DNA胶回收回收率如何提高的一点感悟

栏目：科技资讯时间：2023-07-31

　　跑胶+胶回收是一种DNA纯化方法，本人好奇限制其得率的因素是什么？比如我酶切-跑胶-胶回收，酶切后（假设100%）计算还有6000ng，胶回收洗脱量总计就600ng。不知道损失因素在哪里？

　　想必来查这条消息的人都遇到过胶回收回收率不高的问题吧，这里我分享一点自己在实验中的感悟，之前我的胶回收回收率常不足百分之一（┭┮﹏┭┮），在经过我自己查资料（知乎、豆瓣、CNKI、以及各大公司说明书），询问师兄师姐和自己实验得出了一些能够提高胶回收回收率的办法，希望对大家有用~

　　1.溶胶之后可以在室温下静置3分钟（或适当调节）后再离心过柱子；这一条的理论依据来源于我们试剂盒的名称“DNA胶回收吸附柱”，有多少小伙伴跟我一样最开始把这东西当滤膜啦，这玩意的原理是特异性吸附，要给他时间吸附结合DNA才行哇，不然DNA都在下面的收集管了（可以去测收集管的A260吸光值验证），基于这个原理，可以初期结合时间短一点，后期结合时间长一点。另外，关于要不要冷吸附和热洗脱，这个东西没有定论，在豆瓣上有说可以的，但是我在碧云天试剂盒的说明书上看到了“不可冷吸附”的标注，因此“冷吸附热洗脱”不作为一个通用的办法。（说明书我随后截图补发）

　　2.洗脱的时候适当增加洗脱液（ddH2O）的用量（单次20微升），目的是保证液体全覆盖整个膜面，把吸附的DNA都洗脱下来；我最开始为了提高浓度甚至把ddH2O的用量降低到每次10微升，然后也不把这个吸上来就再加10微升洗脱，这样同样为20微升，但是我每一次都没有把膜面覆盖全，相当于我的DNA都在膜面上了。为了提高回收率，可以把收集管中的20微升吸上来再洗脱一遍（注意，不是20微升分为两个10微洗两遍，是20微升洗一遍吸上来再洗一遍，因为原理是吸附与溶解而不是过滤，不用担心再滤一遍有损失）。

　　3.这一条虽然不能提高回收率，但是可以提高洗脱后浓度，达到下一步实验的要求。可以“大力出奇迹”扩大基数，比如多酶切几管，把几管回收到一个吸附柱里（不用担心饱和，因为吸附柱的承载一般都是微克级别的，而我们测的浓度是纳克每微升级别的，乘以体积不会超过总承载量，承载量一般说明书上都会有），这样DNA总量上去了，纵使洗脱率低，也能有不错的浓度，当然，这一条不如前两条在原理上解决问题，但是确实很暴力，很好用（呜呜呜，因为多切了几管载体就被师姐骂了）。同理，可以将几管菌液离心到一管里，使得提取的质粒浓度较高（比方说2000纳克每微升的质粒胶回收纵使百分之一点多也有20~30纳克每微升，足够T4连接和同源重组了，2000纳克每微升亲测可以酶切开），从而再低的回收率也能有还行的浓度。

　　最后，如果大家有其他的方法或原理上的理解欢迎在评论区补充哦~

　　当然还是要推荐大家多查，多交流，遇见个愿意教你师兄师姐还好，遇见个不愿意教你的师兄师姐就只能自力更生了（呜呜~）

　　如果使用了和聚合酶一致的条件，从你可以获得单一目的条带来看，扩增条件再优化对目的条带的浓度影响应该不大，可以适当增加循环数来提高目的条带浓度，这是最笨又最简单的方法。另外pcr模板还是不要稀释了，应该很容易得到的，你要是30微升用完了还搞不定那就肯定有问题了。最后，我偷偷告诉楼主，日常实验中，经常回收后压根就看不到目的条带，但是照样可以进行转化而且拿到了正确克隆，所以对于你这样还可以看到目的条带的（不知道回收完是不是还要进行酶切，如果需要，建议不要回收，直接pcr产物酶切，然后再回收，避免多次回收损失），我建议可以继续进行克隆，只是连接体系适当加大，比如20微升，目的是让你可以尽量多的加入目的条带，这样挑到几个转化子还是可以的，祝好！

　　DNA有关胶回收效率的方法：

　　DNA回收纯度取决于纯化介质对DNA吸附的特异性、洗涤杂质是否彻底。而DNA回收率和浓度则与elution buffer的体积，以及buffer在柱子上停留的时间有关。较大的洗脱体积可以提高回收率，充分洗脱，但是会造成产物浓度太低不好用。比如100-200ul的洗脱液可以彻底洗脱纯化柱吸附的DNA，不过考虑到后继实验的方便，建议使用50ul的洗涤液，正对加入膜中央（避免加在管壁上而不能充分接触纯化介质），可以完全浸润回收柱上的纯化膜。最低建议采用30ul洗脱液，但是可能会降低回收率。有人试过用15—25ul洗脱2次，觉得这样第一次浓度高第二次比较充分，其实没有必要，只要适当延长在柱上停留的时间，就有助于提高得率。　　其他的技巧也比较传统的的，比如切胶的时候要尽量减少切胶体积（不超过400mg），由于Qiaquick柱子的载量达到10ug，如果胶块实在太大而预期DNA总量不超过10ug，可以用大一点的管溶解，分几次上柱离心吸附后再洗涤。注意的是紫外照射时间不要太长，因为紫外线对DNA（特别是对于较大的片段）有影响。还有就是溶胶要彻底，用枪头把胶块弄碎一点有助于50度下快速溶解。溶解完全后溶液的颜色指示溶液的pH值，如果变色需要调pH值以防止实验失败。需要用ddH2O或者TE洗脱的，注意pH在 7.0—8.5之间的回收率最高。回收率和片断大小、多少有关，较大的片断（7kb以上）回收率会有所降低，洗脱液预热到50度再加入纯化柱膜中央，有助于提高产率。

　　1 提高胶回收量的技巧

　　1) 增加电泳时的上样量。

　　2) 电泳缓冲液用新鲜配制的。

　　3) 切胶时尽量只切有条带的胶，减小切胶体积：含目的片断很少的胶就不要要了，不然影响回收率。

　　4) 把切的两块或多块胶融化后，无论多大的体积都用一个管子，转移到同一个柱子上。

　　5) 溶胶时所加的溶液可多一点，这样更有利于DNA与膜的结合，不过一般不要多余750ul。

　　6) 胶回收的关键是通过柱子的溶液的盐浓度、酸碱性(电荷)和疏水性使DNA与柱子结合。

　　因此，若电泳缓冲液的PH偏高，可在溶胶液中加入10ul(PH 5.0，3mol/L的 NaAC);为了使DNA分子更好的拦截在膜上，可以添加30%异丙醇在加热溶解胶后的液体里。

　　7) 加洗脱液之前，将柱子在室温放置几分钟(大约需10分钟)，以使乙醇充分挥发。

　　8) 最后少加些洗脱液，尽量减少回收体积，一般用30-50μl洗脱液洗脱(不能太少，否则无法浸湿膜反而不利于洗脱);洗脱液滴在膜中央，以充分洗脱结合在膜上的DNA。

　　9) 可以在加入洗脱液之后，可以在55度水浴5分钟或放在50度水浴10分钟以上再洗脱，或用封口膜密封4度过夜，第二天再离心回收，效果不错。

　　10) 将离心后的洗脱液加回吸附柱，再次离心。

　　2 PCR 产物回收的详细方法和步骤

　　1) 普通胶回收

　　如果要胶回收，最好还是用试剂盒，方便，回收率也略高，实在要手工回收，可以切胶后加入3倍体积TE，水浴熔化后，酚、酚/氯仿抽提干净，乙醇沉淀即可。

　　2) 从低熔点凝胶回收DNA

　　纯化DNA片段加与凝胶体积相等的TE(10mmol/l Tris-HCl pH8.0，0.1mmol/l EDTA )，置65℃水浴5分钟保温，使凝胶完全溶解。

　　待放至室温，加等量酚(TE饱和，TE封在上层，取下层酚)，轻轻混匀(不用混匀)，12000rpm，3分钟离心。反复1-2次。

　　取上层液，加0.1体积3mol/L醋酸钠(pH5.2)和2.5倍体积无水乙醇，进行乙醇沉淀。将纯化的DNA加适量TE溶解，测定含量，备用(可用于目的基因结构分析，探针制备等)。

　　3) 扩增特异性好的PCR回收

　　如果PCR扩增特异性好，只是简单的PCR产物纯化回收，可以在PCR产物中加入50ug/ml 的蛋白酶K，37度1h，酚/氯仿抽提一次，氯仿抽提一次，上清加入0.1体积的醋酸钠，2.5体积的无水乙醇沉淀回收。

　　本篇文章，未成年人请在家长陪同下观看

　　FBI Warning1849年，一家名不见经传的公司出现了。这家公司在业内名声不显、能力平平，主攻的心绞痛却是当时的“不治之症”。谁也不会知道，就是这样一家公司，歪打正着的发明了人类历史上首款正儿八经的“壮阳药”。

　　壮阳药的历史渊源非常久远，看来古人也对这方面忌不自信。西汉时期的《神农本草经》中记载了许多药方，譬如：淫羊藿。（光看这个名字就很不正经），到了《本草纲目》里面那简直是满汉全席，分类更为详细和全面……（嗯，专业）

　　图片来自百度前些天上网冲浪，无意间瞥到一篇文章

　　微基因WeGene：把木乃伊磨粉内服外用，欧洲人太野了吧！文章截图好家伙，吃这玩意儿能硬起来的当真是猛士，西方人果真有“冒险精神”

　　但是这些都是虚头巴脑的东西，木乃伊粉就算了，纯粹的以讹传讹，中药勉勉强强说得过去，不知全貌不做评论。也就是说，在伟哥还没研制出来之前，世界上真的一个能打的都没有……

　　当然，伟哥的初心也不是这种奇奇怪怪的方向……

　　上个世纪九十年代，心绞痛还是不治之症，世界上很多公司都在紧锣密鼓的研制主治药物，我们今天的主角——辉瑞公司也在其中。当时治疗心绞痛的主要方向是通过药物使血管壁平滑肌舒张，血管扩张，减轻心脏压力，缓解疼痛。

　　n年前的图，拿出来鞭尸图片来自作者生物竞赛老师PPT截图，当时讲到这一段全班哄笑，充满了快活的气息可惜的是，辉瑞公司的药物对缓解心脏压力的效果十分不理想。

　　但正当公司想要砍掉这个项目并研发别的赚钱的项目时，派下去回收药丸的工作人员一脸懵逼的报告：“老板，男病人们都不愿意交还药丸，甚至……甚至我们还有了几笔订单……问他们为啥他们也不说……”（本对话为作者虚构，请勿当作确切史实）

　　唉，等等……男人……难言之隐……血管平滑肌舒张……充血……

　　（未曾设想的道路）

　　本着“赚钱嘛，不寒碜”的心态，辉瑞公司大笔一挥，定向改良伟哥后迅速投放市场，成为了直到今天都风靡全球的一款药物。

　　传入中国后，那些王伟、张伟、李伟等一系列“伟哥”都被迫改了外号，成为了“王哥”、“张哥”、“李哥”。

　　伟哥的名字也废了设计部不少脑细胞，他是Viagra的音译，而Viagra的来源是“精力（vigor）”与“尼亚加拉(Niagara，美国的一个瀑布)”的结合……有画面了！

　　尼亚加拉大瀑布，很美，很汹涌……科学史上从来都不乏巧合，从阿基米德的澡盆[1]，到牛顿脑袋上的苹果[2]；从救死扶伤的加特林[3]，到爱因斯坦的原子弹[4]；从隐藏在锈迹中的青霉素[5]，到装逼打脸的泊松亮斑[6]……这些巧合或造福人类，或引发战争；或推动科技，或阻碍发展；或善，或恶。但唯一肯定的是，这就是文明，属于人类的文明。