多肽融合蛋白CP13138P及其在结核病预防中的应用的制作方法

　　多肽融合蛋白cp13138p及其在结核病预防中的应用技术领域1.本发明属于免疫学领域，涉及多肽融合蛋白cp13138p及其在结核病预防中的应用，具体涉及源自于结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis，mtb)蛋白抗原的cp13138p重组多表位抗原及其在活动性结核和潜伏性结核感染的预防中的应用。背景技术：2.结核病(tuberculosis，tb)是由结核分枝杆菌(mycobacteria tuberculosis，mtb)感染引起的一种慢性传染病，通过呼吸道传播，各个脏器均可受累，以肺结核最常见。结核分枝杆菌感染分为潜伏性结核病感染(latent tuberculosis infection，ltbi)与活动性结核病(active tuberculosis，atb)两种状态。mtb俗称结核杆菌(tubercle bacillus)，属于放线菌目分枝杆菌科分枝杆菌属，是一种细胞内寄生虫，主要通过攻击巨噬细胞并抑制其凋亡来引起长期感染。3.疫苗接种是预防和控制结核病最有效的方式。卡介苗(bacillus calmette-guerin，bcg)是唯一获得批准的结核病疫苗，对儿童粟粒性肺结核和结核性脑膜炎具有极好的保护作用。但其对成人结核病的防御效能很差(防御作用0％～80％)，保护期仅维持10～20年，对于有免疫缺陷的病人，bcg接种还有可能导致结核的全身播散。在临床试验中评价的结核病候选疫苗可分为四类：灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位结核病疫苗和基于病毒载体的结核病疫苗。目前，备受期待的亚单位疫苗m72/as01e已完成二期临床试验。然而，2019年《新英格兰医学杂志》(new england journal of medicine)发布了m72/as01e疫苗在2b期临床试验(共纳入3500名10～50岁成人)中的最终数据，表明在3年随访后36个月时，m72/as01e的疫苗总体效力为49.7％(95％ci 2.1～74.2)，低于who 50％保护效力阈值。因此，加快研制和开发新型有效、安全、覆盖人群更广的结核病疫苗对于保障公共健康和控制结核病传播具有重要的意义。4.随着免疫信息学和生物信息学的快速发展，多肽疫苗已成为最具吸引力的疫苗开发策略之一。通过低成本生产技术，从结核分枝杆菌(mtb)抗原中鉴定出的肽可以准确地表征为化学实体(类似于经典药物)。此外，多肽是化学定义的化合物，具有良好的稳定性。肽的优良性质奠定了肽疫苗易于运输和保存的优势。此外，由于缺乏冗余元素，可以克服传统疫苗的一些缺点，如过敏和自身免疫反应。作为基于信息学和现代免疫学的交叉学科，免疫信息学的出现导致了疫苗研发模式的改变，推动了新型结核病疫苗领域的研究步伐。利用生物信息学工具，研究人员可以快速、准确地处理免疫研究过程中产生的大量数据，大大缩短了多肽疫苗研发的时间，降低研发成本，为全球疾病患者带来新的希望。技术实现要素：5.本发明的目的是提供一种多肽融合蛋白及其在预防结核病中的应用。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。6.为了实现上述目的，本发明首先提供了融合蛋白，命名可为cp13138p，所述融合蛋白可包括串联多肽1、串联多肽2和串联多肽3，所述串联多肽1可包括氨基酸序列是seq id no.1的第134-151位、第157-173位、第179-191位、第197-210位、第216-233位、第239-255位、第261-276位、第282-299位、第305-320位、第326-343位、第349-364位、第370-383位和第389-404位所示的多肽；7.所述串联多肽2可包括氨基酸序列是seq id no.1的第408-416位、第420-428位、第432-440位、第444-452位、第456-464位、第468-476位、第480-488位、第492-501位、第505-513位、第517-525位、第529-538位、第542-550位和第554-563位所示的多肽；8.所述串联多肽3可包括氨基酸序列是seq id no.1的第566-585位、第588-607位、第610-629位、第632-651位、第654-673位、第676-695位、第698-717位和第720-739位所示的多肽。9.进一步地，所述多肽之间可由氨基酸连接子连接。10.所述串联多肽1可为串联的htl表位，由13个htl表位(氨基酸序列分别为seq id no.1的第134-151位、第157-173位、第179-191位、第197-210位、第216-233位、第239-255位、第261-276位、第282-299位、第305-320位、第326-343位、第349-364位、第370-383位和第389-404位)串联而得，具体地，13个htl表位之间可用氨基酸连接子(如gpgpg)进行串联连接，所述串联多肽1的氨基酸序列具体可为seq id no.1的第134-404位。11.所述串联多肽2可为串联的ctl表位，由13个ctl表位(氨基酸序列分别为seq id no.1的第408-416位、第420-428位、第432-440位、第444-452位、第456-464位、第468-476位、第480-488位、第492-501位、第505-513位、第517-525位、第529-538位、第542-550位和第554-563位)串联而得，具体地，13个ctl表位之间可用氨基酸连接子(如aay)进行串联连接，所述串联多肽2的氨基酸序列具体可为seq id no.1的第408-563位。12.所述串联多肽3可为串联的b细胞表位，由8个b细胞表位(氨基酸序列分别为seq id no.1的第566-585位、第588-607位、第610-629位、第632-651位、第654-673位、第676-695位、第698-717位和第720-739位)串联而得，具体地，8个b细胞表位之间可用氨基酸连接子(如kk)进行串联连接，所述串联多肽3的氨基酸序列具体可为seq id no.1的第566-739位。13.将串联多肽1(串联的htl表位)、串联多肽2(串联的ctl表位)和串联多肽3(串联的b细胞表位)通过氨基酸连接子连接，得到多表位融合蛋白，该多表位融合蛋白即可作为活性成分用于构建疫苗分子。14.进一步地，所述融合蛋白从n端至c端依次可为所述串联多肽1、所述串联多肽2和所述串联多肽3。15.进一步地，所述串联多肽之间可由氨基酸连接子连接。16.进一步地，所述融合蛋白从n端至c端依次可为所述串联多肽1、氨基酸连接子、所述串联多肽2、氨基酸连接子和所述串联多肽3，具体地，所述融合蛋白从n端至c端依次可为所述串联多肽1、aay、所述串联多肽2、kk和所述串联多肽3。17.进一步地，所述融合蛋白还可包括佐剂肽和/或辅助肽，优选地，所述融合蛋白还可包括氨基酸序列是seq id no.1的第1-104位的佐剂肽1(ctb)、氨基酸序列是seq id no.1的第745-765位的佐剂肽2(pam2cys)和/或氨基酸序列是seq id no.1的第110-128位的辅助肽(padre)。18.所述佐剂肽可为tlr4激动剂霍乱毒素b亚单位(ctb，cholera toxin subunit b)或tlr2激动剂pam2cys，所述辅助肽可为padre。19.具体地，所述佐剂肽1可为ctb，所述佐剂肽2可为pam2cys。20.所述佐剂肽1(ctb)的氨基酸序列可为seq id no.1的第1-104位，所述佐剂肽2(pam2cys)的氨基酸序列可为seq id no.1的第745-765位，所述辅助肽(padre)的氨基酸序列可为seq id no.1的第110-128位。21.进一步地，所述融合蛋白从n端至c端依次可为所述佐剂肽1、所述辅助肽、所述串联多肽1、所述串联多肽2、所述串联多肽3和所述佐剂肽2。22.进一步地，所述融合蛋白从n端至c端依次可为所述佐剂肽1、氨基酸连接子、所述辅助肽、氨基酸连接子、所述串联多肽1、氨基酸连接子、所述串联多肽2、氨基酸连接子、所述串联多肽3、氨基酸连接子和所述佐剂肽2。23.具体地，所述融合蛋白从n端至c端依次可为所述佐剂肽1、eaaak、所述辅助肽、gpgpg、所述串联多肽1、aay、所述串联多肽2、kk、所述串联多肽3、eaaak和所述佐剂肽2。24.本领域技术人员熟知，氨基酸连接子(也称为间隔子、连接子)是存在于一种融合蛋白中的多肽之间的短肽序列，用连接子连接不同表位的目的是为了防止两个表位连接处形成新的表位，保护天然表位的结构和功能，因此任何能实现这一目的的连接子均可用来连接本发明所述的表位。25.本文所述氨基酸连接子包括但不限于eaaak、gpgpg、aay、kk、kkk、gggsggg、ggssgg、gsgsgsg、gsgsg、ggggs和gsg。26.在本发明的一个实施方案中，所述融合蛋白包括tlr4激动剂ctb、辅助肽padre、13个htl表位、13个ctl表位、8个b细胞表位、tlr2激动剂pam2cys和6×his标签。27.进一步地，所述融合蛋白cp13138p可为下述任一种：28.a1)氨基酸序列是seq id no.1的第1-765位的蛋白质；29.a2)将seq id no.1的第1-765位所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与a1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；30.a3)在a1)或a2)的n端和/或c端连接标签或信号肽得到的具有相同功能的融合蛋白质；31.a4)氨基酸序列是seq id no.1的第134-739位的蛋白质；32.a5)将seq id no.1的第134-739位所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与a1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；33.a6)在a4)或a5)的n端和/或c端连接标签或信号肽得到的具有相同功能的融合蛋白质。34.a1)所述蛋白质可为不包括his标签的融合蛋白(即：所述佐剂肽1-eaaak-所述辅助肽-gpgpg-所述串联多肽1-aay-所述串联多肽2-kk-所述串联多肽3-eaaak和所述佐剂肽2)。35.a4)所述蛋白质可为多表位融合蛋白(即：所述串联的htl表位-aay-所述串联的ctl表位-kk-所述串联的b细胞表位)。36.a3)所述融合蛋白质可为在a1)的c端连接his标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。37.进一步地，a3)所述融合蛋白质可为氨基酸序列是seq id no.1的蛋白质或将seq id no.1所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与seq id no.1所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质。38.本文所述取代可为保守性取代(也称为保守性替换)或非核心功能区的非保守性取代。本领域技术人员所公知，保守性取代或是在非核心功能区进行非保守取代，对蛋白质的功能通常不会产生质的影响。39.本文所述标签包括但不限于：gst(谷胱甘肽巯基转移酶)标签蛋白、his标签蛋白(his-tag)、mbp(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白、flag标签蛋白、sumo标签蛋白、ha标签蛋白、myc标签蛋白、egfp(增强型绿色荧光蛋白)、ecfp(增强型青色荧光蛋白)、eyfp(增强型黄绿色荧光蛋白)、mcherry(单体红色荧光蛋白)或avitag标签蛋白。40.本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索以对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。41.本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。42.本发明还提供了生物材料，所述生物材料可为下述任一种：43.d1)编码文本中任一所述融合蛋白cp13138p的核酸分子；44.d2)含有d1)所述核酸分子的表达盒；45.d3)含有d1)所述核酸分子的重组载体、或含有d2)所述表达盒的重组载体；46.d4)含有d1所述核酸分子的重组微生物、或含有d2)所述表达盒的重组微生物、或含有d3)所述重组载体的重组微生物；47.d5)含有d1)所述核酸分子的重组宿主细胞、或含有d2)所述表达盒的重组宿主细胞、或含有d3)所述重组载体的重组宿主细胞。48.上述生物材料中，d1)所述核酸分子可为下述任一种：49.b1)编码序列是seq id no.2、seq id no.2的第1-2295位或seq id no.2的第400-2217位的dna分子；50.b2)核苷酸序列是seq id no.2、seq id no.2的第1-2295位或seq id no.2的第400-2217位的dna分子。51.进一步地，d2)所述表达盒、d3)所述重组载体、d4)所述重组微生物和d5)所述重组宿主细胞均可表达d1)所述核酸分子。52.seq id no.2所示的dna分子可为编码氨基酸序列是seq id no.1所示融合蛋白cp13138p的dna分子。53.seq id no.2的第1-2295位所示的dna分子可为编码氨基酸序列是seq id no.1的第1-765位所示融合蛋白cp13138p的dna分子。54.seq id no.2的第400-2217位所示的dna分子可为编码氨基酸序列是seq idno.1的第134-739位所示融合蛋白cp13138p的dna分子。55.所述核酸分子还可包括在seq id no.2、seq id no.2的第1-2295位或seq idno.2的第400-2217位所示核苷酸序列基础上经密码子偏好性改造得到的核酸分子。考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。56.本文所述载体是指能够把外源dna或目的基因运载进入宿主细胞进行扩增和表达的载体，所述载体可以是克隆载体也可以是表达载体，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或m13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、ti质粒、病毒载体(如逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒等)。在本发明的一个或多个实施方案中，所述载体为载体pet-28a(+)。57.本文所述微生物可为细菌、真菌、放线菌、原生动物、藻类或病毒。其中，所述细菌可来自埃希氏菌属(escherichia sp.)、欧文氏菌属(erwinia sp.)、土壤杆菌属(agrobacterium sp.)、黄杆菌属(flavobacterium sp.)、产碱菌属(alcaligenes sp.)、假单胞菌属(pseudomonas sp.)、芽胞杆菌属(bacillus sp.)等但不限于此，例如所述细菌可为大肠杆菌(escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)或短小芽孢杆菌(bacillus pumilus)。在本发明的一个或多个实施方案中，所述微生物为大肠杆菌bl21(de3)。58.本文所述宿主细胞(也称为受体细胞)可为植物细胞或动物细胞。所述宿主细胞可理解为不仅是指特定的受体细胞，而且也指这种细胞的后代，且由于天然的、偶然的或有意的突变和/或改变，该子代可以不必与原始的亲代细胞完全一致，但仍包括在宿主细胞的范围中。合适的宿主细胞为本领域已知的。59.本文所述重组载体是指将外源目的基因与载体在体外连接构建而成的重组体dna分子，可以任何合适的方式构建，只要构建的重组载体可携带外源目的基因进入受体细胞、并为外源目的基因提供在受体细胞的复制、整合、扩增和/或表达能力即可。60.d3)所述重组载体可为pet-28a(+)-cp13138p。61.重组载体pet-28a(+)-cp13138p是将pet-28a(+)载体的bamhi和xhoi识别位点间的片段(小片段)替换为核苷酸序列是序列表中seq id no.2的dna片段，保持pet-28a(+)载体的其他核苷酸序列不变，得到的重组表达载体。重组载体pet-28a(+)-cp13138p表达氨基酸序列如seq id no.1所示的融合蛋白cp13138p。62.d4)所述重组微生物可为bl21/pet-28a(+)-cp13138p。所述bl21/pet-28a(+)-cp13138p是将所述重组载体pet-28a(+)-cp13138p导入大肠杆菌bl21(de3)得到的重组微生物。63.所述导入可为通过化学转化法(如ca2+诱导的转化法、聚乙二醇介导的转化法或金属阳离子介导的转化法)或电穿孔转化法等任何已知的转化方法将携带本发明dna分子的载体转化宿主菌；也可为通过噬菌体转导的方法将本发明dna分子转导进入宿主菌。所述导入还可为通过磷酸钙共沉淀法、脂质体介导法、电穿孔法或病毒载体法等任何已知的转染方法将携带本发明dna分子的载体转染宿主细胞。64.本发明还提供了本文中任一所述融合蛋白，和/或，所述生物材料的下述任一种应用：65.c1)在制备用于预防和/或治疗结核分枝杆菌感染引起的疾病的产品中的应用；66.c2)在制备预防结核分枝杆菌感染引起的疾病的疫苗中的应用；67.c3)在制备针对结核分枝杆菌的保护性抗原中的应用；68.c4)在筛选和/或开发结核分枝杆菌抗体中的应用。69.进一步地，所述产品可为试剂或药物。70.所述保护性抗原是指结核分枝杆菌能刺激机体发生保护性免疫应答的抗原成分。71.所述结核分枝杆菌抗体可包括全长抗体或抗原结合片段(如fab片段、fv片段、fab′片段、f(ab′)2片段、单链抗体(scfv)、纳米抗体(单域抗体)、双特异性抗体或最小识别单位(mru)等但不限于此)。72.本发明还提供了用于预防和/或治疗结核分枝杆菌感染引起的疾病的产品，所述产品包括本文中任一所述的融合蛋白。73.进一步地，所述产品可为疫苗或药物组合物。74.所述疫苗可用于预防结核分枝杆菌感染。75.所述疫苗的活性成分可包括本文中任一所述的融合蛋白。76.所述疫苗还可包括佐剂(adjuvant)和/或疫苗递送系统(vaccine delivery system)。77.所述佐剂可为一种可以刺激机体产生针对与其一同接种的抗原更强烈体液和/或细胞免疫应答的物质。本文所述佐剂可以是本领域技术人员公知的，包括但不限于：植物佐剂(如烷基胺、酚类成分、奎宁、皂角素、倍半萜、蛋白质、多肽、多糖、糖脂、植物血凝素等)、细菌佐剂(如霍乱毒素、大肠埃希菌不耐热毒素、细菌脂多糖等)、铝佐剂及其他无机成分佐剂(如钙佐剂)、细胞因子和核酸佐剂(如单核细胞克隆刺激因子、白细胞因子il-1、il-2、il-4、il-5、il-6、ifn-γ、cpg基序、核酸载体等)、乳剂佐剂(如弗氏佐剂)。所述佐剂可为药学上可以接受的佐剂。78.所述疫苗递送系统可为一类能够将抗原物质携带至机体的免疫系统，并在其中较长时间存储和发挥其抗原作用的物质。本文所述疫苗递送系统可为吕盐凝胶佐剂疫苗递送系统、乳剂佐剂疫苗递送系统、脂质体佐剂疫苗递送系统或纳米佐剂疫苗递送系统。79.所述药物组合物的活性成分可包括本文中任一所述融合蛋白。80.所述药物组合物还可包括一种或者是多种药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体可为稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂但不限于此。81.进一步地，本文所述结核分枝杆菌感染引起的疾病可为结核病。82.进一步地，所述结核病可包括活动性结核病(active tuberculosis，atb)和潜伏性结核感染(latent tuberculosis infection，ltbi)。83.本发明还提供了本文中任一所述融合蛋白的制备方法，所述制备方法可包括使编码本文中任一所述融合蛋白的核酸分子在微生物或宿主细胞中进行表达得到所述融合蛋白。84.进一步地，所述方法可包括如下步骤：85.g1)构建含有编码本文中任一所述融合蛋白的核酸分子的重组表达载体；86.g2)将所述重组表达载体导入微生物，得到重组微生物；87.g3)培养所述重组微生物，经分离和/或纯化得到所述融合蛋白；88.进一步地，g1)中所述核酸分子可为seq id no.2、seq id no.2的第1-2295位或seq id no.2的第400-2217位所示的dna分子。89.进一步地，所述微生物可为大肠杆菌bl21(de3)。90.本发明的发明人通过生物信息学和免疫信息学技术预测和筛选出了针对结核分枝杆菌的htl、ctl和b细胞表位，这些表位具有很好的免疫原性和抗原性且无毒性无致敏性，具有人口覆盖率高等特点。在此基础上，发明人在表位疫苗设计中加入了辅助肽padre来进一步提高表位疫苗分子的免疫原性，加入tlr4激动剂ctb和tlr2激动剂pam2cys赋予疫苗分子靶向递送的功能。进一步通过免疫信息学工具对该疫苗的抗原性、免疫原性、理化参数、二级结构、三级结构、免疫刺激等进行了预测和分析。结果表明，本发明所提供的多肽融合蛋白cp13138p是一个包含771个氨基酸的表位疫苗，其分子量为77.5kda，理论pi值为9.78，不稳定性指数和脂肪族氨基酸指数分别为31.03(《40为稳定，》40不稳定)和77.37(有助于提高热稳定性)，亲水性gravy值为0.048。此外，本发明还发现cp13138p表位疫苗在哺乳动物细胞内的半衰期超过30小时，在酵母和大肠杆菌体内的半衰期分别超过了20小时和10小时。cp13138p与tlr2和tlr4的结合能分别为-1313.3kcal/mol和-1255.1kcal/mol。91.本发明进一步制备了融合蛋白cp13138p，通过酶联免疫斑点试验(elispot)和35种细胞因子检测实验分析免疫信息学和真实世界实验结果的一致性，免疫信息学和真实世界实验结果均表明，多肽融合蛋白cp13138p可诱导机体产生以ifn-γ、il-10和il-2等细胞因子水平显著升高为特征的固有免疫和适应性免疫应答。同时体外实验结果证明了结核分枝杆菌的多肽融合蛋白cp13138p可以作为一种抗原蛋白，能够刺激人外周血单个核细胞(pbmcs)产生免疫应答，是一种优势保护性抗原，本发明可为结核病疫苗的开发提供新的候选疫苗。92.本发明多肽融合蛋白cp13138p可通过基因工程制备，用多肽融合蛋白cp13138p作为疫苗，与菌体蛋白疫苗相比，具有制备方法简单、成本低、产量高、更安全等优点。本发明对于活动性结核和结核潜伏感染的防疫和治疗具有重大价值。附图说明93.图1为实施例1中筛选的最终用于构建多肽融合蛋白的htl表位信息。94.图2为实施例1中筛选的最终用于构建多肽融合蛋白的ctl表位信息。95.图3为实施例1中筛选的最终用于构建多肽融合蛋白的b细胞表位信息。96.图4为cp13138p疫苗的构建示意图。97.图5为cp13138p疫苗的二级结构预测结果。98.图6cp13138p疫苗与toll样受体2(tlr2)的相互作用示意图。99.图7为cp13138p疫苗与toll样受体4(tlr4)的相互作用示意图。100.图8为c-immsim server对细胞毒性t(tc)细胞、巨噬细胞(ma)、树突状细胞(dc)和自然杀伤(nk)细胞的预测结果。101.图9为c-immsim server对辅助性t(th)细胞、plb细胞、b细胞和抗体的预测结果。102.图10为重组载体pet-28a(+)-cp13138p构建示意图。103.图11为cp13138p疫苗在c-immsim server上诱导的细胞因子水平。在c-immsim server中模拟cp13138p疫苗3次注射，分析cp13138p疫苗诱导的ifn-γ、il-4、il-12、tgf-β、tnf-α、il-10、il-6、ifn-β、il-18、il-23和il-2细胞因子水平。细胞因子浓度以ng/ml表示。104.图12为酶联免疫斑点法(elispot)检测ifn-γ+t淋巴细胞。使用cp13138p疫苗体外刺激健康对照(hc)、潜伏性结核感染(ltbi)和活动性结核(atb)患者的外周血单个核细胞(pbmc)。采用人elispot试剂盒检测ifn-γ+t淋巴细胞的斑点形成细胞(sfc)。根据正态性对数据进行非配对t检验或mann-whitney检验。数据以均值+sem表示。p《0.05为差异有统计学意义。sem，均值的标准误差。105.图13为cp13138p疫苗诱导人外周血单个核细胞(pbmcs)产生的细胞因子水平。采用人35种细胞因子检测试剂盒检测g-csf、gm-csf、hgf、ifn-alpha、ifn gamma、il-1alpha、il-1beta、il-10、il-12p70、il-13、il-17f、il-2、il-21、il-22、il-23、il-3、il-31、il-4、il-5、il-6、il-8、il-9、ip-10、mcp-1、mcp-3、mig、mip-1alpha、mip-1beta、pd-1、sdf-1alpha、tim-3、timp-1、tnf alpha、vegf-a和vegf-r2细胞因子水平。用cp13138p疫苗体外刺激健康对照者(hc，n＝7)、潜伏性结核感染者(ltbi，n＝8)和活动性结核患者(atb，n＝7)的pbmcs。另外，用aim培养基刺激hcs的pbmcs作为阴性对照。根据数据正态性和方差齐性，采用单因素方差分析或kruskal-wallis检验进行差异比较。所有数据均显示为均值+sem。p《0.05为差异有统计学意义。sem，均值的标准误差。具体实施方式106.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。107.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。108.下述实施例中的大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞购自上海晶诺生物科技有限公司。109.下述实施例中的载体pet-28a(+)购自novagen公司。110.下述实施例中主要试剂的配制方法如下：111.1、lb液体培养基的配制(1000ml)：[0112][0113]加去离子水定容至1000ml，121℃，15min高压灭菌。[0114]2、lb固体培养基的配制(1000ml)：[0115][0116][0117]加去离子水定容至1000ml，121℃，15min高压灭菌。[0118]3、可溶性表达形式目的蛋白纯化所需缓冲液的配制：[0119](1)可溶性蛋白裂解缓冲液ph 8.0(1000ml)：[0120][0121]用去离子水溶解并定容到1000ml，naoh调节ph至8.0。[0122](2)包涵体表达形式目的蛋白纯化所需缓冲液的配制：[0123]①包涵体蛋白裂解缓冲液ph 8.0(1000ml)：[0124][0125]用去离子水溶解并定容到1000ml，naoh调节ph至8.0。[0126]②包涵体蛋白洗涤缓冲液ph 6.3(1000ml)：[0127][0128]用去离子水溶解并定容到1000ml，naoh调节ph至6.3。[0129]③包涵体蛋白洗脱缓冲液ph 4.5(1000ml)：[0130][0131]用去离子水溶解并定容到1000ml，naoh调节ph至4.5。[0132]实施例1、mtb免疫优势表位的预测、筛选和确定[0133]1、htl表位预测及筛选[0134]采用iedb中的主要组织相容性复合体(mhc)ii服务器(http://tools.iedb.org/mhcii/)进行htl表位预测。参数设置：采用iedb推荐的2.22作为预测方法；物种选择人类；mhc等位基因选择人类白细胞抗原(hla)总参考集(hla-dr，hla-dp，hla-dq)；表位长度设置为15。纳入标准：htl表位百分位数排名《0.5；通过与swissprot数据库中500万个15-mers(长度为15个氨基酸的肽段)的比较，获得肽分(与mhc ii结合的表位分数越低表示亲和力越高)，通过与swissprot数据库中500万个15-mers的比较，获得百分位数排名《0.5。vaxijen v2.0(http://www.ddg-pharmfac.net/vaxijen/vaxijen/vaxijen.html)用于预测表位抗原性，阈值为0.4。自动交叉协方差(acc)被用来转换选择目标，并预测对特定抗原具有保护性的概率。最后，ifn-γ表位服务器(http://crdd.osdd.net/raghava/ifnepitope/index.php)被用来预测表位的ifn-γ诱导性(阴性/阳性，诱导ifn-γ的阳性结果意味着该表位可以被进一步研究)。通过上述的预测及筛选，最终筛选得到13个htl免疫优势表位，被确定为构建疫苗分子的候选表位，具体表位序列等信息详见图1，其中aller fp*(即allergen fp v.1.0)用来预测致敏性。1表示具有致敏性，2表示无致敏性。toxin pred*表示毒性预测，1表示具有毒性，2表示无毒性。[0135]2、ctl表位预测及筛选[0136]iedb mhc i服务器(http://tools.iedb.org/mhci/)被用来预测ctl表位。iedb建议2020.09(netmhcpanel4.1)是主要限定条件，人类hla等位基因的所有长度的表位是次要限定条件。百分位数《0.5的表位有资格进入下一步的分析。然后，i类免疫原性服务器(http://tools.iedb.org/immunogenicity/)被用来分析这些ctl表位的免疫原性，百分位数水平《0.5和免疫分数》0的表位被选入下一步骤。最后，vaxijen v2.0服务器被用来预测抗原性，阈值为0.4。通过上述的预测及筛选，最终筛选得到13个ctl免疫优势表位，被确定为构建疫苗分子的候选表位，具体表位序列等信息详见图2，其中aller fp*(即allergen fp v.1.0)用来预测致敏性。1表示具有致敏性，2表示无致敏性。toxin pred*表示毒性预测，1表示具有毒性，2表示无毒性。[0137]3、b细胞表位的预测及筛选[0138]b细胞在宿主对抗各种病毒的过程中发挥着重要作用。由于abcpred服务器(https://webs.iiitd.edu.in/raghava/abcpred/abc_submission.html)具有较高的准确性(65.93％)，所以被用来预测线性b细胞表位。表位长度被限制在20个，过滤阈值保持在默认的0.51(更高的阈值意味着更高的特异性，但灵敏度较低)。通过上述的预测及筛选，最终筛选得到8个b细胞表位，被确定为构建疫苗分子的候选表位，具体表位序列等信息详见图3，其中aller fp*(即allergen fp v.1.0)用来预测致敏性。1表示具有致敏性，2表示无致敏性。toxin pred*表示毒性预测，1表示具有毒性，2表示无毒性。[0139]最终筛选确定了用于构建疫苗分子活性成分(多肽融合蛋白)的13个htl表位、13个ctl表位和8个b细胞表位，共34个表位。34个表位的氨基酸序列如表1所示：[0140]表1、最终筛选确定的34个免疫优势表位序列[0141][0142][0143]实施例2、多肽融合蛋白的构建、理化特性及结构解析[0144]1、人群覆盖率和多肽融合蛋白的构建[0145]基于上述生物信息学工具预测和筛选的htl、ctl和b细胞表位，最终选择adjusted rank、抗原性和ifn-γ评分最高、无毒性和无致敏性的htl表位，adjusted rank、免疫原性和抗原性评分最高、无毒性和无致敏性的ctl表位以及预测分数最高的b细胞表位(共34个表位)构建多肽融合蛋白(如cp13138p，由cp13138p作为活性成分的疫苗称为cp13138p疫苗)。使用iedb数据库(http://tools.iedb.org/population/)中的population coverage工具对所选的免疫优势htl和ctl表位进行人群覆盖率分析。iedb数据库中使用的hla等位基因基因型频率来自等位基因频率数据库(http://www.allelefrequencies.net/)。该数据库提供了分为16个地理区域的115个国家和21个种族的等位基因频率。表位疫苗与其它传统疫苗最大的区别在于其具有mhc限制性。因此，表位的人群覆盖率高低直接决定着疫苗在全球的推广使用。cp13138p疫苗所包含的13个htl表位和13个ctl表位全球人群mhc i类no.1的第110-128位)，以增强疫苗分子的免疫原性。[0155]最后，在氨基酸序列的末端添加了一个6-his标签用于蛋白的纯化。[0156]最终构建的多肽融合蛋白命名为cp13138p(图4)，多肽融合蛋白cp13138p的氨基酸序列如seq id no.1所示，其编码基因命名为cp13138p基因，cp13138p基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。[0157]在此基础上，采用vaxijen v2.0、antigenpro、allergtop v.2.0、allergen fp v.1.0、iedb immunogenicity server和toxin pred server对构建的多肽融合蛋白cp13138p进行抗原性、变应原性、免疫原性和毒性预测分析。[0158]2、多肽融合蛋白理化特性和二级结构分析[0159]使用expasy protparam服务器(https://web.expasy.org/protparam/)预测多肽融合蛋白的理化参数。它可以预测疫苗的理化性质，如分子量、理论pi、氨基酸组成、原子组成、消光系数、估计半衰期、不稳定指数、脂肪族指数和亲水性总平均值(gravy)。蛋白质-溶胶(protein-sol)服务器(https://protein-sol.manchester.ac.uk/)用于预测多肽融合蛋白的溶解度。通过protein-sol服务器获得的单氨基酸序列与数据库中的数据进行比较。溶解度值大于0.45表示该蛋白具有较好的溶解度。利用psipred服务器(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)构建多肽疫苗的二级结构。它可以有效识别跨膜拓扑结构、跨膜螺旋、折叠和结构域识别等。raptorx property(http://raptorx.uchicago.edu/structurepropertypred/predict/)预测多肽疫苗的二级结构特征，该服务器使用一种名为deep cnf的不断进化的机器学习模型来连续计算二级结构(secondary structure，ss)、紊乱区域(disorder regions，diso)和溶剂可及性(solventaccessibility，acc)。二级结构包括α-螺旋、β折叠和无规则卷曲。溶剂可及性分为三种状态，隐藏状态为10％以下，暴露状态为40％以上，介质状态为10％～40％之间。有序/无序的预测是基于0.25的临界值。[0160]结果显示，cp13138p疫苗(即多肽融合蛋白cp13138p)由771个氨基酸组成。经expasy protparam服务器分析，其相对分子质量为77.5kda，理论pi值为9.78，不稳定性指数和脂肪族氨基酸指数分别为31.03(《40为稳定，》40不稳定)和77.37(有助于提高热稳定性)，亲水性gravy值为0.048。此外，我们还发现cp13138p表位疫苗在哺乳动物细胞内的半衰期超过30小时，在酵母和大肠杆菌体内的半衰期分别超过了20小时和10小时(表3)。这些结果表明，cp13138p疫苗是一个热稳定性好且能够在体内稳定存在的疫苗分子。此外，通过protein-sol服务器预测的cp13138p疫苗的溶解度为0.495，高于0.45的平均阈值，表明cp13138p疫苗具有良好的溶解度。[0161]表3、expasy protparam预测多肽融合蛋白分子的理化性质[0162][0163]cp13138p的二级结构如图5。研究表明，α-螺旋和天然未折叠蛋白区域是重要的"结构抗原"类型，有利于感染后自然诱导的抗体识别。结果表明，cp13138p疫苗含有48.24％的α-螺旋、9.1％的β-折叠和42.66％的螺旋。[0164]实施例3、多肽融合蛋白的分子对接、动态模拟及免疫刺激模拟分析[0165]1、多肽融合蛋白与tlr2和tlr4的分子对接及分子动力学模拟[0166]通过计算机计算分子对接，获得稳定的受体-配体复合物，并根据评分函数预测它们之间的结合亲和力。因此，我们评估了多肽疫苗与tlrs之间的相互作用。tlr2和tlr4的蛋白数据库(pdb)结构文件来自ncbi分子建模数据库(mmdb)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/structure/)。随后使用cluspro2.0服务器(https://cluspro.bu.edu/home.php)进行分子对接，验证tlrs与基于多肽的疫苗之间的相互作用。该服务器通过以下3个步骤分析了肽基疫苗与tlr的分子对接：(1)采样数十亿个构象进行刚体对接；(2)基于均方根-标准差(rmsd)的聚类方法对产生的1000个最低能量结构进行聚类，找出最大的聚类；(3)使用能量最小化去除空间冲突。最后，使用ligplot+程序评估氢键和疏水相互作用。为了进一步评估cp13138p表位疫苗与tlr2和tlr4之间的分子对接情况，我们利用cluspro2.0服务器构建了30个模型复合物。分析这些模型复合物的结合能，cp13138p-tlr2复合物的最低结合能为-1313.3kcal/mol(图6中a)，cp13138p疫苗和tlr2之间有21个通过氢键连接的结合位点(图6中b)；发现cp13138p-tlr4复合物的最低结合能为-1255.1kcal/mol(图7中a)，cp13138p疫苗和tlr4之间有15个通过氢键连接的结合位点(图7中b)。[0167]2、免疫模拟[0168]利用c-immsim服务器(https://150.146.2.1/c-immsim/index.php)预测免疫模拟。该服务器可以评估模拟疫苗注射状态下固有免疫细胞和适应性免疫细胞的免疫应答。设置c-immsim服务器参数为随机种子＝20000，模拟体积＝10，模拟步骤＝1000，选择宿主等位基因hla-a*02:01、hla-a*30:01、hla-b*15:11、hla-b*15:01、hla-drb1*09:01、hla-drb1*15:01。最后，预测了3次疫苗注射诱导的细胞免疫应答和细胞因子水平。[0169]本发明发现cp13138p疫苗可以激活细胞毒性t细胞(tc)分化为非记忆性亚群并激活活性tc细胞数目迅速上升形成一个峰值；可以激活总nk细胞数量维持在300-370个/mm3左右；三次免疫反应可以诱导活性巨噬细胞迅速增殖并使2型巨噬细胞和dc细胞数目出现三个依次递减的高峰(图8)。适应性免疫细胞特别是cd4+t细胞在清除mtb中扮演着重要的角色。结果显示，模拟注射3次cp13138p疫苗能够诱导机体产生显著高水平的b淋巴细胞和th细胞，两种细胞及其亚型出现三次依次递增的高峰(图9)。有趣的是，我们发现cp13138p疫苗能够诱导显著高水平的th1型细胞反应(图9)。[0170]实施例4、多肽融合蛋白重组质粒构建及其体外表达[0171]1、将实施例2中所述ctb、padre、13个htl表位、13个ctl表位、8个b细胞表位、pam2cys以及6×his标签以eaaak、gpgpg、aay和kk等连接子相连接组成多肽融合蛋白cp13138p(氨基酸序列如seq id no.1所示)，将如图1所示的各部分相对应的基因序列由eaaak、gpgpg、aay和kk等连接子相对应的基因序列前后连接成完整的基因，即为cp13138p基因(核苷酸序列如seq id no.2所示)。在cp13138p基因(seq id no.2)的两端增加bamhi和xhoi识别位点，得到dna片段1(ggatcc+seq id no.2+ctcgag)，随后送上海生工进行目的基因的合成。[0172]2、用限制性内切酶bamhi和xhoi双酶切步骤1中人工合成的dna片段1，回收酶切产物。[0173]3、用限制性内切酶bamhi和xhoi双酶切载体pet-28a(+)，回收载体骨架。[0174]4、将步骤2所得的酶切产物与步骤3所得的载体骨架进行连接，得到重组质粒(即重组载体)，将该重组载体命名为pet-28a(+)-cp13138p(图10中a)。[0175]5、重组载体结构描述如下：[0176]重组载体pet-28a(+)-cp13138p是将pet-28a(+)载体的bamhi和xhoi识别位点间的片段(小片段)替换为核苷酸序列是序列表中seq id no.2的dna片段，保持pet-28a(+)载体的其他核苷酸序列不变，得到的重组表达载体。重组载体pet-28a(+)-cp13138p表达氨基酸序列如seq id no.1所示的融合蛋白cp13138p。[0177]6、将重组载体pet-28a(+)-cp13138p导入大肠杆菌bl21(de3)，得到重组菌bl21/pet-28a(+)-cp13138p。重组菌的验证方法：将菌株接入lb固体培养基平板(含100ug/ml卡那霉素)，挑取单克隆并转接入lb液体培养基，37℃培养并提取质粒进行测序，如果提取的质粒为重组质粒pet-28a(+)-cp13138p，即为目的重组菌。[0178]7、多肽融合蛋白的表达[0179]将重组菌bl21/pet-28a(+)-cp13138p接入lb液体培养基(含15ug/ml卡那霉素)，37℃、220r/min培养过夜。次日按照1％(体积百分含量)的接种量转接入相同抗生素浓度的lb液体培养基中，在37℃、220r/min条件下培养至od600值≈0.6时，加入iptg诱导剂至终浓度为0.1mm后，在16℃、220r/min条件下继续进行诱导表达过夜，得到发酵液。[0180]8、多肽融合蛋白的纯化[0181](1)取步骤7的发酵液100ml，5000rpm离心10min，收集菌体沉淀。[0182](2)用30ml可溶性蛋白裂解缓冲液重悬步骤(1)中得到的菌体，吹打混匀后冰浴条件下进行超声，超声条件为：工作4.5sec，间隔9sec，共超声60min，功率为125w。将超声裂解物以12,000×g离心20min，弃去上清，将10ml包涵体蛋白裂解缓冲液加入沉淀部分，并且充分吹打混匀，室温放置过夜。[0183](3)翌日，将步骤(2)中得到的过夜混合物与2ml ni-nta混合，室温200rpm振荡混匀4h，使得目的蛋白(多肽融合蛋白)与ni-nta充分结合，然后将混合物移入纯化柱内，用包涵体蛋白洗涤缓冲液洗涤3次，每次10ml(流速控制为3ml/min)。然后用包涵体蛋白洗脱缓冲液洗脱5次，每次500ul(流速控制为3ml/min)，合并收集的洗脱液并测蛋白浓度，得到目的蛋白溶液(多肽融合蛋白溶液)。[0184]9、多肽融合蛋白的鉴定[0185]将多肽融合蛋白溶液进行12％聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果见图10中b。多肽融合蛋白溶液只显示一条约77.5kda的条带，与预期相符合。[0186]实施例5、体外实验验证cp13138p疫苗诱导的细胞因子水平[0187]本实施例中的健康对照者(hc)、潜伏性结核感染者(ltbi)和活动性结核患者(atb)来源于解放军总医院第八医学中心结核病医学部，样本采集均经解放军总医院第八医学中心伦理委员会批准，批准编号：309202204080808。[0188]1、cp13138p疫苗elispot实验[0189]采集健康对照者(hc，n＝25)、潜伏性结核感染者(ltbi，n＝25)和活动性结核患者(atb，n＝18)的外周血各5ml，分离外周血单个核细胞(pbmcs)。将部分分离的pbmcs加入96孔elispot培养板(2.5×105细胞/孔)，用50μl cp13138p(100μg/ml)刺激，50μl aim培养基作为阴性对照。将培养板在37℃的co2培养箱中孵育。24h后，采用human ifn-γelispotpro试剂盒(mabtech公司产品，货号3420-2hpt-2)检测γ-干扰素阳性(ifn-γ+)t细胞斑点数。结果表明，与培养基aim相比，cp13138p疫苗分子能够刺激ltbi(p《0.0001，图11中a)、atb(p＝0.0016，图11中b)和hc(p《0.0001，图11中c)三组人群pbmc细胞中ifn-γ+t淋巴细胞数目显著增高。表明cp13138p表位疫苗具有广泛的免疫原性，是最具潜力的候选疫苗分子。[0190]2、cp13138p疫苗诱导的35种细胞因子检测[0191]将其余pbmcs添加到96孔细胞培养板(2.5×105细胞/孔)(mabtech ab,nacka strand，瑞典)。用50μl cp13138p(100μg/ml)刺激pbmcs，37℃co2培养箱孵育48h。同时，用aim培养基刺激hcs的pbmcs作为阴性对照。将pbmcs细胞培养液混合物转移到新的管中，500g离心10min，最后将上清液缓慢转移到另一管中，用人35种细胞因子检测试剂盒(bd biosciences公司产品，货号ppx-35)检测细胞培养上清中g-csf、gm-csf、hgf、ifn-alpha、ifn gamma、il-1alpha、il-1beta、il-10、il-12p70、il-13、il-17f、il-2、il-21、il-22、il-23、il-3、il-31、il-4、il-5、il-6、il-8、il-9、ip-10、mcp-1、mcp-3、mig、mip-1alpha、mip-1beta、pd-1、sdf-1alpha、tim-3、timp-1、tnf alpha、vegf-a和vegf-r2的水平。[0192]c-immsim服务器结果显示，cp13138p疫苗可显著刺激较高水平的ifn-γ、tgf-β、il-2、il-10和il-18形成3个峰。ifn-γ和il-2的最高峰值分别为45万ng/ml和75万ng/ml(图12)。为了评估cp13138p疫苗在计算机模拟和体外诱导的免疫应答的一致性，我们对收集自hcs、ltbi患者和atb患者的pbmcs进行了体外刺激实验并检测了培养上清中35种细胞因子的水平。结果发现，与pbs阴性对照相比较，cp13138p疫苗能够刺激atb患者、hcs和/或ltbi感染者pbmc细胞分泌显著高水平的g-csf、ifn-γ、il-1α、il-1β、il-10、il-12p70、il-13、il-17f、il-2、il-22、il-4、il-5、il-6、pd-1、tnf-α和mig等细胞因子(图13)。[0193]以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。