell-derivedteratomaformationbysmallmolecules.proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica110,e3281-3290,doi:10.1073/pnas.1303669110

　　(2013).

　　15.ben-david,u.etal.selectiveeliminationofhumanpluripotentstemcellsbyanoleatesynthesisinhibitordiscoveredinahigh-throughputscreen.cellstemcell12,167-179,doi:10.1016/j.stem.2012.11.015(2013).

　　16.dabir,d.v.etal.asmallmoleculeinhibitorofredox-regulatedproteintranslocationintomitochondria.developmentalcell25,81-92,doi:10.1016/j.devcel.2013.03.006(2013).

　　17.baker,m.reproducibilitycrisis:blameitontheantibodies.nature521,274-276,doi:10.1038/521274a(2015).

　　18.prassas,i.&diamandis,e.p.translationalresearchersbeware！unreliablecommercialimmunoassays(elisas)canjeopardizeyourresearch.clinchemlabmed52,765-766,doi:10.1515/cclm-2013-1078(2014).

　　19.egelhofer,t.a.etal.anassessmentofhistone-modificationantibodyquality.natstructmolbiol18,91-93,doi:10.1038/nsmb.1972(2011).

　　20.michel,m.c.,wieland,t.&tsujimoto,g.howreliableareg-protein-coupledreceptorantibodies？naunyn-schmiedeberg'sarchivesofpharmacology379,385-388,doi:10.1007/s00210-009-0395-y(2009).

　　21.blum,b.&benvenisty,n.thetumorigenicityofhumanembryonicstemcells.advcancerres100,133-158,doi:10.1016/s0065-230x(08)00005-5(2008).

　　22.richards,m.etal.anewclassofpluripotentstemcellcytotoxicsmallmolecules.plosone9,e85039,doi:10.1371/journal.pone.0085039(2014).

　　23.prassas,i.&diamandis,e.p.noveltherapeuticapplicationsofcardiacglycosides.natrevdrugdiscov7,926-935,doi:10.1038/nrd2682(2008).

　　24.gheorghiade,m.,adams,k.f.,jr.&colucci,w.s.digoxininthemanagementofcardiovasculardisorders.circulation109,2959-2964,doi:10.1161/01.cir.0000132482.95686.87(2004).

　　25.mijatovic,t.etal.cardiotonicsteroidsontheroadtoanti-cancertherapy.biochimbiophysacta1776,32-57,doi:10.1016/j.bbcan.2007.06.002(2007).

　　26.diederich,m.,muller,f.&cerella,c.cardiacglycosides:frommoleculartargetstoimmunogeniccelldeath.biochempharmacol,doi:10.1016/j.bcp.2016.08.017(2016).

　　27.thomson,j.a.etal.embryonicstemcelllinesderivedfromhumanblastocysts.science282,1145-1147(1998).

　　28.cowan,c.a.etal.derivationofembryonicstem-celllinesfromhumanblastocysts.nengljmed350,1353-1356,doi:10.1056/nejmsr040330(2004).

　　29.wang,c.h.etal.ashrnafunctionalscreenrevealsnme6andnme7arecrucialforembryonicstemcellrenewal.stemcells(dayton,ohio)30,2199-2211,doi:10.1002/stem.1203(2012).

　　30.wang,x.etal.immunemodulatorymesenchymalstemcellsderivedfromhumanembryonicstemcellsthroughatrophoblast-likestage.stemcells(dayton,ohio)34,380-391,doi:10.1002/stem.2242(2016).

　　31.lai,p.l.etal.efficientgenerationofchemicallyinducedmesenchymalstemcellsfromhumandermalfibroblasts.scirep7,44534,doi:10.1038/srep44534(2017).

　　32.hentze,h.etal.teratomaformationbyhumanembryonicstemcells:evaluationofessentialparametersforfuturesafetystudies.stemcellres2,198-210,doi:10.1016/j.scr.2009.02.002(2009).

　　33.fischer,a.h.,jacobson,k.a.,rose,j.&zeller,r.hematoxylinandeosinstainingoftissueandcellsections.cshprotoc2008,pdbprot4986,doi:10.1101/pdb.prot4986(2008).

　　34.wu,y.t.etal.definingminimumessentialfactorstoderivehighlypurehumanendothelialcellsfromips/escellsinananimalsubstance-freesystem.scirep5,1-9,doi:10.1038/srep09718(2015).

　　35.wen,z.etal.synapticdysregulationinahumanipscellmodelofmentaldisorders.nature515,414-418,doi:10.1038/nature13716(2014).

　　36.hannan,n.r.,segeritz,c.p.,touboul,t.&vallier,l.productionofhepatocyte-likecellsfromhumanpluripotentstemcells.natprotoc8,430-437(2013).

　　37.hyslop,l.etal.downregulationofnanoginducesdifferentiationofhumanembryonicstemcellstoextraembryoniclineages.stemcells(dayton,ohio)23,1035-1043,doi:10.1634/stemcells.2005-0080(2005).

　　38.wang,z.,oron,e.,nelson,b.,razis,s.&ivanova,n.distinctlineagespecificationrolesfornanog,oct4,andsox2inhumanembryonicstemcells.cellstemcell10,440-454,doi:10.1016/j.stem.2012.02.016(2012).

　　39.pittenger,m.f.etal.multilineagepotentialofadulthumanmesenchymalstemcells.science284,143-147(1999).

　　40.nishikawa,s.,goldstein,r.a.&nierras,c.r.thepromiseofhumaninducedpluripotentstemcellsforresearchandtherapy.natrevmolcellbiol9,725-729,doi:10.1038/nrm2466(2008).

　　41.ben-david,u.&benvenisty,n.chemicalablationoftumor-initiatinghumanpluripotentstemcells.natprotoc9,729-740,doi:10.1038/nprot.2014.050(2014).

　　42.rashin,m.,amir,a.h.&javad,v.a.a.,s.-h.safetransplantationofpluripotentstemcellbypreventingteratomaformation.journalofstemcellresearch&therapy4,doi:10.4172/2157-7633.1000212(2014).

　　43.schriebl,k.etal.selectiveremovalofundifferentiatedhumanembryonicstemcellsusingmagneticactivatedcellsortingfollowedbyacytotoxicantibody.tissueengparta18,899-909,doi:10.1089/ten.tea.2011.0311(2012).

　　44.chung,s.etal.geneticselectionofsox1gfp-expressingneuralprecursorsremovesresidualtumorigenicpluripotentstemcellsandattenuatestumorformationaftertransplantation.jneurochem97,1467-1480,doi:10.1111/j.1471-4159.2006.03841.x(2006).

　　45.huber,i.etal.identificationandselectionofcardiomyocytesduringhumanembryonicstemcelldifferentiation.fasebj21,2551-2563,doi:10.1096/fj.05-5711com(2007).