含有修饰IgG2结构域的引起激动或拮抗特性的修饰抗体及其用途的制作方法

　　

　　优先权

　　本申请要求2014年3月24日提交的英国申请号1405264.1和2014年3月25日提交的英国申请号1405275.7的优先权，所述申请的内容以引用的方式整体并入本文。

　　领域

　　本申请大体上涉及以下发现，人igg2(h2)向抗-cd40抗体和其他免疫刺激受体抗体递送独特的fcγr-独立性激动活性，所述其他免疫刺激受体包括4-1bb和cd28；以及可能地其他b7/cd28和tnf/tnfr家族成员，以及另外的发现，即h2的独特激动或相反地拮抗活性依赖于铰链和ch1二硫键的精确排列。基于此发现，本发明提供了新颖激动和拮抗抗体以及其在治疗中的用途，其中igg2的铰链区被诱变为将所述抗体‘锁定’成更柔性‘h2a’或更紧密‘h2b’构象，以便分别赋予抗体拮抗和激动特性。

　　背景

　　单克隆抗体(mab)为革命性的癌症治疗，它重新燃起免疫系统可用于根除肿瘤的信念(sliwkowski等，(2013)；hodifs等，(2010)；wolchokjd等，(2013)。使用抗-ctla-4和抗-pd-1mab的结果已证实以下观点，t-细胞免疫可提供针对攻击性和难以治疗的癌症的持久防护，所述癌症诸如转移性黑色素瘤和非小细胞肺癌。(hodifs等，(2010)；wolchokjd等，(2013)；topaliansl等，(2012)。不同mab药剂以不同方式介导其作用并且改进治疗功效需要精确理解其作用机制。此外，mab同种型的选择主要由于指导抗原接合下游事件的fcγ受体(fcγr)相互作用中的差异而为关键的(nimmerjahnf&ravetchjv(2012)；whiteal等，(2013)。

　　药剂通过消耗其细胞靶标起作用，诸如用抗-cd20消耗恶性b细胞(uchidaj等，(2004))或用抗-ctla4和抗-gitr消耗鼠t调节细胞(simpsontr等，(2013)bulliardy等，(2013)。对于这种类型的药剂，小鼠igg2a(m2a)和人igg1(h1)为有效的，因为它们具有高激动性/抑制性(a/i)fcγr结合比率(hamaguchiy等，thejournalofexperimentalmedicine203(3):743-753；nimmerjahnf&ravetchjv(2005))。相比之下，其作用依赖于激动受体接合的mab诸如免疫刺激性抗-cd40(brahmer等，(2012)；bruhns等，blood113,3716-3725或细胞凋亡促进抗死亡受体(dr)4、dr5和fas(lif&ravetchjv(2012)；wilsonns等，(2011).xuy等，(2003)似乎主要依赖于与抑制性fcγriib交联来递送其活性(whiteal等，(2011)；lif&ravetchjv(2013),white等，(2013))。对于这种类型的药剂，小鼠igg1(m1)在临床前模型中为最佳的，因为它具有低a/i比率并且以足够亲和力接合fcγriib，以介导交联(white等，(2011)；lif&ravetchjv(2011))。在临床试验中的激动性抗-cd40mabcp870,893(vonderheiderh等，(2007))为一种人igg2(h2)，它基于其同种型而未被预测接合fc？r)(bruhnsp等，(2009)。另外两种激动性较小的cd40抗体chilob7.4和sgn40二者均为h1(advanir等，(2009)；johnson等，(2010))。另外，最新研究表明h2恒定区赋予特异性抗人cd28mab(tgn1412)增加的刺激活性(ballc等，(2012))。

　　尽管这样，但是在本发明之前还不清楚待用于人治疗中的应在激动性mab或融合蛋白中使用的最佳同种型。具体地说，关于抗体同种型如何可以实现治疗性抗体的治疗特性即其激动性或拮抗特性的理解较少。本发明解决了此需要，提供了改进的激动性(以及拮抗性)抗体，并且还提供了用于合成所述抗体的方式。在一个示例性实施方案中，这些抗体和融合蛋白例如靶向tnfr超家族成员的那些抗体和融合蛋白适用于治疗适应症，其中无论是激动性还是拮抗性抗体或融合蛋白均是治疗上需要的。

　　概述

　　本发明提供一种关于用于产生具有激动或拮抗特性的抗体的最佳抗体同种型的理解。更确切地说，本发明提供保护具有特异性突变的人igg2恒定区的抗体，其中根据这些特异性突变，这些抗体具有激动或拮抗特性。

　　本发明特别利用针对多种人共刺激受体(cd40、4-1bb和cd28)的mab确定人igg同种型的免疫调节活性并因此显示人igg2(h2)比h1或人h4赋予这些药剂更大的免疫刺激活性，并且显示此活性并不依赖于fcgr相互作用中的差异而是依赖于h2铰链和ch1结构域中二硫键的构象，所述构象使用诱变可被操纵成将mab‘锁定’成具有相反水平的激动水平的不同构象，从而提供具有限定水平的活性的同源超激动治疗性抗体，所述活性独立于局部微环境中的fcgr表达水平。

　　本发明还涉及包含具有特异性突变的人igg2恒定区的此类抗体和融合蛋白在疾病治疗或预防中作为受体激动剂或受体拮抗剂的用途，其中此类受体激动剂或受体拮抗剂具有治疗性应用。在示例性实施方案中，所述抗体将特异性接合tnf超家族成员，诸如cd40、ltα、ltβ、faslcd30、cd27、ox40、trail/apo-2l、4-1bb、4-1bbl、tnf、tnf-r、trance、trance-r、gitr或“糖皮质激素诱导的tnf受体”、tweak、fn14等；或者接合b7/cd28家族成员，诸如b7.1(cd80)、b7.2(cd86)、b7-dc(pd-l2或cd273)、b7-h1、b7-h2、b7-h3(cd276)、b7-h4(vtcn1)、b7-h5(vista)、b7-h6(ncr3lg1)、b7-h7(hhla2)、pd-1(cd279)、pd-l3、cd28、ctla-4(cd152)、icos(cd278)、btla、ncr3、cd28h、以及nkp30。

　　发明目的

　　本发明的一个目的为提供新颖的免疫激动剂或拮抗剂，并且更具体地说涉及超激动剂。

　　本发明的一个更具体的目的为提供包含突变igg2恒定区的新颖免疫激动剂或拮抗剂，其中此类突变增强了此类激动剂或拮抗剂多肽例如激动性或拮抗性igg2抗体或igg2/igg2嵌合融合蛋白的激动或拮抗特性。

　　本发明的另一个具体目的为提供非人igg2同种型例如人igg1、igg3、igg4、iga、igd、ige或igm抗体的修饰激动或拮抗抗体，其中higg2的整个或基本上整个铰链和ch1区和任选地higg2的轻链恒定区用于替换非人igg2抗体例如人igg1、igg3、igg4、iga、igd、ige或igm相应的轻链恒定区、铰链和ch1结构域或区。

　　本发明的一个更具体的目的为提供特异性结合人免疫细胞上表达的受体或配体的激动抗体，其中所述抗体激动由所述受体或配体引起的一种或多种生物活性、或由所述配体和受体的相互作用引起的生物活性，并且另外其中所述激动抗体包含至少人igg2的ch1和铰链区(“h2区”)，其中所述igg2区的一个或多个半胱氨酸残基被去除或改变成不同的氨基酸残基，从而使得所得激动抗体的激动特性相对于其中所述一个或多个半胱氨酸未改变的其他方面相同的抗体有所增加。

　　本发明的另一个具体目的为提供特异性结合人细胞表面上表达的受体或配体的修饰抗体，其中所述修饰抗体激动由所述受体或配体引起的一种或多种生物活性或者由所述配体及其相应受体的相互作用引起的生物活性，其中所述抗体不是人igg2抗体，并且另外其中不是人igg2的所述修饰抗体的整个或基本上整个铰链和ch1结构域和任选地轻链恒定区被higg2抗体相应的整个或基本上整个铰链和ch1结构域(“h2区”或“h2结构域”)和任选地轻链恒定区替换。

　　本发明的另一个具体目的为提供如上所述的选自higg1、higg3、higg4、iga、igd、ige或igm的修饰抗体，其中所述抗体的整个或基本上整个铰链和ch1结构域已被higg2相应的整个或基本上整个铰链和ch1结构域(“h2区”或“h2结构域”)替换。

　　本发明的另一个具体目的为提供如上所述的修饰抗体，其中位置127处的重链半胱氨酸残基和位置214处的轻链半胱氨酸残基中的任一个或两者(其中编号是根据kabat)是缺失的或者被改变成不同的氨基酸残基，从而使得所得修饰抗体的激动特性相对于其中所述半胱氨酸残基中的任一个或两者未改变的其他方面相同抗体有所增加。

　　本发明的另一个具体目的为提供如上所述的修饰抗体，其中在所述修饰抗体的h2区中突变或缺失的唯一半胱氨酸残基为轻链的位置214处的半胱氨酸并且所述修饰抗体包含(i)其中在h2区中没有半胱氨酸残基缺失或修饰的重链或者(ii)在重链的位置127、232或233处的半胱氨酸残基中的一个或多个是缺失或突变的，从而产生修饰抗体，其中所得修饰抗体的激动特性相对于缺乏所述缺失或修饰的其他方面相同的抗体有所增加。

　　本发明的另一个具体目的为提供如上所述的修饰抗体，其包含修饰higg1或higg3。

　　本发明的另一个具体目的为提供如上所述的修饰抗体，所述修饰抗体特异性结合人免疫细胞。

　　本发明的另一个具体目的为提供如上所述的修饰抗体，所述修饰抗体结合树突状细胞、肥大细胞、单核细胞、巨噬细胞、nk细胞、b淋巴细胞、t淋巴细胞或以上任何组合。

　　本发明的另一个具体目的为提供如上所述的修饰抗体，其中不存在所述修饰时所述抗体缺乏激动活性。

　　本发明的另一个具体目的为提供如上所述的修饰抗体，其中不存在所述修饰时所述抗体具有所述修饰抗体的不超过10％的激动活性，其中激动活性在用于量化激动性的可接受测定中检测。

　　本发明的另一个具体目的为提供如上所述的修饰抗体，其中不存在所述修饰时所述抗体具有所述修饰抗体的不超过20％的激动活性，其中激动活性在用于量化激动性的可接受测定中检测。

　　本发明的另一个具体目的为提供如上所述的修饰抗体，其中不存在所述修饰时所述抗体具有所述修饰抗体的不超过30％的激动活性，其中激动活性在用于量化激动性的可接受测定中检测。

　　本发明的另一个具体目的为提供如上所述的修饰抗体，其中不存在所述修饰时所述抗体具有所述修饰抗体的不超过40％的激动活性，其中激动活性在用于量化激动性的可接受测定中检测。

　　本发明的另一个具体目的为提供如上所述的修饰抗体，其中不存在所述修饰时所述抗体具有所述修饰抗体的不超过50％的激动活性，其中激动活性在用于量化激动性的可接受测定中检测。

　　本发明的另一个具体目的为提供如上所述的修饰抗体，其中不存在所述修饰时所述抗体具有所述修饰抗体的不超过50％-80％的激动活性，其中激动活性在用于量化激动性的可接受测定中检测。

　　本发明的另一个具体目的为提供如上所述的修饰抗体，其中所述抗体激动由人受体或配体引起的一种或多种生物活性或由所述配体及其相应受体的相互作用引起的生物活性，并且另外其中所述修饰抗体包含至少higg2的轻链恒定区和重链的ch1和铰链区(“h2区”)，其中选自位置127处的重链半胱氨酸残基和位置214处的轻链半胱氨酸残基的半胱氨酸残基中的任一个或两者被去除或改变成不同的氨基酸残基，从而使得所得激动抗体的激动特性相对于其中所述半胱氨酸残基二者未改变的其他方面相同的抗体有所增加(其中氨基酸编号是根据kabat)。

　　本发明的另一个具体目的为提供如上所述的修饰抗体，其中所述修饰抗体轻链在位置214处的半胱氨酸残基为缺失或突变的并且所述修饰抗体包含(i)其中h2区内没有半胱氨酸残基缺失或突变的重链或者(ii)所述修饰抗体包含其中位置127、232或233处的半胱氨酸残基中的至少一个缺失或突变的重链。

　　本发明的另一个具体目的为提供如上所述的修饰抗体，其中重链的h2区内没有半胱氨酸残基缺失或突变。

　　本发明的另一个具体目的为提供如上所述的修饰抗体，其中重链内的位置127、232或233处的半胱氨酸残基中的至少一个缺失或突变。

　　本发明的另一个具体目的为提供如上所述的修饰抗体，其中重链内的位置127、232或233处的半胱氨酸残基中的一个或两个残基的任何组合缺失或突变。

　　本发明的另一个具体目的为提供如上所述的修饰抗体，其中所述修饰抗体的h2区为处于h2b构象中。

　　本发明的另一个具体目的为提供如上所述的修饰抗体，其中higg2重链h2区内被去除、修饰或被另一种氨基酸残基取代的唯一半胱氨酸残基包括位置127处的重链半胱氨酸残基。

　　本发明的另一个具体目的为提供如上所述的修饰抗体，其中轻链区内没有半胱氨酸被去除、修饰或被另一种氨基酸残基取代。

　　本发明的另一个具体目的为提供如上所述的修饰抗体，其中hig2轻链恒定区内被去除、修饰或被另一种氨基酸残基取代的唯一半胱氨酸残基包括位置214处的轻链半胱氨酸残基。

　　本发明的另一个具体目的为提供如上所述的修饰抗体，其中higg2h2区内被去除、修饰或被另一种氨基酸残基取代的唯一半胱氨酸残基选自位置127处的重链半胱氨酸残基和位置214处的轻链半胱氨酸残基。

　　本发明的另一个具体目的为提供如上所述的修饰抗体，所述修饰抗体包含取代在轻链的位置214处的半胱氨酸的丝氨酸和/或取代在重链的位置127处的半胱氨酸残基的丝氨酸残基。

　　本发明的另一个具体目的为提供如上所述的higg1或higg3或higg4同种型的修饰抗体，其中所述higg1、higg3或higg4的整个铰链或ch1区被higg2相应的铰链和ch1区替换。

　　本发明的另一个具体目的为提供如上所述的修饰抗体，所述修饰抗体为higg1。

　　本发明的另一个具体目的为提供如上所述的修饰抗体，所述修饰抗体包含轻链或重链h2区内的一个或多个半胱氨酸残基。

　　本发明的另一个具体目的为提供如上所述的修饰抗体，所述修饰抗体包含h2区之外的另外的修饰，所述修饰并不影响或可感知地影响(不超过10％变化)所述修饰抗体的激动特性。

　　本发明的另一个具体目的为提供如上所述的修饰抗体，所述修饰抗体特异性结合在人细胞表面上表达的tnf或b7超家族成员，例如cd40、4-1bb或cd28。

　　本发明的另一个具体目的为提供如上所述的修饰抗体，所述修饰抗体特异性结合在至少一种类型的人免疫细胞上表达的受体或配体。

　　本发明的另一个具体目的为提供如上所述的修饰抗体，所述修饰抗体结合选自以下各项的免疫细胞：t淋巴细胞、b淋巴细胞、单核细胞、肥大细胞、巨噬细胞、nk细胞、以及树突状细胞或其组合。

　　本发明的另一个具体目的为提供如上所述的修饰抗体，所述修饰抗体包含整个人igg2ch1和铰链区。

　　本发明的另一个具体目的为提供如上所述的修饰抗体，所述修饰抗体缺乏所述人igg2fc区。

　　本发明的另一个具体目的为提供如上所述的修饰抗体，其中所述抗体或融合物的激动特性为fcγr独立性的。

　　本发明的另一个具体目的为提供如上所述的修饰抗体，其中所述抗体特异性结合选自cd40、ltα、ltβ、cd30、cd27、ox40、4-1bb、tnf-r、trance-r、gitr或“糖皮质激素诱导的tnf受体”、tweak、以及fn14的tnfr超家族成员或结合选自b7.1(cd80)、b7.2(cd86)、b7-h1、b7-h2、b7-h3(cd276)、b7-h4(vtcn1)、b7-h5(vista)、b7-h6(ncr3lg1)、b7-h7(hhla2)、pd-1(cd279)、cd28、ctla-4(cd152)、icos(cd278)、btla、ncr3、cd28h、以及nkp30的b7/cd28家族成员。

　　本发明的另一个具体目的为提供如上所述的修饰抗体，所述修饰抗体结合选自4-1bb、cd40或cd27的tnfr成员或者b7/cd28家族成员为ctla-4或cd28。

　　本发明的另一个具体目的为提供如上所述的修饰抗体，所述修饰抗体包含lob7.4的可变区。

　　本发明的另一个具体目的为提供含有如上所述的修饰抗体的药物组合物，所述药物组合物包含药物有效量的此修饰抗体。

　　本发明的另一个具体目的为提供此类抗体或具有其他免疫激动剂的此类组合物的用途。

　　本发明的另一个具体目的为提供如上所述的修饰抗体在治疗方法中的用途，所述治疗方法包括施用至少一种修饰抗体或含有所述修饰抗体的融合蛋白，所述方法包括施用有效量的至少一种修饰抗体或含有根据本发明的修饰抗体的融合蛋白或组合物。在优选的实施方案中，治疗的病状选自癌症、感染、过敏症、自身免疫、移植、gvhd或炎症。

　　本发明的另一个具体目的为提供特异性结合人细胞表面上表达的受体或配体的修饰抗体，其中所述修饰抗体拮抗由所述受体或配体引起的一种或多种生物活性或者由所述配体及其相应受体的相互作用引起的生物活性，其中所述抗体不是人igg2抗体，并且另外其中不是人igg2的所述修饰抗体的整个或基本上整个铰链和ch1结构域和任选地轻链恒定区被higg2抗体相应的整个或基本上整个铰链和ch1结构域和轻链恒定区(“h2区”或“h2结构域”)替换，其中h2区内一个或多个半胱氨酸残基被任选地修饰，所述修饰引起所得修饰抗体的拮抗特性增加。

　　本发明的另一个具体目的为提供如上所述的选自higg1、higg3、higg4、iga、igd、ige或igm的修饰拮抗抗体，其中所述抗体的整个或基本上整个铰链和ch1结构域以及任选地轻链恒定区已被higg2相应的整个或基本上整个铰链和ch1结构域以及轻链恒定区(“h2区”或“h2结构域”)替换。

　　本发明的另一个具体目的为提供如上所述的修饰拮抗抗体，其中所述igg2h2区的选自位置232、233、236和239处的半胱氨酸残基中的至少一个半胱氨酸残基被去除或改变成不同的氨基酸残基，使得所得修饰抗体的拮抗特性相对于其中所述一个或多个半胱氨酸残基未改变的其他方面相同的抗体有所增加。

　　本发明的另一个具体目的为提供如上所述的修饰拮抗抗体，其中所述修饰抗体在轻链的残基214处的半胱氨酸和在重链的残基127处的半胱氨酸未缺失、修饰或被另一种氨基酸残基取代。

　　本发明的另一个具体目的为提供如上所述的修饰拮抗抗体，其中所述抗体的h2区内的半胱氨酸修饰选择性促进或引起所述修饰抗体的重链和轻链经由轻链的位置214处的半胱氨酸和重链的位置127处的半胱氨酸来缔合。

　　本发明的另一个具体目的为提供如上所述的修饰拮抗抗体，其中所述修饰抗体的h2区呈h2a构象。

　　本发明的另一个具体目的为提供如上所述的修饰拮抗抗体，其中在h2区内除c214和c127之外的至少一个半胱氨酸残基被改变成丝氨酸残基。

　　本发明的另一个具体目的为提供如上所述的修饰拮抗抗体，所述修饰拮抗抗体包含取代重链的位置232处的半胱氨酸的丝氨酸。

　　本发明的另一个具体目的为提供如上所述的修饰拮抗抗体，所述修饰拮抗抗体包含取代重链的位置233处的半胱氨酸的丝氨酸。

　　本发明的另一个具体目的为提供如上所述的修饰拮抗抗体，其包含修饰higg1或higg3。

　　本发明的另一个具体目的为提供如上所述的修饰拮抗抗体，所述修饰抗体特异性结合人免疫细胞。

　　本发明的另一个具体目的为提供如上所述的修饰拮抗抗体，所述修饰拮抗抗体结合免疫细胞，包括树突状细胞、肥大细胞、单核细胞、巨噬细胞、nk细胞、b淋巴细胞、t淋巴细胞或以上任何组合中的至少一种。

　　本发明的另一个具体目的为提供如上所述的修饰拮抗抗体，其中不存在所述修饰时所述抗体缺乏拮抗活性。

　　本发明的另一个具体目的为提供如上所述的修饰拮抗抗体，其中不存在所述修饰时所述抗体具有所述修饰抗体的不超过10％的拮抗活性，其中拮抗活性在用于量化拮抗性的可接受测定中检测。

　　本发明的另一个具体目的为提供如上所述的修饰拮抗抗体，其中不存在所述修饰时所述抗体具有所述修饰抗体的不超过20％的拮抗活性，其中拮抗活性在用于量化拮抗性的可接受测定中检测。

　　本发明的另一个具体目的为提供如上所述的修饰拮抗抗体，其中不存在所述修饰时所述抗体具有所述修饰抗体的不超过30％的拮抗活性，其中拮抗活性在用于量化拮抗性的可接受测定中检测。

　　本发明的另一个具体目的为提供如上所述的修饰拮抗抗体，其中不存在所述修饰时所述抗体具有所述修饰抗体的不超过40％的拮抗活性，其中拮抗活性在用于量化拮抗性的可接受测定中检测。

　　本发明的另一个具体目的为提供如上所述的修饰拮抗抗体，其中不存在所述修饰时所述抗体具有所述修饰抗体的不超过50％的拮抗活性，其中拮抗活性在用于量化拮抗性的可接受测定中检测到。

　　本发明的另一个具体目的为提供如上所述的修饰拮抗抗体，所述修饰拮抗抗体特异性结合在人细胞上表达的受体或配体，其中所述抗体拮抗由所述受体或配体引起的一种或多种生物活性、或由所述配体及其相应受体的相互作用引起的生物活性，并且另外其中所述拮抗抗体包含至少人igg2的ch1和铰链和轻链恒定区(“h2区”)，其中所述igg2h2区的选自位置232、233、236和239处的半胱氨酸残基中的至少一个半胱氨酸残基被去除或改变成不同的氨基酸残基，使得所得拮抗抗体的拮抗特性相对于其中所述一个或多个半胱氨酸残基未改变的其他方面相同的抗体有所增加。

　　本发明的另一个具体目的为提供如上所述的修饰拮抗抗体，其中在轻链的位置214和重链的位置127处的半胱氨酸残基未缺失、修饰或被另一种氨基酸取代。

　　本发明的另一个具体目的为提供如上所述的修饰拮抗抗体，其中在higg2h2区内的一个或多个半胱氨酸残基或其他氨基酸残基被去除、修饰或被另一种氨基酸残基取代，使得h2区呈h2a构象。

　　本发明的另一个具体目的为提供如上所述的修饰拮抗抗体，其中在higg2h2区内所述半胱氨酸残基中的至少一个被改变成丝氨酸残基。

　　本发明的另一个具体目的为提供如上所述的修饰拮抗抗体，所述修饰拮抗抗体包含取代重链的位置232处的半胱氨酸的丝氨酸。

　　本发明的另一个具体目的为提供如上所述的修饰拮抗抗体，所述修饰拮抗抗体包含取代重链的位置233处的半胱氨酸的丝氨酸。

　　本发明的另一个具体目的为提供如上所述的修饰拮抗抗体，所述修饰拮抗抗体特异性结合在人细胞表面上表达的tnf或tnfr超家族成员或b7家族成员。

　　本发明的另一个具体目的为提供如上所述的修饰拮抗抗体，所述修饰拮抗抗体特异性结合至少一种类型的人免疫细胞。

　　本发明的另一个具体目的为提供如上所述的修饰拮抗抗体，所述修饰抗体特异性结合在t细胞、b细胞、肥大细胞、巨噬细胞、单核细胞、nk细胞或树突状细胞上表达的受体或配体。

　　本发明的另一个具体目的为提供如上所述的修饰拮抗抗体，所述修饰拮抗抗体包含整个人igg2恒定重链和轻链恒定区。

　　本发明的另一个具体目的为提供如上所述的修饰拮抗抗体，所述修饰拮抗抗体缺乏人igg2fc区。

　　本发明的另一个具体目的为提供如上所述的修饰拮抗抗体，其中所述抗体的拮抗特性为fcγr独立的。

　　本发明的另一个具体目的为提供如上所述的修饰拮抗抗体，其中所述抗体特异性结合选自以下各项的tnf/r超家族成员：cd40、cd40l(cd154)、ltα、ltβ、fasl(cd178)、cd30、cd30l(cd153)、cd27、cd27l(cd70)、ox40、ox40l、trail/apo-2l、4-1bb、4-1bbl、tnf、tnf-r、trance、trance-r、gitr或“糖皮质激素诱导的tnf受体”、tweak、以及fn14。

　　本发明的另一个具体目的为提供如上所述的修饰拮抗抗体，其中tnf/r或b7家族成员为4-1bb、4-1bbl、cd40、cd40l、cd27、cd28、b7.1、b7.2或cd70。

　　本发明的另一个具体目的为提供含有如上所述的修饰拮抗抗体的药物组合物，所述药物组合物包含有效量的修饰抗体或含有根据本发明的修饰抗体的融合蛋白。

　　本发明的另一个具体目的为提供含有如上所述的修饰拮抗抗体的药物组合物或其用途，所述药物组合物可包含另一种免疫激动剂或其他活性剂。

　　本发明的另一个具体目的为提供如上所述的修饰拮抗抗体在治疗方法中的用途，所述治疗方法包括施用至少一种拮抗抗体或含有根据本发明的抗体的融合蛋白或组合物，其中此类病状优选地包括癌症、过敏、感染性疾病、自身免疫、移植、gvhd或炎性病状。

　　本发明的另一个具体目的为提供如上所述的修饰拮抗抗体或其用途，所述用途包括施用包含lob7.4的可变区的抗体或对cd40、4-1bb或cd28有特异的另一种抗体，所述抗体可用于治疗诸如癌症、感染、过敏、自身免疫或炎症的病状。

　　本发明的另一个具体目的为提供新颖igg2激动抗体或含有所述抗体的融合蛋白，它们包含整个人igg2恒定区，所述抗体在铰链区内被修饰以改变二硫键改组。

　　本发明的另一个具体目的为新颖igg2激动抗体或含有所述抗体的融合蛋白，所述抗体不含人igg2fc或另一个fc区。

　　本发明的另一个具体目的为提供新颖拮抗或激动抗体，其中人igg2的整个或基本上整个铰链和ch1区和任选地higg2的轻链恒定区用于替换人igg1、igg3、igg4、iga或igm的相同结构域或区，任选地其中所述引入的higg2铰链和/或higg2ch1区和轻链恒定区可包含增强所得修饰抗体的激动或拮抗特性的一个或多个突变。

　　本发明的另一个具体目的为提供新颖激动或拮抗抗体，其中所述抗体或融合物的激动特性为fcγr独立的。

　　本发明的另一个具体目的为提供新颖激动或拮抗抗体或其自人治疗中的用途，其中所述抗体特异性结合选自以下各项的tnfr超家族成员：cd40、ltα、ltβ、cd30、cd27、ox40、4-1bb、tnf、tnf-r、trance-r、gitr或“糖皮质激素诱导的tnf受体”、tweak、以及fn14。

　　附图简述

　　图1(a)-图1(f)包含显示人igg2赋予抗-hcd40mab,lob7.4fcγr独立的激动活性的实验结果。

　　图2(a)-图2(c)包含显示人igg2赋予抗-tnfrsfmabfcγr独立的活性的实验结果。

　　图3(a)-图3(d)包含显示h2ch1和铰链区赋予lob7.4fcγr-独立的激动活性的实验结果。

　　图4(a)-图4(e)包含显示lob7.4h2的激动活性依赖于其形成h2b构象的能力的实验结果。

　　图5(a)-图5(e)包含显示抗小鼠cd40mab,3/23的同种型依赖性的实验。

　　图6(a)-图6(e)包含证实lob7.4人igg2对人细胞的活性比人igg1更大并独立于fcγr相互作用的实验结果。

　　图7(a)-图7(d)包含证实h2a和h2b的拮抗和激动特性的实验结果。

　　图8(a)–图8(h)包含显示不同人同种型对抗-cd40活性的作用的实验。

　　图9(a)-图9(g)包含进一步验证同种型对图8中的实验的抗-cd40活性的作用的对照实验。

　　图10(a)–图10(e)包含显示人igg2的fcγr独立性活性的实验数据。

　　图11(a)–图11(f)包含验证chilob7/4h2激动活性为fcγr-独立性的其他实验数据。

　　图12(a)–图12(e)包含显示人igg2针对多种受体靶标的拮抗作用的数据。

　　图13(a)和图13(b)包含显示ch1和铰链区赋予chilob7/4h2活性的实验。

　　图14包含验证chilob7/4开关突变体类似地结合cd40的对照实验。

　　图15(a)–图15(i)总结了显示诱变生成一系列chilob7/4h2激动形式的诱变实验结果。

　　图16(a)-图16(g)包含验证chilob7/4h2a和h2b形式的不同活性的另外的实验数据。

　　图17包含不同二硫键连接的h2亚型的示例性代表方案(改编自(martinez2008)。左图示出h2a的结构，其被认为是h2合成的形式，并且右图h2b示出主要的交替排列形式。突出显示参与改组的半胱氨酸残基。二硫键由各链之间或各链内的黑线表示。所示的ce-sds曲线示出了h2a和h2b形式的解析(正如所述，参考)而h1解析为单峰。

　　图18(a)包含不同二硫键连接的h2亚型的示例性代表方案(改编自(martinez2008)，图18(b)示出指定chilob7/4mab的nrce-sds曲线。指示了h2a和h2b位置和10kda标准。

　　图19、图20和图21示例性示出诱变可将抗体‘锁定’成h2a和h2b形式的方法。

　　图22、图23、图24和图25包含显示h2的诱变产生不同激动剂和拮抗剂的方式的实验数据。

　　图26包含表明h2b对比h2a形式的激动或拮抗特性可参与抗原加盖或nfkb活化的实验数据(表明多聚化可克服对fcγrx-连接的需要)。

　　图27包含显示不同同种型形式的抗-cd40抗体的免疫刺激特性的实验数据。

　　图28包含显示不同同种型形式的抗-cd40抗体对b细胞增殖的作用的b细胞测定结果。

　　详述

　　定义

　　正如所述的，本发明在广义上涉及新颖激动或拮抗抗体和融合蛋白、以及其制造和在治疗中的用途，其中所述抗体或融合蛋白包含人igg2恒定结构域，其中所述抗体包含产生具有增强的激动剂或拮抗剂特性的抗体或融合蛋白的特异性突变。

　　应理解，本发明不限于特定方法、方案、细胞系、动物种类或属、以及所述试剂，这些可发生改变。也应了解，本文使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并且并不意图限制本发明的范围，本发明仅由所附权利要求书限定。除非上下文另外明确地指出，否则本文所用的单数形式“一个(种)(a/and)”和“所述(the)”包括复数指示物。因此，例如，提及“一个细胞”包括多个此类细胞并且提及“蛋白质”包括提及一种或多种蛋白质以及其本领域技术人员已知的等效物，等等。除非另外明确说明，否则本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域一般技术人员通常理解的含义相同的含义。

　　“激动剂”是指与受体组合可产生细胞反应的化合物。激动剂可为直接结合受体的配体。或者，激动剂可通过例如以下方式与受体间接组合：(a)与直接结合受体的另一种分子形成复合物，或者(b)以其他方式引起另一种化合物修饰以使得所述另一种化合物直接结合受体。激动剂可称为特定受体或受体家族的激动剂(例如，tnf或tnfr激动剂)。“超激动剂”为在铰链和ch1区的半胱氨酸中具有突变从而提供最佳激动特性的激动剂。

　　“拮抗剂”是指当与感兴趣的分子例如tnf或tnfr家族超家族成员或其他配体或受体接触时引起所述分子的某一活性或功能的大小与在所述拮抗剂不存在时观察到的活性或功能的大小相比有所减小的化合物。感兴趣的特定拮抗剂包括对包含igg2恒定结构域的tnfr超家族成员有特异的抗体和融合蛋白。

　　“抗原”是指能够作为免疫反应的靶标的任何物质。抗原可为例如细胞介导的免疫反应和/或由受试者生物体引起的体液免疫反应的靶标。或者，抗原可为与免疫细胞接触时的细胞免疫反应(例如，免疫细胞成熟、细胞因子产生、抗体产生等)的靶标。

　　在本文中“tnf/r”大体上是指肿瘤坏死因子(tnf)超家族或肿瘤坏死因子受体(tnfr)超家族的任何成员。tnf和tnfr超家族包括例如cd40、cd40l(cd154)、ltα、ltβ、lt-βr、fasl(cd178)、cd30、cd30l(cd153)、cd27、cd27l(cd70)、ox40、ox40l、trail/apo-2l、4-1bb、4-1bbl、tnf、tnf-r、tnf-r2、trance、trance-r、gitr或“糖皮质激素诱导的tnf受体”、gitr配体、relt、tweak、fn14、tnfα、tnfβ、rank、rank配体、light、hvem、gitr、troy、以及relt。除非另外说明，否则提及tnf/r激动剂或拮抗剂化合物可包括任何药物可接受形式的化合物。

　　“b7家族成员”或“b7-cd28家族成员”是指在涉及免疫信号传导的免疫细胞上表达的受体和配体大家族的成员。对于b7多肽家族成员常见的典型结构元件包括细胞外结构域，包括v-样和c-样ig结构域。发现信号序列处于全长b7家族多肽的n-末端，并且接着是n-至-c顺序的v-样ig结构域、c-样ig结构域、跨膜结构域、以及细胞内结构域。在b7多肽的细胞外结构域内存在某些关键性残基，即涉及多肽的二硫键形成和三维构象的两对保守性半胱氨酸残基(每对处于每个ig结构域内)。b7多肽家族中度保守，其中人家族成员的ig结构域彼此非常类似，并且与来自其他物种的b7家族成员的ig结构域非常类似。所述家族包括子家族，包括b7-1(cd80)、b7-2(cd86)和b7-h1、以及嗜乳脂蛋白(btn)/mog(髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白样)家族成员，其中免疫调节b7子家族缺乏b30.2结构域并且嗜乳脂蛋白/mog子家族具有b30.2结构域。b7/cd28超家族的成员作为实例包括b7.1(cd80)、b7.2(cd86)、b7-dc(pd-l2或cd273)、b7-h1、b7-h2、b7-h3(cd276)、b7-h4(vtcn1)、b7-h5(vista)、b7-h6(ncr3lg1)、b7-h7(hhla2)、pd-1(cd279)、pd-l3、cd28、ctla-4(cd152)、icos(cd278)、btla、ncr3、cd28h、以及nkp30。

　　例如tnf或tnfr超家族成员或其他免疫细胞受体的术语“与x有关的生物效应”和“x活性”可互换使用并且包括与和激动剂或拮抗剂特异性相互作用的部分例如tnf或tnf/r超家族成员有关的任何生物效应。

　　在本文中术语“宿主细胞”通常是指工程化为表达根据本发明的一种或多种抗体的任何细胞。此细胞作为实例包括细菌、真菌、酵母、哺乳动物、无脊椎动物诸如昆虫、植物以及禽类细胞。

　　术语“表达载体”是指含有促进靶宿主细胞内的外源蛋白表达操纵的元件的dna载体。通常，序列的操纵和用于转化的dna的产生首先在细菌宿主细胞例如大肠杆菌中进行，并且载体通常将包含促进此类操纵的序列，包括细菌复制起点和适当的细菌选择性标记物。选择性标记物编码在选择培养基中生长的转化宿主细胞的存活或生长所需要的蛋白质。未用含有选择基因的载体转化的宿主细胞将不能在所述培养基中存活。典型选择基因编码以下蛋白质：(a)对原核宿主细胞赋予对抗生素或其他毒素的抗性；(b)补体营养缺陷不足；或(c)供应不可从复合培养基获得的关键营养素。用于转化酵母的示例性载体和方法描述于例如，在burke,d.、dawson,d.和stearns,t.(2000).methodsinyeastgenetics:acoldspringharborlaboratorycoursemanual.plainview,n.y.:coldspringharborlaboratorypress中。感兴趣的多肽编码序列可操作地连接至提供所述多肽在酵母细胞内的表达的转录和翻译调节序列。这些载体组件可包括但不限于以下各项中的一种或多种：增强子元件、启动子和转录终止序列。还可包括用于分泌多肽的序列，例如信号序列等。酵母复制起点为任选的，因为表达载体通常整合到酵母基因组中。在本发明的一个实施方案中，感兴趣的多肽可操作地连接至或融合至提供多肽从酵母二倍体细胞中最佳分泌的序列。

　　在本文中“抗体结构域”或“区”是指抗体分子的不同部分或亚基。在igg情况下，重链具有四个亚基“ch3”、“ch2”、“ch1”(恒定部分)和vh(可变部分)。轻链具有两个亚基cl和vl。两个ch3单元直接连接，而ch2单元被寡糖分开。ch1位于重链“铰链”之后并且通过二硫键连接至cl单元。“ch2结构域”通常根据eu编号系统从igg的约残基231延伸至约340。ch2结构域的独特之处在于它并未与另一个结构域紧密配对。相反，两个n-连接的分支碳水化合物链插入在完整天然igg分子的两个ch2结构域之间。已推测，碳水化合物可提供用于结构域-结构域配对的取代基并帮助稳定ch2结构域。burton,molec.immunol.22:161-206(1985)。“ch3结构域”包含fc区内c-末端残基至ch2结构域的片段(即根据eu编号系统从igg的约氨基酸残基341至约氨基酸残基447)。

　　术语“fc区”通常是指包含免疫球蛋白重链的c末端多肽序列的二聚体复合物，其中c-末端多肽序列为可通过用木瓜蛋白酶消化完整抗体获得的多肽序列。fc区可包含天然或变体fc序列。尽管免疫球蛋白重链的fc序列的边界可发生改变，但是人igg重链fc序列通常被定义为从约位置cys226的氨基酸残基或从约位置pro230到fc序列的羧基末端的片段。免疫球蛋白的fc序列通常包含两个恒定结构域ch2结构域和ch3结构域，并且任选地保护c.sub.h4结构域。在本文中“fc多肽”意指构成fc区例如单体fc的一种多肽。fc多肽可从任何适合的免疫球蛋白获得，所述免疫球蛋白诸如igg1、igg2、igg3、或igg4亚型、iga、ige、igd或igm。

　　在本文中术语“h2a”构象是指igg2或含有igg2的铰链和ch2区的修饰抗体的特定亚型。人igg2在免疫球蛋白中的独特之处在于其改组ch1和铰链区((25-28))内的二硫键的能力。h2的两种亚型占主导地位。h2a具有柔性的经典igg构象，其中ch1中的重链(hc)c127连接至轻链(lc)中的c214并且在相反铰链半胱氨酸232、233、236和239之间存在4个hc间二硫键。

　　在本文中术语“h2b”或“h2b”构象是指igg2或含有higg2的铰链和ch2区的修饰抗体的第二种特定亚型。((25-28))。h2b比h2a更紧密并且hcc127和lcc214与hc铰链半胱氨酸232和233形成二硫键桥。

　　“kabat”或“eu编号方案”也称为“eu索引”，它是本领域公认的且广泛接受的指定抗体和具体地人抗体、以及包含在整个抗体或抗体片段内的特定结构域的特定氨基酸残基的系统。除非本文另外指示，否则氨基酸残基的编号是根据eu编号系统，其也称为eu索引，如kabat等，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，第5版publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.,1991中所述的。

　　术语“可操作地连接”是指与另一种核酸序列处于功能关系中的核酸。例如，如果信号序列的dna表达为参与多肽分泌的前蛋白，那么其可操作地连接至多肽的dna；如果启动子或增强子影响序列的转录，那么其可操作地连接至编码序列。通常，“可操作地连接”意指所连接的dna序列为连续的并且在分泌前导序列的情况下为连续的且处于阅读框中。然而，增强子并不需要为连续的。连接通过在常规限制性位点处连接或者经由本领域技术人员所熟悉的pcr/重组方法(gatewayrtechnology；invitrogen,carlsbadcalifornia)来实现。如果此类位点并不存在，那么根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。

　　术语“启动子”是指位于结构基因起始密码子上游(5’)的控制它们可操作地连接的特定核酸序列的转录和翻译的非翻译序列(通常在约100至1000bp内)。此类启动子属于若干类别：诱导型启动子、组成型启动子和阻抑型启动子(响应于阻遏子的不存在而增加转录水平)。诱导型启动子可响应于培养条件的某一变化(例如存在或不存在某一营养素或温度变化)来引发在它们控制下自dna的转录程度增加。

　　启动子片段也可用作同源重组和表达载体到宿主基因组中的相同位点的整合的位点；或者可选择性标记用作同源重组的位点。

　　在本文中术语“感兴趣的多肽”是指激动性或拮抗性人igg2抗体或人igg2融合蛋白。

　　术语“所需抗体”通常是指对靶标例如tnf或tnf/r超家族成员有特异的亲本抗体或片段。术语“抗体”旨在包括具有匹配并识别表位的特定形状的任何含多肽链分子结构，其中一种或多种非共价结合相互作用使复合物在分子结构与表位之间稳定。原型抗体分子为免疫球蛋白，并且来自所有来源例如人、啮齿动物、兔、牛、羊、猪、狗、其他哺乳动物、鸡、其他禽类等的所有类型的免疫球蛋白igg、igm、iga、ige、igd等均被视为“抗体”。

　　感兴趣的抗体编码序列包括由天然序列编码的那些序列、以及凭借遗传密码子的简并性而使序列不同于公开核酸的核酸、以及其变体。变体多肽可包含氨基酸(aa)取代、添加或缺失。氨基酸取代可为保守性氨基酸取代或去除非必需氨基酸的取代，例如改变糖基化位点或通过取代或缺失非功能必需的一个或多个半胱氨酸残基来最小化错误折叠。变体可设计为保留或增强蛋白质特定区域(例如，功能结构域、催化性氨基酸残基等)的生物活性。变体还包含本文所公开的多肽的片段，具体地是生物活性片段和/或与功能结构域相对应的片段。用于体外诱变克隆基因的技术为已知的。在本发明中还包括已利用普通分子生物技术修饰以提高它们对蛋白水解降解的抗性或优化溶解特性或使它们更适合用作治疗剂的多肽。

　　嵌合抗体可通过重组方式通过将可变轻链区和重链区(vl和vh)组合来产生，所述抗体从一种物种中具有来自另一种物种的恒定轻链区和重链区的产生抗体细胞中获得。通常嵌合抗体利用啮齿动物或兔的可变区和人恒定区来产生具有主要人结构域的抗体。此类嵌合抗体的产生为本领域已熟知的，并且可通过标准方式实现(例如如美国专利号5,624,659中所述的，所述专利以引用的方式整体并入本文。在本文中重组嵌合抗体将包含铰链区内修饰的人igg2恒定区，以便产生作为受体或配体激动剂或拮抗剂起作用的抗体。

　　人源化抗体被工程化为含有甚至更多人样免疫球蛋白结构域，并且仅结合动物来源抗体的互补决定区。这通过小心评估单克隆抗体可变区的高变环序列并使它们匹配人抗体链的结构来实现。尽管在表面上较复杂，但是所述方法直接用于实践。参见例如美国专利号6,187,287，所述专利以引用的方式完全并入本文。

　　免疫球蛋白及其片段可进行翻译后修饰，例如以添加效应部分，诸如化学接头，可检测部分诸如荧光染料、酶、毒素、底物、生物发光材料、放射性材料、化学发光部分等，或者特异性结合部分诸如链霉抗生物素蛋白、抗生物素蛋白或生物素等，它们可用于本发明的方法和组合物中。

　　现在已深入了解了在脊椎动物中的抗体的一般结构(edelman,g.m.,ann.n.y.acad.sci.,190:5(1971))。抗体由分子量约23,000道尔顿的两条相同多肽轻链(“轻链”)和分子量53,000-70,000的两条相同重链(“重链”)组成。在“y”构型四条链通过二硫键连接，其中轻链在“y”构型开口处开始将重链括在一起。“y”构型的“分支”部分标记为fab区；“y”构型的主干部分标记为fc区。氨基酸序列取向从“y”构型顶部的n-末端延伸至每条链底部的c-末端。n-末端具有带有对引起它的抗原的特异性的可变区，并且长约100个氨基酸，在轻链与重链之间和从抗体至抗体之间存在轻微变化。

　　在每条链中可变区连接至恒定区，所述恒定区延伸所述链的其余长度并且在特定类别的抗体内并不随着抗体特异性而改变(即，产生它的抗原)。存在五种已知的主要类别的恒定区，它们决定了免疫球蛋白分子的类别(与γ、μ、α、δ和ε(γ、μ、α、δ或ε)重链恒定区相对应的igg、igm、iga、igd和ige)。恒定区或类别决定了随后的抗体效应功能，包括补体活化(kabat,e.a.,structuralconceptsinimmunologyandimmunochemistry，第2版，第413-436页，holt,rinehart,winston(1976))，以及其他细胞反应(andrews,d.w.等，clinicalimmunobiology,pp1-18,w.b.sanders(1980)；kohl,s.等，immunology,48:187(1983))；而可变区决定了与它反应的抗原。轻链被分类为κ链(κ)或λ链(λ)。每个重链类别均可用κ或λ轻链制备。轻链和重链彼此共价结合，并且当通过杂交瘤或通过b细胞产生免疫球蛋白时两条重链的“尾”部分通过共价二硫键彼此结合。

　　表述“可变区”或“vr”是指抗体的每对轻链和重链内直接涉及抗体与抗原的结合的结构域。每条重链在一个末端具有可变结构域(vh)，接着具有多个恒定结构域。每条轻链具有在一个末端的可变结构域(vl)和在另一个末端的恒定结构域；轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对齐，并且轻链可变结构域与重链的可变结构域对齐。

　　表述“互补决定去”、“高变区”或“cdr”是指抗体轻链或重链可变区内可见的一个或多个高变区或互补决定区(cdr)(参见kabat,e.a.等，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.,(1987))。这些表述包括如kabat等所定义的高变区(“sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,”kabate.等，usdept.ofhealthandhumanservices,1983)或抗体三维结构中的高变环(chothia和lesk,jmol.biol.196901-917(1987))。每条链中的cdr由框架区紧密固定在一起并且与来自另一条链的cdr一起帮助形成抗原结合位点。在所述cdr内存在已描述为选择性决定区(sdr)的选择氨基酸，所述选择性决定区表示由cdr以抗体-抗原相互作用使用的关键性接触残基(kashmiri,s.,methods,36:25-34(2005))。

　　“表位”或“结合位点”为抗原接合肽(诸如抗体)特异性结合的抗原上的部分或区域。蛋白质表位可包含直接参与结合的氨基酸残基(也称为表位的免疫显性组分)和未直接参与结合的其他氨基酸残基，诸如被特异性抗原结合肽有效阻断的氨基酸残基(换言之，氨基酸残基处于特异性结合肽的“足迹”内)。

　　短语第一抗体“基本上”或“至少部分”结合与第二抗体相同的表位意指所述第一抗体表位结合位点在抗原上包含的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或更多的氨基酸残基构成第二抗体表位结合位点。而且，第一抗体基本上或部分结合与第二抗体相同或重叠的表位意指第一抗体和第二抗体竞争结合如上所述的抗原。因此，术语“结合与单克隆抗体基本上相同的表位或决定簇”意指一种抗体与所述抗体“竞争”。

　　短语“结合与感兴趣的抗体相同或重叠的表位或决定簇”意指抗体所述感兴趣的抗体“竞争”在所述感兴趣的抗体特异性结合的抗原上的至少一个或所有的残基。结合与本文所述的单克隆抗体基本上或大致上相同的表位的一种或多种抗体的鉴别可容易利用许多其中可评定抗体竞争的免疫筛选测定中的任一种测定来确定。许多此类测定按常规方式实施并为本领域中所熟知的(参见例如1997年8月26日提交的美国专利号5,660,827，所述专利以引用的方式特别并入本文中)。应理解实际上确定本文所述抗体所结合的表位并不需要以任何方式鉴别结合与本文所述单克隆抗体相同或基本上相同或重叠的表位的抗体。

　　术语“融合蛋白”是指包含经由其单独肽主链由共价键连接的两个或更多个蛋白质或其片段的分子，最优选地通过编码那些蛋白质的多核苷酸分子的遗传表达所生成。在本发明中，融合蛋白通常将包含igg2恒定结构域，通常其中铰链区被突变来锁定激动或拮抗构象的h2。

　　术语“免疫球蛋白融合蛋白”是指多肽的功能部分(通常包含细胞表面蛋白的细胞外结构域)与免疫球蛋白恒定区的一个或多个部分例如铰链ch1、ch2或ch3结构域或其部分或组合的融合物。在一个实施方案中，细胞外结构域或片段所来源的多肽为tnf配体和受体超家族的成员。所述分子的ig部分将整体或部分来源于igg2免疫球蛋白并且可能将包括其他免疫球蛋白同种型的部分，包括例如igg1、igg3、igg4、igm、iga等。免疫球蛋白融合蛋白在本文中被称为fc融合蛋白的ig，其中铰链和/或ch1区内的半胱氨酸被修饰或缺失。

　　因此，本发明大体上涉及包含igg2恒定区、优选地在铰链区内含有特定突变的igg2恒定区的结构域的激动或拮抗抗体和免疫球蛋白融合蛋白。本发明人在本文中利用体外和体内方法的组合证实人igg2(h2)向抗体、特别是抗-cd40抗体和其他tnf/tnfr受体(包括4-1bb和cd28)抗体递送独特的fcγr-独立性激动活性。更具体地说，本发明人利用以下实施例中所公开的材料和方法证实以下各项：

　　人igg2比人igg1赋予抗-cd40更大激动活性

　　在本发明之前，用于激动性mab’s的最佳同种型为未知的，因为还未报道用于激动性mab’s的人同种型的正式研究。具体地说，如下文详细公开的，抗人cd40mablob7.4的研究惊人地显示h2的独特活性依赖于铰链和ch1二硫键的精确排列。将lob7.4‘锁定’成更柔性‘h2a’或更紧密‘h2b’构象的化学‘改组’或诱变分别赋予了拮抗和激动特性。以这种方式对h2进行工程化允许开发具有免疫刺激或免疫抑制特征的多肽，这直接提示了治疗性mab和治疗性融合蛋白的设计。

　　如下文中详细公开的，本发明人比较了当表达为具有h1或h2恒定区时mab针对cd40以及共刺激t细胞受体cd28和4-1bb的免疫刺激特性。在所有情况下，本发明人发现h2的激动性比h1更大，这独立于mabfc和fcγr二者的相互作用。抗人cd40mablob7.4的嵌合形式的分析显示活性依赖于二硫键在h2铰链中的排列。此外，特定半胱氨酸残基的突变可将mab锁定成激动或拮抗构象。基于这些观察，人igg2因此提供了操纵mab功能从而允许选择fcγr-独立性激动剂以及阻断不适当免疫活化的抑制剂的独特机会。

　　先前利用抗小鼠cd40mab3/23的研究证实3/23m1具有高激动性而3/23m2a由于与fcγriib结合的差异而不具有激动性(whiteal等，(2013)；white等(2011))。为了分析人同种型对活性的作用；本发明人将3/23和抗人(h)cd40mablob7.4的可变区克隆到h1和h2恒定区上并且在许多体外和体内测定中比较了它们的活性与m1和m2a的活性。

　　对于两种mab，h2证实了与m1类似的免疫刺激特征，而h1和m2a为大部分无活性的(参见图1、图2和图5)。在体内，3/23m1和h2有效刺激ab和cd8t细胞针对ova的反应、脾脏dc的活化，并且在疫苗环境(表达ova的实体eg7肿瘤)和治疗环境中(bcl1淋巴瘤模型)提供针对肿瘤发展的保护，而3/23h1和m2a并不如此(图5a-图5e和(18))。类似地，在体外，lob7.4h2比lob7.4h1引起大得多的分离的人b细胞活化(如通过作为活化标记物的细胞团聚或细胞聚集所评定的)、活化标记物cd23的上调和3h-胸苷结合以及分离的主要人朗格汉斯细胞的活化(如通过cd70上调所评定的)(参见图6a、图6b)。

　　lob7.4m1和h2(而非m2a或h1)也允许hcd40tg小鼠b细胞在体外活化和增殖(参见图1a)并刺激hcd40tg小鼠中ab和内源性cd8t细胞针对ova的反应大量且显著的增加(图1b、图1c)。因此，在许多模型系统中，使用针对小鼠和人受体的mab，h2恒定区比h1赋予抗-cd40更大的激动活性。

　　人igg2的fc-和fcγr-独立性活性

　　表面等离子体共振(spr)证实lob7.4h2具有对fcγr(包括fcγriib(图6c)，其为小鼠b细胞上的唯一fcγr)的低亲和力，这表明h2的激动活性为fcγr-独立的。与此一致的是，去除lob7.4h2fc以产生fab’2并不会减小其促进人或hcd40tg小鼠b细胞活化和增殖的能力，而进一步裂解成fab’或使用h1或h1fab’2会减小活性(图1d并且数据未示出)。另外，pan阻断的抗-fcγriimab并不影响lob7.4h2活化人b细胞的能力，而它确实阻断通过fcγrii过度表达的交联细胞诱导的lob7.4h1的活性(图6e)。此外，尽管lob7.4m1和h2二者均促进hcd40tgb细胞在体外活化和增殖，但是fcγriib的遗传缺失消融了m1而非h2的活性(图1e)。最后，当用ova免疫hcd40转基因fcγriibwt或ko小鼠时，在ko动物中lob7.4m1增加cd8t细胞扩增的能力减小>80％，而fcγriib的损失并不会影响lob7.4h2的激动活性(图1f)。

　　人igg2对其他共刺激受体具有激动性

　　h2恒定区还赋予其他免疫刺激mabfcγr-独立的活性。最初来源于亲本m1sc26(24)的另一种抗-hcd40mab特异性的嵌合h2(目前在临床开发中为sgn40(seattlegenetics))活化分离的人b细胞，如通过团聚、cd23上调和增殖所评定的，而嵌合h1并不如此(图2a)。此外，亲本sc26m1和sgn40-sotonh2促进了hcd40tg小鼠b细胞的增殖(图2b)，而当fcγriib在遗传上缺失时，仅sgn40-sotonh2刺激增殖(图2b)。

　　利用针对两种人t细胞受体4-1bb(cd137；内部产生的mab)和cd28(基于tgn1412专利保护序列)的mab得到类似的观察。对于两种靶标，当促进体外人t细胞增殖时h2的激动性大于h1(图2c)。抗-hcd28h2mab引起并不表达fcγr的纯化t细胞团聚和增殖，再次支持fcγr-独立性作用机制(图2c)。

　　人igg2铰链和ch1结构域为激动活性所必需的

　　由于h2fc并非活性所需要的，所以利用其中lob7.4h1和h2的ch1或ch1和铰链结构域二者转换的嵌合mab研究ch1和铰链结构域的作用(图3)。使用超过扩增mab浓度范围(<1至>5,000ng/ml)的hcd40tgwt或fcγriibkob细胞的增殖测量活性。天然lob7.4h2引起两种细胞类型的显著活化和增殖，其中活性峰值为约200ng/ml，而在任何浓度下均观察到很少的对h1的反应(图3a)。lob7.4m1在fcγriibwt中而非ko细胞中刺激增殖并且在低浓度下功效显著小于h2(图3a，底部2个图)。具有转换的ch1结构域(ch11/2和ch12/1)或其中h1的ch1和铰链转移至h2(铰链1/2)的mab在两种细胞类型之一中具有很小的活性。相比之下，将h2ch1和铰链区转移至h1(铰链2/1)产生与天然h2类似的活性(图3b)。这些数据表明h2的ch1和铰链结构域为激动活性所必需的。

　　与体外数据一致，lob7.4h1和铰链1/2突变体在hcd40tg小鼠中引起cd8t细胞针对ova的反应的较少刺激，而lob7.4h2和铰链2/1嵌合体引起抗-ova-特异性cd8t细胞扩增的大量和显著增加(图3c)。

　　二硫键改组指示huigg2激动活性

　　人igg2在免疫球蛋白中的独特之处在于其改组ch1和铰链区内的二硫键的能力(图17；(wpych等，(2008)；martinez等，(2008)；zhang等，(2010))。h2的两种亚型占主导地位：具有柔性的经典igg构象的h2a，其中ch1中的重链(hc)c127连接至轻链(lc)中的c214并且在相对铰链半胱氨酸232、233、236和239之间存在4个hc间二硫键(图17)；以及更紧密的h2b，其中hcc127和lcc214与铰链半胱氨酸232和233形成二硫键桥(图17)。h2a和h2b形成可通过非还原性毛细管电泳(nrce-sds(26,29)，它揭示了h2的双峰和h1的单峰(图17))来以分析方式分离。

　　嵌合lob7.4mab的nrce-sds分析显示仅铰链2/1突变体保留改组二硫键并产生双峰的能力(图3d)。这与以下观察一致，hc半胱氨酸127(在ch1中)、232或233(在铰链中)中任一个的突变防止了二硫键重新排列(26,30)并且表明lob7.4h2的激动活性与其改组二硫键的能力相关。

　　为了确定h2a和h2b形式是否与不同水平的激动活性相关，在具有或不具有变性剂的氧化还原缓冲液中使lob7.4化学‘倾向(skewed)’于其h2a或h2b形式，如(28)中所述的。在单独的氧化还原缓冲液中孵育迫使大部分(～75％)成为h2b，如通过nrce-sds所评定，而加入盐酸胍使得>70％倾向于h2a(图4a，左图)。倾向的mab与显著不同的活性相关，如通过其引起人b细胞团聚和活化或hcd40tgb细胞增殖(图4a并且数据未示出)的能力评定的，其中h2b的活性显著大于h2a。当抗小鼠cd40mab3/23、h2倾向于其a和b形式时观察到类似的活性差异(图7a-图7c)。

　　点突变可将h2锁定成激动和拮抗构象

　　由ballard和其他人(26,30)进行的简洁研究表明hcc232或c233突变成s可将h2锁定成其h2a形式，而hcc127s产生与h2b类似的形式。将这些突变引入到lob7.4h2中并通过nrce-sds证实其朝向h2a或h2b偏移(图4b)。hcc232s或c233s导致lob7.4h2激动活性完全丧失，如通过hcd40tgb细胞增殖所测量的(wt或fcγriibko；图4c，蓝色线)。相比之下，hcc127s在高浓度下相对于天然h2使活性增加至几乎与倾向的h2b一样高的水平(图4c，底部图，蓝色线)。有趣的时，与hcc233sh2a共孵育减小了lob7.4h2b的活性，特别是在高浓度下，从而产生几乎与天然h2相同的特征性钟形曲线(图4d)。类似地，lob7.4hcc233s也在体外显著减小sgn40h2在hcd40tgb细胞上的激动活性(图7d)。

　　lcc214的诱变还产生显著的活性变化。lcc214s防止了lc与hc之间的二硫键合，从而在nrce-sds上产生分离的lc和hc二聚体峰(图4c)。重要的是注意到h:l二硫键的丧失并不影响抗体结合，因为在生理缓冲液中两条链通过非共价键保持在一起。当与wtlc或lcc214s组合时，这通过cd40在hcc233s的spr上的相同亲和力来证实(图4e)。

　　当lcc214s与wthc、hcc232s或c233s组合时，hc二聚体在nrce-sds上作为单一物质运行，这表明在每种情况下的单一构象。在所有情况下，lcc214s增加了激动活性并提供了特征性b细胞增殖曲线：与wthc组合时观察到与c127s突变体类似的曲线；与hc232s组合时产生与天然h2类似的曲线；并且当与hcc233s组合时可见与倾向的h2b非常类似的最大活性(图4c，红色线)。这些曲线具有高再现性并使用hcd40tg或人b细胞时为类似的(数据未示出)。因此，一级序列中的小变化可对h2活性具有显著作用，从而使得能够工程化激动剂和拮抗剂的活性谱。

　　人igg同种型和抗-cd40活性

　　为了评估人恒定区对激动活性的作用，使用抗人cd40mabchilob7/4(chowdhury,2014)，通常用于癌症患者的第1期临床试验。最初通过当嵌合到不同人恒定区时chilob7/4引起人b细胞在体外活化和增殖的能力来评定激动活性。所有嵌合体均类似地结合cd40，如通过流式细胞术测定的(图8d)。chilob7/4h1和h2的fab’片段也以类似的亲和力结合固定的hcd40(分别为10.0和10.2x10-9m)，如通过spr所测量的(图8e)。当加入到纯化的人b细胞中时，与chilob7/4h1或h4相比，chilob7/4h2引起大得多的b细胞活化和增殖，如分别通过同型粘附(细胞团聚)和3h胸苷摄取所评定的(图8a)。为了确定fab’臂交换并不引起h4活性缺乏，将稳定的s228p突变引入到h4中(angal等，1993)。此改变(在图8a中的h4*)并不改变h4活性。

　　在临床前模型中，抗-cd40mab的免疫刺激和治疗作用可通过上调dc上的共刺激分子cd70来介导，从而使得cd8t细胞免疫性增强(french等，1999；french等，2007；sanchez等，2007)。为了比较chilob7/4h1和h2活化人dc的能力，评定其在体外上调原代人朗格汉斯细胞上的cd70表达的能力(图8b)，以及其增强由ifnγ测量的ebv-特异性人cd8t细胞的朗格汉斯细胞诱导的引物的能力(图8c)。与对b细胞的作用一致，chilob7/4h2增强了朗格汉斯细胞cd70表达和cd8t细胞致敏，而chilob7/4h1并不如此。

　　在hcd40tg小鼠中评估chilob7/4同种型的体内激动活性(ahonen等，2002)。初始体外研究证实小鼠细胞中的hcd40响应于与chilob7/4的连接，这与人细胞中类似，因为chilob7/4h2刺激比h1(图8d)大得多的分离hcd40tg小鼠b细胞活化和增殖，所述活化和增殖依赖于hcd40的表达(图9f)。为了测试体内激动活性，评估chilob7/4当与模型抗原ova共同施用时增强cd8t细胞和ab反应的能力。与体外数据一致，chilob7/4h2刺激比使用h1所观察到的显著更大的抗-ovacd8t-细胞扩增以及ab反应(图8e)。因此使用一系列的体外和体内方法，chilob7/4证实了当与h2对比h1或h4恒定区一起表达时更大的免疫刺激活性。

　　当评估抗小鼠cd40mab3/23时也在体内观察到h1与h2激动活性之间的类似差异，其中还是3/23h2而非h1刺激有效的抗-ovacd8t-细胞和ab反应(图8f)并且上调脾脏dc上的cd70(图9g)。重要的时，免疫刺激能力的此差异与治疗活性的差异相关，其中3/23h2而非h1在疫苗环境和治疗环境中提供针对肿瘤发展的保护，在所述疫苗环境中用ova-表达的eg7肿瘤攻击以ova和抗-cd40免疫的小鼠(图9g)并且在治疗环境中用单一100μg剂量的mab治疗具有建立的b细胞淋巴瘤的小鼠(bcl1淋巴瘤模型(white,2014)；图8h)。

　　人igg2活性为fcγr-独立的。

　　h2对fcγriib(bruhns等，2009)的低亲和力、在b细胞上的主导fcγr表明与使用fcγriib作为交联剂的激动性m1(white等，2011)，其活性可为fcγr独立的。实际上，其中可溶性fcγr穿过固定的mab的表面等离子体共振(spr)显示chilob7/4h2与任何人或小鼠fcγr的结合非常少(图11a和图11b)，而chilob7/4h1在相同条件下明显结合hfcγri、iia和iiia以及mfcγri和iv(图11a和图11b)。许多方法证实h2的fcγr独立性活性。首先，pan-阻断的抗-fcγriimab(at10)未能阻止chilob7/4h2对人b细胞的活化，如通过同型粘附和cd23上调所评定的(图10a)。相比之下，at10完全阻断了在fcγii-表达的交联细胞存在下诱导的chilob7/4h1进行的活化(图10a)。

　　其次，通过胃蛋白酶裂解去除chilob7/4h2fc(产生f(ab’)2片段)并不阻止人b细胞的活化和增殖，而fab’的减小消除了活性(图10c)。相比之下，在相同条件下chilob7/4h1当作为igg、f(ab’)2或fab’加入时不能活化细胞，尽管过量加入时每种形式均防止由chilob7/4h2进行的活化(图10b；图11f)。第三，来自小鼠b细胞的遗传缺失的fcγriib为这些细胞表达的唯一fcγr，它并不阻止响应于广泛浓度范围的chilob7/4h2的增殖(图10c)，而对活性依赖于fcγriib交联的chilob7/4m1的反应(white等，2011)已丧失(图10c)。注意，chilob7/4h2当用于以不同浓度刺激b细胞时产生特征性‘钟’形反应曲线并且在非常低水平为有活性的，这与活性随着浓度升高而增加的交联依赖性chilob7/4m1相反(图10d)。这些不同曲线据推测反映了同种型赋予激动活性的不同机制并且在下文中进一步讨论。

　　还在体内证实了chilob7/4h2的fcγr-独立性活性。遗传缺失的fcγriib先前显示导致mab针对cd40(li和ravetch,2011；white等，2011；white,2014)、fas、dr4和dr5(li和ravetch,2012；wilson等，2011；xu等，2003)的激动活性丧失，与野生型(wt)小鼠中观察到的相比，它并不减少由chilob7/4h2诱导的ova-特异性cd8t细胞的扩增，而正如预期的，chilob7/4m1的活性在fcγriibko中丧失(图10d)。在不具有激动性fcγr的γ链ko小鼠中两种mab均保留活性(图10d)。最后，当作为f(ab’)2片段施用时chilob7/4提供强烈的体内cd8t细胞反应刺激，而使用chilob7/4h1的f(ab’)2时未观察到反应(图10e)。

　　人igg2对多种靶标具有激动性。

　　然后在临床试验中评价h2恒定区对另一种hcd40mabsgn40(也称为嵌合h1)的活性的影响(advani等，2009)。由亲本序列合成sgn40的可变区并将其嵌合到h1和h2恒定区上，以产生sgn40-sotonh1和h2。与chilob7/4类似地，sgn40-sotonh2提供比sgn40-sotonh1更大的人b细胞活化和增殖(图12a)并且hcd40tgb细胞响应于sgn40-sotonh2而非其亲本m1sc26的增殖(hanks等，2005)独立于fcγriib表达(图12b)。另外，sgn40-sotonh2显著且有效地增加了fcγriibko小鼠中的体内ova-特异性cd8t细胞反应，而sgn40-sotonh1并不如此(图12c)。在临床开发中使用针对另外两种共刺激受体h4-1bb和hcd28的mab的进一步研究显示了由人t细胞体外增殖评定的h1与h2激动功能的类似差异(图12d-图12e)。对于hcd28，使用纯化的t细胞。t细胞通常缺乏fcγr但显示出同型粘附和响应于抗-hcd28h2的增殖增加，再次支持了fcγr-独立性作用模式(图12e)。与chilob7/4(图8a)类似的，在纯化的t细胞培养物中h4恒定区并未赋予抗-hcd28活性(图12e)。

　　h2活性取决于人igg2ch1和铰链区。

　　由于h1和h2chilob7/4mab的可变区相同并且h2的活性独立于其fc结构域，所以评价chilob7/4h2的ch1和铰链结构域在激动活性中的作用。为此，产生其中chilob7/4h1和h2的单独ch1结构域或ch1和铰链结构域二者转换的突变体(图13a)。结构域交换并不干扰抗原结合，如通过流式细胞术评定的(图14)。不同mab的比较性激动活性通过其促进人b细胞活化和hcd40tgb细胞体外增殖的能力来评定(图13a)。当h2的ch1结构域被h1的该结构域(ch11/2)替换或者h1的ch1被h2的该结构域(ch12/1)替换(图13a，(i)和(ii))时，可见少量b细胞增殖并且未活化人b细胞，除非提供表达高水平fcγriib的细胞来交联mab。因此单独h2ch1结构域(在ch12/1中)或单独h2铰链区(在ch11/2中)并不赋予活性。类似地，当h2的ch1和铰链被h1的ch1和铰链替换(ch1hge1/2)时(图13a(iii))未见活性。然而，当h1的ch1和铰链被h2的ch1和铰链替换(ch1hge2/1)(图13a(iv))时观察到fcγriibwt和kohcd40tgb细胞二者的剧烈人b-细胞活化和增殖，这与使用天然h2所观察到的类似。类似地，在体内，chilob7/4ch1hge2/1产生ova-特异性cd8t-细胞扩增的显著增加而ch1hge1/2为无活性的(图13b)。这些数据显示h2的不常见激动活性需要其ch1和铰链结构域。

　　人igg2活性依赖于其二硫键构型。

　　igg2在人igg中的独特之处在于其‘改组’ch1和铰链区内的二硫键(图18)从而产生一系列亚型的能力(dillon等，2008；martinez等，2008；wypych等，2008；zhang等，2010)。据信所述分子以其“h2a”形式合成，其中ch1中的重链(hc)cys127连接至轻链(lc)中的cys214，然后在血液中通过一系列中间体(liu等，2008)逐渐转化成其‘h2b’形式，其中hccys127和lccys214与hc铰链cys232和cys233形成二硫键(图18a)。重要的时，生理化学特性(dillon等，2008)和电子显微镜检查(ryazantsev等，2013)表明h2a具有经典的igg柔性‘y’构象，而h2b采用更紧密的形状，其中fab’臂与铰链紧密保持在一起。h2a和h2b形式可通过非还原性毛细管电泳(nrce-sds；(martinez等，2008))区分，其中它们与h1的单峰相比被显示为未分离h2中的双峰(图18b)。在以上分析的chilob7/4mab突变体中，仅ch1hge2/1在nrce-sds上保留双峰(图18b)，这支持以下假设，二硫键改组对于激动活性为重要的。

　　为了确定不同二硫键合形式的chilob7/4是否与不同激动活性相关，采用两种方法。首先，在变性剂存在或不存在下在氧化还原缓冲液中chilob7/4的化学‘倾向’分别用于富集h2a或h2b(dillon等，2008)(图15a，顶部图)。这产生显著不同的活性，其中使用倾向的h2b产生比h2a大得多的hcd40tgb细胞活化(图15a)。当将倾向形式加入到人b细胞中时对于以下各项观察到类似的b细胞活化差异(图16a)：倾向形式的chilob7/4ch1hge2/1突变体(图16b)和抗小鼠cd40mab3/23，其中3/23h2b能够以可溶形式活化小鼠b细胞，而h2a需要与表达fcγriib的交联细胞共孵育(图15b；这些细胞表达非生理高水平的能够交联h2的fcγriib(white等，2011))。h2b倾向形式的chilob7/4还能够作为完整igg(图15d(i))或作为f(ab’)2片段(图16c)活化fcγriibkob细胞，这证实其活性保持为fcγr-独立的。其次，使用诱变产生如先前所述的‘锁定’h2a-和h2b-样形式(allen等，2009；martinez等，2008)。chilob7/4的hcc232s或c233s突变产生同源h2amab，如通过nrce-sds评定的(图15c(hcc232s,hcc233s))，所述h2amab在所测试的广泛范围的任何浓度下并不刺激hcd40tg小鼠b-细胞增殖(图15d(ii)和(iii))，而h2b-样hcc127s突变体(图15c(hcc127s))对于fcγriibwt和ko细胞显示相对于高浓度天然h2增加的活性(图15d(iv))。

　　这些合并的数据表明h2的fcγr独立性激动活性取决于在其铰链和ch1结构域中的精确二硫键构象，并且确切地说取决于其采用更紧密h2b形式的能力。通过cd40连接进行免疫活化似乎需要在细胞膜上的受体成簇，以允许traf募集和细胞内信号向下游传导。通过nfkb活化介导了许多作用(elgueta等，2009)。使用原代hcd40tgb细胞(图15e)和转化的人ramosb细胞(图16d)的实验显示chilob7/4h2b与h2a相比大得多的活化nfkb的能力，如由细胞刺激之后大大增强的ikb磷酸化所反映的。这与更紧密h2b促进cd40在细胞膜上成簇从而导致nfkb信号传导和细胞活化的能力一致。

　　诱变产生一定范围的igg2激动活性。

　　进一步研究显示chilob7/4h2可被操纵来实现一定范围的激动活性。lccys214突变成ser阻止了lc-hc二硫键合，从而在nrce-sds上产生两个峰(图15c(lcc214s))。然而，在非变性条件下mab保持完整而与cd40的结合没有减少，如通过spr(图15f)或流式细胞术(图16e)所测量的。lcc214s引起hcd40tgb-细胞增殖的增加，这与c127s突变体类似(图15d(i))。然而，lcc214s与hc232s组合得到与天然h2类似的曲线，其中活性在高浓度下极大地减小(图15d(ii))，而lcc214s与hcc233s组合提供了与倾向的h2b类似的最大活性(图15d(iii)对比(i))。如本文所述，天然chilob7/4(各亚型混合物)当用于在体外刺激b细胞时产生特征性‘钟’形浓度曲线，其中b细胞反应在搞浓度下较低(例如，图10d、图12b和图15d(i))。此作用在使用纯h2b的情况下极大地丧失，其中高浓度保留全部活性(图15d)，但在使用h2a和h2b的1:1混合物的情况下再现该结果(图15g)。如果完全缺乏对h2a形式的反应，那么这表明h2a可阻断h2b的活性，从而减小其高浓度下的功效并且表明h2a具有一定水平的拮抗活性。最后，概括chilob7/4h2a和h2b活性在体内的差异，其中在hcd40tgfcγriibko小鼠中h2b引起比h2a显著更大的ova-特异性cd8t细胞(图15h)和ova特异性igg(图15i)的扩增。对于h2a和h2b倾向形式的ch1hge2/1突变体观察到类似的体内活性差异(图16f和图16g)。总之，数据表明h2的二硫键结构的操纵使得能够产生具有限定和不同的免疫刺激功能的治疗剂，重要的是所述功能独立于fcγr在靶组织中的存在。

　　在实施例中进一步描述所进行的实验并且在下文中更详细地描述了本文所用的材料和方法。

　　实施例

　　在实施例1-7中使用的材料和方法

　　小鼠

　　c57bi/6和rag-/-小鼠来自charlesriverlaboratories(kent,uk)。其他遗传改变的品系(所有均在c57bl/6背景下)为c57bl/6fcγriib-/-、otitcr转基因品系(来自dr.matthiasmerkenschlager,imperialcollege,london)和人cd40转基因品系(hcd40tg)(来自randolphnoelle(kingscollege,london))。人cd40tg/fcγriib-/-小鼠通过与由流式细胞术证实的基因型杂交育种来获得。繁殖动物并在当地动物工厂中养殖动物并且使用约8-12周大的动物。所有实验均根据当地伦理学协会指南在ukhomeoffice许可证编号ppl30/2451和ppl30/2964下进行。

　　抗体和试剂

　　使用以下杂交瘤：抗人cd23(mhm6)来自jgordon(universityofbirmingham)。在室内使用常规杂交瘤技术产生结合fcγriia和iib(33)的抗人fcγrii(at10)、抗人cd40(lob7.4；(22))和抗人4-1bb。抗小鼠cd19-pe(克隆1d3)、抗人cd19-pe(克隆rfb9)来自abdserotec(oxford,uk)。抗小鼠cd23-pe来自bdbiosciences。对于oti细胞染色，使用apc-标记的抗-cd8α(克隆53-6.7；bdbiosciences)和先前所述的在室内产生的pe标记的siinfekl四聚体(12)。使用facscaliber(bdbiosciences)进行流式细胞术。鸡卵清蛋白(ova)购自sigma-aldridge(poole,uk)。无内毒素ova来自ag(regensberg,germany)。

　　嵌合抗体

　　编码不同抗体的重链和轻链可变区的dna构建体从杂交瘤中通过pcr反应扩增或者通过genewiz,inc合成。sgn40-soton和tgn1412-soton使用公布序列(美国专利号wo2007/075326和us7,585,960)产生。将可变区亚克隆到含有不同抗体同种型的恒定区的表达载体(重链的pee6.4载体和轻链的pee12.4载体，lonza)。将重链和轻链载体进一步亚克隆在一起，之后转染到293f细胞以瞬时产生抗体或者转染到cho-k1细胞中以稳定产生抗体。通过蛋白a-琼脂糖(sigma-aldrich)色谱法纯化分泌的抗体并且通过凝胶过滤经由sephadex200(sigma-aldrich)去除聚集物。所有制备物均含低内毒素(<1ng/mg蛋白质)，如通过endosafe-pts便携式测试系统(charlesriverlaboratories)测定的。

　　免疫和免疫反应的评定

　　如对个别实验详述的，经由尾静脉注射200μl生理盐水来免疫小鼠。通过elisa测定血清抗-ovaab水平(34)。在一些实验中，在免疫前一天经由尾静脉给予3x105脾脏ova-特异性脾脏cd8(oti)t细胞。oti细胞制备物消耗b细胞，之后使用抗-cd19-pe和抗-pe微珠(miltenyibiotech)注射。

　　肿瘤治疗

　　对于针对表达ova的肿瘤的疫苗eg7，在d-6时用5x104oti细胞过继转移小鼠，接着在d-5时接受0.5mgsigmaova+100μg抗-cd40mab。在d0时用5x105eg7肿瘤细胞皮下攻击小鼠。监控肿瘤生长并且在达到人道终点时处死小鼠(在任何方向上肿瘤>1.5cm)。如先前所述地进行b细胞淋巴瘤(bcl1)治疗(18)。

　　细胞活化和增殖

　　树突状细胞：对于显微镜检查，在用100μg抗-cd40mab静脉内注射后2天从rag-/-小鼠收获脾脏并且如先前所述地对cd70和midc8进行切片染色(12)。如先前所述地分离人原代朗格汉斯细胞(lc)(35)。简言之，在根据helsinkiguidelines由南安普顿和南西汉普郡研究伦理委员会(southamptonandsouthwesthampshireresearchethicscommittee)批准并获得正式书面同意之后从健康个体获取皮肤样本。在20h酶促消化(disopase,2iu,gibco,uk)分离出上皮层。在从上皮层迁移48h后收集lc并且通过optipreptm密度梯度(axisshield,norway)富集至>70％cd1a+hladr+细胞。将细胞以5x104个细胞/孔接种到96u-底板中补充有青霉素/链霉素(1％,sigma,uk)和fbs(10％,invitrogen,uk)的rpmi1640(gibco,uk)中并且lob7.4人igg1或人igg2抗体或同种型对照(0.001μg/ml-10μg/ml)刺激18h。通过流式细胞术评定活化标记物(cd40、cd86、cd70,bdbiosciences,uk)在cd1a+hladr+(bdbiosciences,uk)lc上的表达。

　　b细胞：使用磁性阴性选择试剂盒(miltenyibiotechorstemcelltechnologies)从脾脏(小鼠)或周围血液单核细胞(pbmc，人)中纯化b细胞。从血液锥体细胞中分离人pbmc(淋巴细胞分离剂，axis-shield)，所述血液锥体细胞通过国家血液中心(southamptongeneralhospital)从不具名健康供体中获得。将细胞以1x105个细胞/孔接种到具有不同浓度的mab的96-孔圆底盘中，如对于个别实验所述的。对于人细胞，使用具有和不具有重组人il-4(20ng/ml)的培养。在一些情况下，还加入用人fcγr转染的1x105个293细胞。如先前(white等(2011))所述地进行转染。为了评定活化，在孵育过夜后对细胞进行拍照(具有cc12软成像系统的olympusckx41显微镜)并且通过流式细胞术(facscalibur,bdbiosciences)分析活化标记物表达。在培养5天(小鼠)或8天(人)之后通过[甲基-3h]胸苷(perkinelmer,cambridge,uk)结合评定增殖，如(white等，(2011))所述的。

　　t细胞：用2mmcfse标记人pbmc并且接着在如(36)所述的24孔板砖以高密度预培养2天，其中每孔1.5ml细胞，1x107个/ml。洗涤预培养的细胞并且以1x106个/ml重新悬浮以用于测定。对于一些实验，使用总t细胞分离试剂盒(miltenyibiotec)从预培养的pbmc中分离出t细胞。对于抗-h4-1bbmab，将96孔圆底板的孔用pbs中的0.02μg/mlokt3涂覆4h，接着洗涤两次并将105pbmc/孔用5μg/mlmab(最终体积150μl)孵育5天。通过流式细胞术分析cfse稀释液来评定cd4+细胞的增殖。对于抗-cd28mab，在未涂覆孔中用mab孵育105个分离的t细胞并且如上所述地评定增殖。结果表示为分裂细胞百分比。

　　表面等离子体共振

　　使用biacoret100评定可溶性fcγ受体与3/23和lob7.4mab同种型之间的相互作用。通过标准胺偶联根据制造商说明书将抗体或作为对照的bsa以高密度(15,000ru)和低密度(1,000ru)固定至cm5传感器芯片(biacore)的流动细胞中。将可溶性fc受体(fcγri、iia、iib、iiia和iiib，randdsystems,abingdon,uk)以200、100、50、25、12.5和6.25nm(在50nm点，重复两次进行)注射通过hbs-ep运行缓冲液(biacore)中的流动细胞中，流速为30μl/min。将可溶性fc受体注射5min并且监控解离10min。自动减去对照流动细胞的背景反应。

　　统计学分析

　　使用graphpadtmprism软件(graphpadtmsoftware,inc.,lajolla,california)进行学生t-检验(非成对)。对于ab反应的比较，对数据进行对数转换，随后进行分析。当分析前对数转换的p<0.05时接受显著性。当p<0.05时接受显著性。

　　实施例1

　　实施例1涉及图1(a)-图1(f)中显示人igg2赋予抗-hcd40mablob7.4fcγr独立性激动活性的实验。图(a)显示其中纯化的hcd40tg小鼠脾脏b细胞用200ng/ml指定的同种型lob7.4mab孵育的实验结果。通过在孵育过夜后的细胞团聚(顶部图)和cd23上调(中部图；填充灰色直方图，未处理对照，黑线处理的细胞)以及作为增殖量度的3h胸苷掺入量(底部图；三份样品的平均值+/-se)评估b细胞活化。示出来自7个实验中的1个的数据。图(b和c)示出其中hcd40tg小鼠用0.5mgsigmaova+100μg指定的mab免疫的结果。分别在8天和14天后测定循环siinfekl-特异性内源性cd8+t细胞(b)和抗-ovaab(c)。示出来自2个实验的组合数据(n＝7)。图(d)示出其中hcd40tgb细胞与(a)中一样用1μg/mllob7.4h1和h2完整igg、fab’2或fab’片段孵育16h后进行分析的实验结果。(所示5个实验中的1个)图(e)示出其中作为fcγriib+/+(wt)或fcγriib-/-(ko)的hcd40tgb细胞用1μg.ml指定的lob7.4mab孵育并与(a)中一样进行分析的实验结果。示出来自5个实验中的1个的结果。(f)作为fcγriib+/+(wt)或fcγriib-/-的hcd40tg小鼠用oti细胞过继转移，接着用100？gsigmaova+100μg指定的lob7.4mab免疫。在5天后列举循环oti细胞。值为三次重复小鼠的平均值+/-sd。示出来自2个实验中的1个的结果。

　　实施例2

　　此实施例涉及在图2中示出人igg2赋予其他抗-tnfrsfmabfcγr-独立性活性。图(a)包含其中人b细胞用抗-hcd40mabsgn40-sotonh1或h2孵育的实验结果和如图1(a)中评定的活化和增殖。图(b)包含其中响应于200ng/mlsgn40h1和h2或sc26m1(sgn40亲本mab)而发生的hcd40tgb细胞增殖(wt或fcγriib-/-)与图1(e)中一样地评定的实验结果。示出来自2个实验中的1个的结果。图(c)包含其中响应于嵌合h1和h2的人t细胞增殖为pbmc培养物中的抗h4-1bb或纯化t细胞培养物中的抗-hcd28。示出用于比较的同种型处理的对照(c)。在下部图中的照片为用抗-cd28h1和h2处理的纯化t细胞。

　　实施例3

　　此实施例涉及在图3(a)-图3(d)示出h2ch1和铰链区赋予lob7.4fcγr-独立性激动活性的实验。图(a和b)包含天然(a)或其中ch1(ch11/2和ch12/1)或ch1和铰链区(交联1/2和交联2/1)已交换(b)的lob7.4h1和h2mab的(顶部)示意图。在这些图的中部图中，示出与未刺激细胞(灰色直方图)相比，在用指定的mab孵育过夜后在人b细胞上的cd23表达(黑线)。在这些图的底部图中，通过3h胸苷掺入量来评定响应于各种浓度的嵌合mab的hcd40tgfcγriib+/+(wt)或fcγriib-/-(ko)b细胞增殖。在(a)中比较了响应于lob7.4h1、h2和m1的增殖。(c)hcd40tg小鼠用oti细胞过继转移，接着用0.5mgsigmaova加上100μg所指定的lob7.4h1或h2或者嵌合铰链1/2或铰链2/1免疫。示出反应峰值(第5天)的循环oti细胞(平均值+/-sd,n＝6，从2个实验中组合)。*p<0.05**p<0.01。(d)lob7.4h1、h2和嵌合mab的ce-sds曲线。

　　实施例4

　　此实施例涉及在图4(a)-图4(e)中示出lob7.4h2的激动活性依赖于其形成h2b构象的能力的实验。图(a)包含ce-sds曲线并示出响应于lob7.4天然h2或化学倾向于其h2a(‘a’倾向)和h2b(‘b’倾向)形式的h2的hcd40tgb细胞增殖。示出2个实验中的1个的结果。图(b)包含具有指定点突变的lob7.4mab的ce-sds曲线。lcc214s突变防止了hc和lc共价键合并且因此这些形式在电泳上为分离的。指示完整igg、hc-hc复合物(hh)、游离lc(l)和内部10kda标记物的位置。图(c)示出fcγriib+/+(wt)或fcγriib-/-(ko)hcd40tgb细胞响应于不同浓度的操纵lob7.4mab的增殖。(示出来自至少3个实验中的1个的结果)。图(d)示出hcd40tgb细胞响应于天然lob7.4h2、h2a(hcc233s)、倾向的h2b或h2a:h2b的1:1混合物的增殖。(示出来自>5个类似实验中的1个的数据。)图(e)示出结合固定hcd40的指定lob7.4h2突变体的spr曲线。所用的mab浓度为：100、20、4、0.8和0.16nm，hcd40～8000ru。在1200ruhcd40下获得类似结果。

　　实施例5

　　此实施例涉及在图5(a)-图5(e)中示出抗小鼠cd40mab3/23的同种型依赖性的实验。图(a和b)包含其中小鼠用oti细胞过继转移接着用不具有(对照)或具有100μg指定3/23mab的500μgsigmaova或100μgendoova免疫的实验结果。在(a)和(b)中分别在5天和14天后测量循环oti细胞和抗-ovaab浓度。结果对于三次重复小鼠为平均值+/-sd并且表示5次(sigmaova)或3次(endoova)实验中的1个。(*p<0.05**p<0.01)。图(c)包含其中施用100μg指定3/23同种型的小鼠的脾切片进行cd70(绿色，左图)和dc标记物midc8(红色，中间图；在右图中合并)染色的实验。(条＝100μm)。图(d)示出其中c57bl/6小鼠用oti细胞过继转移、用ova+100μg指定mab免疫并在五天后用eg7肿瘤皮下攻击的实验。示出来自2个实验中的1个的5只小鼠组的存活曲线。m1和h2的曲线彼此重叠。(e)balb/c小鼠用1x104bcl1肿瘤细胞静脉内注射。在十四天后,当肿瘤代表5％-10％总脾细胞时,小鼠接受单次100μg静脉内剂量的指定3/23h1或h2或pbs(对照)。示出来自2个实验中的1个的5只小鼠组的存活。

　　实施例6

　　此实施例涉及在图6(a)-图6(e)中证实lob7.4人igg2对人细胞的活性比人igg1更大并独立于fcγr相互作用的实验。图(a)示出其中人周围血液b细胞用1μg/ml的lob7.4h1或h2孵育并与图1(a)中一样分析细胞活化和增殖(除了在8天后评定增殖之外)的实验。示出>10个单独实验中的1个的结果。图(b)包含其中来源于朗格汉斯细胞的人皮肤用lob7.4h1或h2或同种型对照mab孵育18h并且通过流式细胞术分析cd70表达的实验。(示出来自2个实验中的1个的结果)。(*p<0.05**p<0.01)。图(c)示出与人fcγr结合的lob7.4h1和h2的表面等离子体共振(spr)传感图。使用以1,000或15,000ru固定的mab获得类似的结果。图(d)示出其中cfse-标记的人b细胞用lob7.4h1或h2加上未转染293细胞(对照)或表达高水平的指定人fcγr的细胞孵育的实验。在8天后通过流式细胞术分析cfse稀释液来评定b细胞增殖。灰色直方图表示未刺激细胞。图(e)示出其中分离的人b细胞在50倍过量at10fab’2和/或表达高水平指定hfcγriia的293细胞存在或不存在下用lob7.4h1或h2孵育16h的实验。将cd23表达(黑线)与未刺激细胞(灰色直方图)进行比较。

　　实施例7

　　此实施例涉及在图7(a)-图7(d)中证实h2a和h2b的拮抗和激动特性的实验。图(a)示出天然3/23h2或化学倾向于其h2a和h2b形式的h2的nrce-sds曲线。图(b)示出在表达fcγriib的交联细胞不存在或存在下用天然或倾向形式的3/23h2孵育的小鼠b细胞上的cd23表达上调。(示出3个实验中的1个)。图(c)示出小鼠b细胞响应于指定浓度的3/23h2a和h2b的增殖。图(d)示出hcd40tgb细胞wt或fcγriibko响应于单独的sgn40-sotonh2或与lob7.4hcc233s(h2a)的1:1混合物的增殖。(示出来自2个实验中的1个的重复两次样品的平均值和范围)。

　　以下方法和材料用于实施例8-16中所述的实验中。

　　材料和方法

　　小鼠

　　c57bi/6和rag-/-小鼠来自charlesriverlaboratories(kent,uk)。其他遗传改变的品系(所有均在c57bl/6背景下)为fcγriib-/-(boross等，2011)、otitcr转基因品系(由dr.matthiasmerkenschlager,imperialcollege,london惠赠)和人cd40转基因品系(hcd40tg)(由randolphnoelle(kingscollege,london)惠赠)(ahonen等，2002)。人cd40tg/fcγriib-/-和g链-/-小鼠通过与由流式细胞术证实的基因型杂交育种来产生。繁殖动物并在当地动物工厂中养殖动物并且使用约8-12周大的动物。所有实验均根据当地伦理学协会指南在ukhomeoffice许可证编号ppl30/2451和ppl30/2964下进行。

　　抗体和试剂。

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