一种用于缺血性脑卒中疾病的药物组合物及其制备方法和用途与流程

　　1.本发明涉及一种用于缺血性脑卒中疾病的药物组合物及其制备方法和用途，具体涉及一种包含知丹参多酚酸和人重组人尿激酶原的药物组合物，及其制备方法和在制备用于预防或治疗缺血性脑卒中疾病的药物中的用途。背景技术：2.缺血性脑卒中是严重威胁民众健康和医疗财政的重大疾病之一。阿替普酶是中国、美国、欧洲、日本等国的急性缺血性脑卒中防治指南中推荐的溶栓药物。但是，对于发病5小时后的脑卒中患者，阿替普酶溶栓不仅血管开通率降低，并且，常导致血脑屏障的损伤，引发脑水肿和出血，死亡率达5％。缺血性脑卒中溶栓后的血脑屏障损伤，是尚未解决的临床难题。3.人重组人尿激酶原是一种已经上市的具有溶栓作用的基因重组药物，其与血栓接触后，转化为尿激酶，发挥溶栓作用，具有溶栓作用强、再通率高、出血风险小等优点。2011年人重组人尿激酶原被我国食品药品监督管理局批准为急性st段抬高性心肌梗死的治疗用药。2016年，中国食品药品局批准人重组人尿激酶原开展治疗缺血性脑卒中的新适应症研究。以往的研究已经证实，在缺血性脑卒中大鼠模型中，人重组人尿激酶原静脉溶栓能够减少脑梗死体积，改善神经行为学功能。4.丹参多酚酸也是一种已经上市的药物，具有活血、化瘀、通脉作用。用于冠心病稳定型心绞痛以及脑血管疾病的治疗。我们前期的研究已经证实了能够减轻缺血再灌引起的大鼠脑微静脉内的白细胞黏附、血管壁过氧化物的产生，微静脉血浆白蛋白漏出，减轻脑梗死和神经元损伤。5.阻塞的血管再通，可引发缺血再灌注损伤，引发脑微血管渗出和出血。因此开发出能减轻溶栓后的再灌注损伤，减轻血管周围水肿和出血等的药物就显得尤为重要。技术实现要素：6.本发明的一个目的是提供一种用于预防或治疗缺血性脑卒中疾病的药物组合物，其活性成分为丹参多酚酸和人重组人尿激酶原。7.本发明的另一个目的是提供用于制备本发明药物组合物的方法。8.本发明的还一个目的是提供本发明药物组合物在制备用于预防或治疗缺血性脑卒中的药物中的用途。9.本发明的发明人通过研究发现，将丹参多酚酸和人重组人尿激酶原联合用于缺血性脑卒中疾病，该组合应用起到很好的溶栓作用的同时，能够显著地抑制人重组尿激酶原溶栓后的脑微血管渗出和脑出血倾向，减小脑梗死体积，改善神经学评分。基于此发现，本发明人完成了本发明。10.一方面，本发明提供一种用于预防或治疗缺血性脑卒中疾病的药物组合所述组合包含丹参多酚酸和人重组人尿激酶原，两者重量比为1∶10至10∶1。11.优选的，其中丹参多酚酸和人重组人尿激酶原的重量比为1∶5至5∶1。12.更优选的，其中丹参多酚酸和人重组人尿激酶原的重量比为1∶3至3∶1。13.最优选的，其中丹参多酚酸和人重组人尿激酶原的重量比为2∶1。14.本发明所述的药物组合，其中所述丹参多酚酸中含有丹酚酸b、丹酚酸d、丹酚酸e、迷迭香酸、紫草酸、异丹酚酸b、丹酚酸y，它们在丹参多酚酸中的重量百分含量分别为45％-80％，0.08％-1.10％，0.20％-4.45％，3.00％-15.00％，2.00％-10.00％，1.00％-6.00％，0.5％-6.00％。15.优选的，本发明所述的药物组合，其中所述丹参多酚酸中的丹酚酸b、丹酚酸d、、丹酚酸e、迷迭香酸、紫草酸、异丹酚酸b、丹酚酸y的含量百分含量分别为45％-70％，0.10％-1.00％，0.80％-4.45％，3.00％-12.00％，2.00％-8.00％，1.50％-4.00％，1.00％-6.00％。16.更优选的，本发明所述的药物组合，其中所述丹参多酚酸中的丹酚酸b、丹酚酸d、丹酚酸e、迷迭香酸、紫草酸、异丹酚酸b、丹酚酸y的含量百分含量分别为44.09％-68.34％，0.12％-0.80％，1.87％-4.45％，3.01％-5.65％，4.26％-7.75％，2.00％-3.69％，2.27％-4.16％。17.本发明所述的药物组合，选自含有丹参多酚酸和人重组人尿激酶原两种活性成分的药物制剂组合物，或分立的含有丹参多酚酸的药物制剂和含有人重组人尿激酶原的药物制剂，两种制剂包装在一起的组合。18.本发明所述的药物组合，其中所述药物组合的制备方法，包括将丹参多酚酸和人重组人尿激酶原混合的步骤，或将丹参多酚酸和人重组人尿激酶原分别制备成注射剂，组合包装在一起，所述组合包装可以将丹参多酚酸制备成注射剂，人重组人尿激酶原制备成注射剂，两种单位剂量的注射剂一起包装在同一个包装盒中，使用时可以分别注射，也可以一起注射。19.本发明所述的药物组合，其中包括所述的药物组合在制备用于预防或治疗缺血性脑卒中的药物中的用途。20.本发明所述的药物组合的制备方法，包括将含所需量的丹参多酚酸和人重组人尿激酶原一起或分别作为药物活性成分，根据制剂学常规技术制备成可供服用的药物组合物，其剂型包括，注射剂，优选干粉注射剂，特别优选冷冻干燥注射剂。21.本发明的注射剂可以不加入辅料或加入一种或多种药用辅料，如：葡萄糖,乳糖,甘露醇,氯化钠,羟丙基-b-环糊精等，然后使用适当的方法制成注射剂。22.本发明中，人重组人尿激酶原属于现有技术，可根据现有技术制备或者采购。23.本发明中，丹参多酚酸属于现有技术，可根据现有技术制备或者采购。包括但不限于采用以下方法制备的丹参多酚酸：24.(a)丹参去杂质、切成小块或粉碎成粗粉，用水热提，提取液调ph至酸性后，滤过；25.(b)滤液上聚酰胺柱，用水冲洗至ph值为中性，再用弱碱性水溶液洗脱，收集碱洗脱液；26.(c)碱洗脱液调ph值到酸性后，上大孔吸附树脂柱，先用水冲洗至ph值为中性，再用含水或无水低级醇洗脱，收集洗脱液；27.(d)洗脱液减压浓缩至无醇，干燥，即得丹参多酚酸。28.其中：步骤(a)中，用水加热提取2～4次，每次0.5小时～2小时，提取地温度为60～100℃(最佳为90～100℃)；提取液用酸调ph值至4以下(最佳为2以下)。29.步骤(b)中，洗脱液弱碱性水溶液的浓度优选范围为0.01％～2％(最佳范围为0.08％～0.5％)；聚酰胺材料为聚己内酰胺(尼龙-6)。30.步骤(c)中，大孔吸附树脂为苯乙烯型；碱洗脱液用酸调ph值到4以下(最佳为2以下)；低级醇的碳原子范围为c1～c5，如甲醇、乙醇等，其洗脱浓度为40％～95％(最佳为60％～95％)，从工业化生产的安全、低成本和工艺简化上考虑，采用95％乙醇进行洗脱，实际效果也令人满意。31.本发明中所称的“有效量”是指丹参多酚酸和人重组人尿激酶原联合应用时能够实现临床上预防或治疗缺血性脑卒中疾病目标的量。32.本发明的注射剂，是单位剂量形式，如分装成不同颜色，不同规格大小的无菌小瓶，每瓶含有药物活性成分0.1-2000mg，小瓶封装后，再置入包装盒子中；还可进一步置入可装有2-100瓶的包装盒子中，方便储存和运输。33.本发明的使用方法包括，将含所需量的丹参多酚酸和人重组人尿激酶原一起作为两种药物活性成分制备成注射剂一起注射使用。也可将含所需量的丹参多酚酸和人重组人尿激酶原分别作成注射剂，分别注射使用。34.本发明的有益效果在于：35.本发明的药物组合，在共同应用或分别应用的过程中，能够显著地抑制人重组人尿激酶原溶栓后的脑微血管渗出和脑出血，减小脑梗死体积，改善神经学评分，两者联合使用具有协同作用。附图说明36.图1a图1b小鼠脑大脑中动脉末端分支处的血栓状态37.a:各组小鼠大脑中动脉末端分叉处血栓状态动态观察。sham，假手术组；thrombus，血栓组；thrombus+rhpro-uk，人重组尿激酶原组；thrombus+tsi，tsi组；thrombus+rhpro-uk+tsi，人重组尿激酶原与tsi联合给药组；每列分别为baseline(凝血酶造模前基础值)、15min(凝血酶造模开始后15分钟)、5h(造模后5小时给药开始)、5.5h(给药结束)、28.5h(给药结束24小时)。黑色箭头指示原位血栓形成位置。bar＝250μm。38.b:各组小鼠大脑中动脉末端分叉处血栓面积统计。*p<0.05vs.sham组，#p<0.05vs.thrombus组，$p<0.05vs.thrombus+tsi组。n＝6，平均值±标准误。39.图2各组小鼠脑灌流量的激光散斑图40.a:各组小鼠小鼠大脑中动脉供血区脑表面血流量图。sham，假手术组；thrombus，血栓组；thrombus+rhpro-uk，人重组尿激酶原组；thrombus+tsi，tsi组；thrombus+rhpro-uk+tsi，人重组尿激酶原与tsi联合给药组；每行自上而下分别为baseline(凝血酶造模前基础值)、15min(凝血酶造模开始后15分钟)、5h(造模后5小时给药开始)、5.5h(给药结束)、28.5h(给药结束24小时)。41.b:各组小鼠大脑中动脉供血区血流灌注量统计图。以自身基础值为100％。*p<0.05vs.sham组，#p<0.05vs.thrombus组。n＝6，平均值±标准误。42.图3各组小鼠mnss神经功能评分统计图43.给药结束24小时后，神经缺陷评分统计结果图。mnss评分0为正常小鼠。sham，假手术组；thrombus，血栓组；thrombus+rhpro-uk，人重组尿激酶原组；thrombus+tsi，tsi组；thrombus+rhpro-uk+tsi，人重组尿激酶原与tsi联合给药组。*p<0.05vs.sham组，#p<0.05vs.thrombus组，&p<0.05vs.thrombus+rhpro-uk组。n＝6，平均值±标准误。44.图4各组小鼠脑水含量统计图45.给药24小时后，脑组织含水量统计图。sham，假手术组；thrombus，血栓组；thrombus+rhpro-uk，人重组尿激酶原组；thrombus+tsi，tsi组；thrombus+rhpro-uk+tsi，人重组尿激酶原与tsi联合给药组。*p<0.05vs.sham组，&p<0.05vs.thrombus+rhpro-uk组。n＝6，平均值±标准误。46.图5各组小鼠脑伊文思蓝渗出统计图47.a:各组小鼠给药24小时后，脑伊文思蓝渗出图。sham，假手术组；thrombus，血栓组；thrombus+rhpro-uk，人重组尿激酶原组；thrombus+tsi，tsi组；thrombus+rhpro-uk+tsi，人重组尿激酶原与tsi联合给药组。48.b:给药24小时后，单位重量脑组织伊文思蓝渗出量统计。*p<0.05vs.sham组，&p<0.05vs.thrombus+rhpro-uk。n＝6，平均值±标准误。49.图6各组小鼠脑微静脉fitc标记血浆白蛋白漏出50.a:各组小鼠给药干预24小时后，脑微静脉微循环fitc标记血浆白蛋白漏出图。v:脑表面细静脉；i:脑组织间质。血管外(i)fitc标记白蛋白荧光强度与血管内(v)的fitc荧光强度比值乘以100％为白蛋白渗出百分比，sham组、thrombus组、rhpro-uk组、tsi组、rhpro-uk+tsi组，bar＝50μm。51.b:脑表面细静脉fitc标记血浆白蛋白漏出统计图，*p<0.05vs.sham组，#p<0.05vs.thrombus组，&p<0.05vs.thrombus+rhpro-uk。n＝6，平均值±标准误。52.图7各组小鼠ttc染色图和脑梗死面积统计结果53.a:各组小鼠给药后24小时ttc染色图。sham，假手术组；thrombus，血栓组；thrombus+rhpro-uk，人重组尿激酶原组；thrombus+tsi，tsi组；thrombus+rhpro-uk+tsi，人重组尿激酶原与tsi联合给药组。54.b:脑梗死体积与脑组织体积之比统计图。*p<0.05vs.sham组，#p<0.05vs.thrombus组。n＝6，平均值±标准误。55.图8各组小鼠脑出血和脑组织中血红蛋白含量56.a:各组小时给药24小时后脑组织出血图。sham，假手术组；thrombus，血栓组；thrombus+rhpro-uk，人重组尿激酶原组；thrombus+tsi，tsi组；thrombus+rhpro-uk+tsi，人重组尿激酶原与tsi联合给药组。57.b:各组小鼠给药24小时后脑组织血红蛋白含量统计图。*p<0.05vs.sham组，#p<0.05vs.thrombus组，&p<0.05vs.thrombus+rhpro-uk。n＝6，平均值±标准误。58.图9各组小鼠脑微血管内皮细胞间tjs蛋白occludin的免疫荧光染色图给药后24小时tjs蛋白occludin免疫荧光染色，每列从左至右依次为sham，假手术组；thrombus，血栓组；thrombus+rhpro-uk，人重组尿激酶原组；thrombus+tsi，tsi组；thrombus+rhpro-uk+tsi，人重组尿激酶原与tsi联合给药组。为蓝色代表细胞核，红色代表tjs蛋白occludin，绿色代表vwf。n＝3，第一行bar＝25μm，第二行bar＝5μm。59.图10各组小鼠脑半影区提取蛋白中ve-cadherin表达的westernblot分析结果60.a:各组小鼠给药24小时后脑半影区提取蛋白中ve-cadherin表达的免疫印迹图。61.b:各组小鼠给药24小时后脑半影区提取蛋白ve-cadherin定量分析统计图。sham，假手术组；thrombus，血栓组；thrombus+rhpro-uk，人重组尿激酶原组；thrombus+tsi，tsi组；thrombus+rhpro-uk+tsi，人重组尿激酶原与tsi联合给药组。*p<0.05vs.sham组，#p<0.05vs.thrombus组，&p<0.05vs.thrombus+rhpro-uk。n＝6，平均值±标准误。62.图11各组小鼠脑微血管bm组成成分collageniv和laminin免疫荧光染色图各组小鼠给药24小时后脑微血管bm蛋白collageniv和laminin免疫荧光染色图，每列从左至右依次为sham，假手术组；thrombus，血栓组；thrombus+rhpro-uk，人重组尿激酶原组；thrombus+tsi，tsi组；thrombus+rhpro-uk+tsi，人重组尿激酶原与tsi联合给药组。蓝色表示细胞核。红色分别表示collageniv和laminin。n＝3。bar＝25μm。63.图12各组小鼠半影区脑组织提取蛋白中的collageniv表达的westernblot分析结果64.a.各组小鼠半影区脑组织提取蛋白中collageniv表达的免疫印迹图。65.b.各组小鼠半影区脑组织collageniv定量分析统计图。sham，假手术组；thrombus，血栓组；thrombus+rhpro-uk，人重组尿激酶原组；thrombus+tsi，tsi组；thrombus+rhpro-uk+tsi，人重组尿激酶原与tsi联合给药组。*p<0.05vs.sham组，#p<0.05vs.thrombus组，&p<0.05vs.thrombus+rhpro-uk。n＝6，平均值±标准误。具体实施方式：66.以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。67.实施例168.本发明最优选的冷冻干燥注射剂，其中的药物活性成分为丹参多酚酸和人重组尿激酶原，两者的重量比例为：丹参多酚酸:人重组尿激酶原＝2:169.制备实例：70.取丹参多酚酸20g,人重组尿激酶原10g，分别溶于含有100g甘露醇的1000ml水溶液中，分别罐装到2g的小瓶中，各共计500瓶，封盖前，置入冷冻干燥箱中，真空干燥24小时，封盖，丹参多酚酸、人重组尿激酶原各取1瓶组合包装，即得。71.实施例272.取丹参多酚酸2g,人重组尿激酶原1g，分别溶于含有100g甘露醇的1000ml水溶液中，分别罐装到2g的小瓶中，各共计500瓶，封盖前，置入冷冻干燥箱中，真空干燥24小时，封盖，丹参多酚酸、人重组尿激酶原各取1瓶组合包装，即得。73.实施例374.取丹参多酚酸10g,人重组尿激酶原5g，分别溶于含有100g甘露醇的1000ml水溶液中，分别罐装到2g的小瓶中，各共计500瓶，封盖前，置入冷冻干燥箱中，真空干燥24小时，封盖，丹参多酚酸、人重组尿激酶原各取1瓶组合包装，即得。75.实施例476.取丹参多酚酸5g,人重组尿激酶原2.5g，分别溶于含有100g甘露醇的1000ml水溶液中，罐装到2g的小瓶中，各共计500瓶，封盖前，置入冷冻干燥箱中，真空干燥24小时，封盖，丹参多酚酸、人重组尿激酶原各取1瓶组合包装，即得。77.实施例578.取丹参多酚酸5g,人重组尿激酶原5g，分别溶于含有100g甘露醇的1000ml水溶液中，分别罐装到2g的小瓶中，各共计500瓶，封盖前，置入冷冻干燥箱中，真空干燥24小时，封盖，丹参多酚酸、人重组尿激酶原各取1瓶组合包装，即得。79.实施例680.取丹参多酚酸50g,人重组尿激酶原5g，分别溶于含有100g甘露醇的1000ml水溶液中，分别罐装到2g的小瓶中，各共计500瓶，封盖前，置入冷冻干燥箱中，真空干燥24小时，封盖，丹参多酚酸、人重组尿激酶原各取1瓶组合包装，即得。81.实施例782.取丹参多酚酸5g,人重组尿激酶原50g，分别溶于含有100g甘露醇的1000ml水溶液中，分别罐装到2g的小瓶中，各共计500瓶，封盖前，置入冷冻干燥箱中，真空干燥24小时，封盖，丹参多酚酸、人重组尿激酶原各取1瓶组合包装，即得。83.实施例884.取丹参多酚酸5g,人重组尿激酶原10g，分别溶于含有100g甘露醇的1000ml水溶液中，分别罐装到2g的小瓶中，各共计500瓶，封盖前，置入冷冻干燥箱中，真空干燥24小时，封盖，丹参多酚酸、人重组尿激酶原各取1瓶组合包装，即得。85.实施例986.取丹参多酚酸5g,人重组尿激酶原20g，溶于含有100g甘露醇的1000ml水溶液中，混合均匀，罐装到2g的小瓶中，共计500瓶，封盖前，置入冷冻干燥箱中，真空干燥24小时，封盖，包装，即得。87.以下通过实验数据进一步说明本发明的有益效果：88.实验例：89.1、本发明组合物的协同增效实验90.2.1试剂和药品91.(1)本发明组合物(丹参多酚酸:人重组尿激酶原＝2:1，质量比)；92.(2)丹参多酚酸，按照本发明方法制备；93.(3)人重组尿激酶原：上海天士力药业有限公司，上海，中国；94.(4)戊巴比妥钠盐、吖啶红、异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,fitc)标记的白蛋白、2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,ttc)、伊文思蓝(evans blue)：购自sigma-aldrich,mo,usa；95.(5)血红蛋白分光光度试剂盒：购自cayman chemical,mi,usa；96.(6)一抗：抗β-actin、occludin、collagen iv、laminin、ve-cadherin的一抗购于abcam(cambridge,ma,usa)；抗vwf的自带fitc荧光一抗购自gentex(zeeland,mi,usa)；97.(5)hoechst 33342：购自dojindo,kumamoto,japan；98.(7)胃蛋白酶消化液、抗体稀释液、羊血清工作液：购自北京中杉金桥生物技术有限公司，北京，中国；99.(8)ripa裂解液、bca蛋白定量试剂盒、bsa蛋白定量标准品、蛋白上样缓冲液、发光液：购自北京普利莱基因技术有限公司，北京，中国；100.(9)cocktail蛋白酶抑制剂：购自amresco,oh,usa；101.(10)磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,pbs)：购自北京中杉金桥生物技术有限公司，北京，中国；102.(11)小鼠凝血酶：购自enzymeresearchlaboratories,in,usa；103.2.2实验仪器104.微循环观察系统配备有：105.(1)一台正立荧光显微镜：bx51wi,olympus,tokyo,japan；106.(2)一台超敏感摄像机：uss-301；uniq vision,santa clara,california,usa；107.(3)一台彩色监视器：20pf5120,philips,eindhoven,netherland；108.(4)一台视频分配器：vtg-33,for.a,tokyo,japan；109.(5)一台dvd刻录机：dvr-560h,philips,eindhoven,netherland；110.(6)激光多普勒血流灌注成像仪：periscan pim 3-1143,jarfalla,sweden；111.(7)体视显微镜：sz-st,olympus,tokyo,japan；112.(8)体视摄像显微镜：sz-ctv,olympus,tokyo,japan；113.(9)恒温水浴锅：hh-1，江苏金坛荣华仪器制造有限公司，江苏，中国；114.(10)微量注射泵：alc-ip600，上海奥利特生物科技有限公司，上海，中国；115.(11)电生理学拉针器：pc-10；narishige,tokyo,japan；116.(12)脑立体定位仪：zs-fd，北京众实迪创科技发展有限责任公司，北京，中国；117.(13)手提式颅钻：ne129,nsk,tokyo,japan；118.(14)小鼠脑模具：brain matrix,wpi-europe,aston,steven age,uk；119.(15)电鼓风干燥箱：101-0ab型；101-2ab型，天津泰斯特一起有限公司，天津，中国；120.(16)恒温恒湿培养箱：bpc，上海蓝豹实验仪器有限公司，上海，中国；121.(17)-80℃低温冰箱：s/n-807552model-702,thermo fisher scientific,waltham,usa；122.(18)-20℃低温冰箱：dw-25w322，青岛澳柯玛股份有限公司，山东，中国；123.(19)离心机：centrifuge 5417r,eppendorf,hamburg,germany；124.(20)高速离心机：allegra 64r,beckman,palo alto,ca,usa；125.(21)电子天平：al204,mettler toledo,zurich,switzerland；126.(22)多功能酶标仪(gene5)：synergy 2,bio-rad,hercules,ca,usa；127.(23)冰冻切片机：leica cm1900,bensheim,germany；128.(24)双光子激光共聚焦显微镜：tcs-sp5,tcs-sp8,leica,mannheim,germany；129.2.3在体实验130.2.3.1实验动物131.体重为21±2g的雄性c57bl/6n清洁级小鼠，购于北京大学医学部实验动物中心(许可证号syxk(京)2006-0008)。动物饲养在温度23±2℃，相对湿度45±5％的条件下，自由饮食饮水，12小时光照/黑暗交替。动物于实验前12小时，禁食并自由饮水。实验操作规程按北京大学动物研究委员会指南执行，实验草案经由北京大学医学部实验动物伦理委员会批准(la2016308)。132.2.3.2原位血栓动物模型建立133.参考以往文章[42]建立凝血酶原位血栓模型。[0134]使用拉针器(pc-10；narishige)按照单步拉针法对微量注射针(calibrated at 15mm/1111μl；assistent ref.555/5；hoecht,sondheim-rhoen,germany)进行拉针，针尖尽量拉长，拉完之后，剪去针头封闭区域，使用鼻饲管将10ml注射器与微量注射针进行转接，并在体视镜下操作，用注射器制造负压使显微注射针抽取不低于1μl(≥1.5ui/μl)的凝血酶(miia,enzyme research laboratories,in,usa)。[0135]使用戊巴比妥钠(2％,45mg/kg,sigma-aldrich,mo,usa)腹腔注射麻醉小鼠，头部固定于立体定位仪上。头部皮肤消毒后，沿右侧眼与右耳之间做一切口，钝性分离颞肌与颞骨，剪开颞肌，使用颅钻在大脑中动脉走行区域进行开颅，找出较大的分支部位，剥离硬脑膜，进行凝血酶注射，注射过程需缓慢进行，不少于5分钟。注射结束，切勿迅速拔出显微注射针，留置时间超过10分钟再拔出。整个过程需重复滴加生理盐水，并在体视镜下操作[43]。多普勒血流量仪(periscan pim 3-1143,jarfalla,sweden)检测显示右侧大脑中动脉血供区血流量与手术前的基础值相比下降70％为模型成功标准，动物入组。除假手术组外，其余各组为模型制作成功后随机分组。缺血5小时后，按照随机分组结果给予药物或生理盐水治疗。小鼠股静脉插管，左股静脉泵注人重组尿激酶原或等体积生理盐水，右股静脉泵注注射用丹参多酚酸或等体积生理盐水，总药量的10％缓慢推注5分钟，剩余90％静脉持续泵注1小时。给药期间及给药后24小时动态观察各项生理指标。[0136]2.3.3动物模型分组[0137](1)假手术组：开颅手术后，不做凝血酶注射处理，5小时后，经左股静脉生理盐水10μl缓慢推注5分钟，连续滴注90μl生理盐水1小时；[0138](2)原位血栓模型组：开颅手术后，注射凝血酶形成原位血栓，5小时后，经左股静脉生理盐水10μl缓慢推注5分钟，连续滴注90μl生理盐水1小时；[0139](3)血栓+人重组人尿激酶原溶栓组：开颅手术后，注射凝血酶形成原位血栓，5小时后，经左股静脉按照10mg/kg推注人重组人尿激酶原，总药量的10％缓慢推注5分钟，剩余90％药物通过股静脉持续泵注1小时；[0140](4)血栓+丹参多酚酸组：开颅手术后，注射凝血酶形成原位血栓，5小时后，经左股静脉按照20mg/kg推注丹参多酚酸，总药量的10％缓慢推注5分钟，剩余90％药物通过股静脉持续泵注1小时；[0141](5)血栓+人重组人尿激酶原+丹参多酚酸组：开颅手术后，注射凝血酶形成原位血栓，5小时后，经股静脉按照10mg/kg推注人重组尿激酶原，总药量的10％缓慢推注5分钟，剩余90％药物静脉持续泵注1小时，右股静脉按照20mg/kg推注注射用丹参多酚酸，给药方式同左侧股静脉；[0142][0143][0144]2.3.4小鼠右侧大脑中动脉血栓观察[0145]在体视摄像显微镜(sz-ctv,olympus,tokyo,japan)下对原位血栓进行观察拍照，分别在造模开始前(baseline)、15分钟(血栓形成后)、5小时(即给药前)、5.5小时(即给药结束)、28.5小时(即给药后24小时)分别进行观察(每组样本数量n＝6)。使用imagej 2(national institutes of health,md,usa)软件统计血栓面积。[0146]2.3.5小鼠右侧大脑中动脉血供区血流量观察[0147]麻醉小鼠后，俯卧位将小鼠头部置于固定器上，剪开小鼠头部皮肤，暴露右侧冠状缝、人字缝、矢状缝围城的区域，在每一个时间点使用激光散斑多普勒血流灌注成像仪(periscan pim 3-1143,jarfalla,sweden)测定小鼠mca支配区域脑表面血流量(每组样本数量n＝6)。将激光探头放置于小鼠头部上方16～18cm位置，检测小鼠右侧大脑中动脉血供区造模开始前(baseline)、15分钟(血栓形成后)、5小时(即给药前)、5.5小时(即给药结束)、28.5小时(即给药后24小时)的血流量，使用moorflpireviewv40软件进行数据分析，以每一样本造模前基础值(baseline)血流量为100％[42]，计算血流量变化率。[0148]2.3.6神经学评分[0149]给药24小时后，使用小鼠改良神经损伤评分表进行神经行为学评估。[0150][0151][0152]2.3.7脑组织含水量测定[0153]给药24小时后，小鼠麻醉处死，断颈后剪下头部，取出脑组织，分离左右半球后进行称重记录记为“湿重”，随后将右半球脑组织放置于设定温度60℃烘箱中烘烤72小时，取出并称重记为“干重”。小鼠脑组织含水量按照(湿重-干重)/湿重×100％计算[45]，每组样本数n＝6。[0154]2.3.8伊文思蓝渗出测定[0155]给药24小时后，每组取6只小鼠，将溶解于生理盐水的伊文思蓝染料(2％,4ml/kg,sigma-aldrich,mo,usa)经股静脉缓慢推注至小鼠体内。体内循环24小时后，经小鼠左心室灌注生理盐水15-20ml(可直至右心耳流出无色液体后停止灌注)，随即断头取脑至生理盐水中漂洗，并对脑组织整体在体视摄像显微镜(sz-ctv,olympus,tokyo,japan)下进行拍照。将脑组织放入脑槽，沿视交叉切入刀片，并在视交叉前切入2片，视交叉后切入3片，总计将脑组织切成5片，拍照，分开左右脑分别称重。可放入-80℃超低温冰箱备用。将左右脑分别加入含有1ml 50％三氯乙酸(溶于生理盐水)ep管中，匀浆，4℃过夜。第二天放置于离心机中，13,000rpm，离心30分钟后取上清。用等比稀释法配置伊文思蓝标准品，在96孔板中加入待测样本，按照1:3体积比例混合待测样本与50％三氯乙酸，随即用多功能酶标仪(synergy 2,bio-rad,ca,usa)对96孔板进行检测(激发光620nm,发射光680nm)，得出伊文思蓝含量[46]，并用得到的结果除以被检测样本脑组织的重量，得到每克脑组织中伊文思蓝的含量。[0156]2.3.9脑梗死体积测定[0157]给药24小时后，腹腔注射2％戊巴比妥溶液麻醉小鼠，剪开胸腔，使用生理盐水从左心室灌流，直至右心耳流出无色液体后停止灌注。断颈后取出脑组织至于盛有生理盐水的培养皿中，漂洗后拍整体照，后将脑放置于脑槽中，同伊文思蓝实验中的方法切取脑片。在体视摄像显微镜(sz-ctv,olympus,tokyo,japan)下逐一拍照后，放入2％ttc溶液中避光并置37℃环境中染色15分钟。将染色完毕的脑片进行拍照，活细胞与ttc反应可呈现红色，没有与ttc进行反应的区域显示为原来的颜色，用图像分析软件image pro plus 6.0(media cybernetics,md,usa)计算梗死面积，梗死面积可由像素面积代替[45]，将每张脑片的梗死面积累加，除以每张脑片的总面积累加得到梗死体积占大脑体积的百分比。[0158]2.3.10脑出血情况测定[0159]给药24小时后，另取小鼠(每组n＝6)，按前述伊文思蓝测定方法切取脑片，使用体式摄像显微镜进行拍照，拍照完毕可将脑片放入-80℃超低温冰箱保存。称重后将小鼠右侧半球脑片切取转移至ep管中，加入适量pbs缓冲液匀浆，13,000rpm离心30分钟，取上清，如不直接使用可储存至-80℃超低温冰箱中。按照血红蛋白检测试剂盒(cayman chemical,mi,usa)检测每样本血红蛋白含量，除以样本脑组织重量，得到每克脑组织中血红蛋白含量[0160]2.4脑血管内皮紧密连接蛋白和血管bm免疫荧光染色[0161]给药24小时后，另取小鼠(每组n＝3)，2％戊巴比妥溶液腹腔注射麻醉后，剪开胸腔，自左心室灌注预冷生理盐水快速灌注5分钟后，切换至预冷4％多聚甲醛溶液先快速灌注5分钟然后慢速灌注20分钟。灌注结束后取脑组织浸于4％多聚甲醛溶液中固定不少于12小时，修块后转至30％蔗糖溶液(去离子水配置)中，直至组织块脱水沉底。[0162]将已脱水好的组织块取出，放入已排气泡的oct包埋剂中，于异戊烷中控制温度不低-70℃中逐渐冷冻，可保存组织块于-80℃超低温冰箱中。切取组织片可提前将组织块置于-20℃冰箱。使用冰冻切片机(cm1900,leica,bensheim,germany)设定温度刀头-22℃，箱体温度-20℃，将组织块切成10μm厚的冰冻切片。切片风干时间不少于48小时。风干结束后，将切片放置于0.1mol/l pbs缓冲液中洗片5分钟，将切片转移至0.01mol/l的枸橼酸钠溶液中，微波炉设定功率600w，90℃，进行抗原热修复10分钟，期间密切观察防止枸橼酸钠溶液蒸发减少应时刻补充。将切片从微波炉中取出，室温自然冷却2小时。切片滴加pbst于37℃恒温恒湿烘箱中破膜30分钟，随即pbs缓冲液冲洗5分钟×次，视情况可选用胃蛋白酶消化15分钟，pbs缓冲液再次冲洗5分钟×3次。羊血清封闭非特异性抗原30分钟后，加一抗vwf(1:100,gentex,zeeland,mi,usa)+occludin/collagen iv/laminin(1:50,abcam,cambridge,ma,usa)，放置于4℃冰箱中过夜。第二天取出复温1小时，pbs缓冲液冲洗5分钟×3次，加入自带荧光的二抗37℃孵育2小时后，pbs缓冲液冲洗5分钟×3次，再加入hoechst 33342(1:100,dojindo,kumamoto,japan)标记细胞核，室温下避光孵育20分钟。用抗荧光淬灭封片剂进行封片。使用双光子激光共聚焦显微镜(tcs-sp5,leica,mannheim,germany)，在40和63倍物镜下观察和拍照。[0163]2.5小鼠大脑皮层半影区蛋白质免疫印迹分析[0164]给药后24小时，另取小鼠(每组n＝6)，麻醉状态下，用预冷4℃pbs溶液自左心室灌流，直至右心耳流出无色液体为止，短颈取脑组织，置于脑槽中，切去嗅球以及小脑，取大致梗死区域脑组织于冻存管中，可放入液氮速冻，后转移至-80℃冰箱中保存。向含有组织的ep管中加入1×ripa裂解液(北京普利莱基因技术有限公司，北京，中国)及cocktail蛋白酶抑制剂(1:100,amresco,oh,usa)充分裂解后超声破碎，随即放入离心机4℃13,000rpm离心30分钟。取上清，可放入-80℃超低温冰箱保存。[0165]使用bca蛋白定量法对蛋白提取液进行蛋白定量，取部分脑组织蛋白提取液加入bca蛋白定量液(北京普利莱基因技术有限公司，北京，中国)，使用标准牛血清白蛋白制备蛋白标准品，并加入bca蛋白定量液。用多功能酶标仪(synergy 2,bio-rad,ca,usa)在560nm处测定吸光度值，根据标准蛋白设计标准曲线计算出蛋白浓度。取部分蛋白提取液，按体积加入5×上样缓冲液，沸水煮15分钟。每个聚丙烯酰胺凝胶孔中加入等质量的蛋白样品，浓缩胶80v，分离胶100v恒压电泳分离，将分离好的蛋白的电泳胶通过电转将蛋白转移至pvdf膜上，电转过程中设定220ma电流120分钟转膜。将电转结束的pvdf膜放入5％脱脂牛奶中室温封闭非特异性蛋白结合位点1小时，加入用5％脱脂奶粉稀释的一抗β-actin、gapdh、collagen iv、ve-cadherin(abcam,cambridge,ma,usa)，4℃孵育过夜。第二天将pvdf膜置于tbst漂洗3次，每次10分钟，加入5％脱脂奶粉稀释的二抗室温孵育1小时，加入电化学发光液(北京普利莱基因技术有限公司，北京，中国)进行化学发光，使用成像系统chemi doc touch(bio-rad,ca,usa)对pvdf膜进行成像分析，使用图像分析软件quantity one 6.2(bio-rad,ca,usa)分析电泳条带密度值。目的蛋白含量变化表示为目的蛋白条带密度值与相应内参β-actin或gapdh条带密度值相比得到绝对值。[0166]2.6各组各指标所需实验动物数量[0167]综合以上所述动物实验及形态学实验观察指标所需动物数量统计，[0168][0169]统计[0170]所有数据结果均使用平均值±标准误表示，使用graphpad prism统计软件，two-way anova(血栓面积、脑表面血流量)或one-wayanova(其它指标)的方法对数据进行统计和分析，设p<0.05时，统计学有显著性差异。[0171]结果：[0172]人重组尿激酶原可减少血栓，丹参多酚酸(tsi)与人重组尿激酶原联用不影响人重组尿激酶原的溶栓效果[0173]图1a是用体视镜观察到小鼠大脑中动脉分支处的血栓动态。初始状态下各组小鼠右侧大脑中动脉均无血栓；凝血酶注射15分钟后，可见血管内血栓形成，5小时后各组仍可观察到血栓。[0174]血栓组，在5.5小时时间点，可观察到血栓明显存在。人重组尿激酶原给予1小时后(血栓建立5.5小时)，与血栓组相比血栓明显减少。tsi对血栓大小没有影响，人重组尿激酶原与tsi联合给药1小时后(血栓建立5.5小时)血栓明显减少。28.5小时时间点，血栓组血栓依旧存在，人重组尿激酶原组的血栓明显减少，tsi对血栓没有明显的影响。人重组尿激酶原联合tsi给药，在给药后1小时和24小时，血栓显著减少，但是，与人重组尿激酶原单独给药比，没有显著的差异(图1a)，血栓面积统计结果见图1b，血栓面积统计见表1。[0175][0176]*p<0.05vs.sham组，#p<0.05vs.thrombus组，$p<0.05vs.thrombus+tsi组。n＝6，平均值±标准误。[0177]2人重组尿激酶原与丹参多酚酸(tsi)联用可恢复大脑中动脉供血区脑表面血流量[0178]图2a显示的是激光多普勒血流灌注量检测仪器检测的小鼠脑表面大脑中动脉供血区的表面灌流量。在整个观察时间内，假手术组小鼠的脑血流没有明显的变化。血栓组、人重组尿激酶原组、tsi组、人重组尿激酶原与tsi联合给药组，在血栓建立后，大脑中动脉血供血区的血液灌流量明显减少，5小时后，各组实验动物血流量有少量恢复。血栓组在5.5小时时间点，与5小时相比，脑血流灌流量没有较大变化，28.5小时有部分的恢复。人重组尿激酶原单独给予1小时后(血栓形成5.5小时后)，与血栓组相比，脑血流量明显恢复，28.5小时，进一步恢复。tsi单独给药，脑血流量没有明显的恢复。人重组尿激酶原与tsi联合给药1小时后(血栓形成5.5小时后)，脑血流量恢复显著，28.5小时后，恢复更加明显。图2b是各组小鼠脑血流量的统计图。统计数据见表2。[0179][0180]*p<0.05vs.sham组，#p<0.05vs.thrombus组。n＝6，平均值±标准误。[0181]3人重组尿激酶原与丹参多酚酸(tsi)联合给药可改善小鼠mnss神经学评分[0182]使用mnss神经学评分法，评估给药24小时后，各组小鼠神经功能。与假手术组相比，血栓组小鼠的mnss神经学评分值显著升高，提示神经功能障碍。人重组尿激酶原单独给药或tsi单独给药，没有改善mnss神经学评分值。人重组尿激酶原与tsi联合给药，显著地抑制了给药24小时后，mnss神经学评分值的升高。统计数据见表3。[0183][0184][0185]*p<0.05vs.sham组，#p<0.05vs.thrombus组，&p<0.05vs.thrombus+rhpro-uk组。n＝6，平均值±标准误。[0186]4人重组尿激酶原与丹参多酚酸(tsi)联用可减少小鼠脑组织含水量[0187]图4显示的是各组小鼠给药24小时后右侧半球脑组织的含水量统计结果。与假手术组相比，人重组尿激酶原单独给药可显著地增加小鼠右侧半球脑组织的含水量。tsi单独给药，人重组尿激酶原与tsi联合给药组，都显著地抑制了人重组尿激酶原溶栓引起的小鼠右侧脑组织含水量的增加。统计数据见表4。[0188][0189]*p<0.05vs.sham组，&p<0.05vs.thrombus+rhpro-uk组。n＝6，平均值±标准误。[0190]5人重组尿激酶原与丹参多酚酸(tsi)联用减少伊文思蓝渗出[0191]图5a显示的是各组小鼠给药后24小时脑伊文思蓝渗出的示意图。与假手术组相比，血栓组右脑的伊文思蓝渗出明显增加。人重组尿激酶原单独给药进一步增加了右脑伊文思蓝渗出的增多。单独给予tsi可明显地抑制小鼠脑伊文思蓝渗出。人重组尿激酶原与tsi联用给药也可明显减少伊文思蓝渗出。图5b是统计结果。统计数据见表5。[0192][0193]*p<0.05vs.sham组，&p<0.05vs.thrombus+rhpro-uk组。n＝6，平均值±标准误。[0194]6人重组尿激酶原与tsi联用减轻脑微循环损伤和白蛋白渗出[0195]图6a显示的是给药24小时后，各组小鼠脑微静脉fitc标记的血浆白蛋白漏出的图像。与假手术组相比，血栓组小鼠脑静脉fitc标记的血浆白蛋白漏出明显，人重组尿激酶原单独给药组的微静脉血管血浆白蛋白漏出更加明显。tsi组显著地抑制了小鼠脑静脉fitc标记的血浆白蛋白的漏出，人重组尿激酶原和tsi联用也显著地抑制了血浆白蛋白的漏出。[0196]图6b和表6是统计数据表。[0197][0198][0199]*p<0.05vs.sham组，#p<0.05vs.thrombus组，&p<0.05vs.thrombus+rhpro-uk。n＝6，平均值±标准误[0200]7人重组尿激酶原与丹参多酚酸(tsi)联用能够减少脑梗死体积[0201]图7a为各组小鼠给药24小时，脑组织ttc染色图。白色为梗死区。与假手术组相比，血栓组小鼠脑梗死面积增加。人重组尿激酶原或tsi单独给药没有减少脑梗死面积。但是，人重组尿激酶原与tsi联合给药，明显地减少了脑梗死面积。图7b是统计结果，表7是统计数据表。[0202][0203]*p<0.05vs.sham组，#p<0.05vs.thrombus组。n＝6，平均值±标准误。[0204]8人重组尿激酶原与丹参多酚酸(tsi)联用能够减少出血转化[0205]图8a显示的是各组小鼠给药24小时后脑出血的图像。与假手术组相比，血栓组小鼠有明显的出血。人重组尿激酶原单独给药组脑出血进一步增加。tsi单独给药组小鼠的脑出血面积明显减少。人重组尿激酶原与tsi联合给药的脑出血面积也明显减少。[0206]图8b是各组小鼠给药24小时后，右侧半球脑组织中血红蛋白的含量检测结果。与假手术组相比，血栓组小鼠脑组织中血红蛋白含量明显增加。人重组尿激酶原单独给药的小鼠脑组织血红蛋白的含量进一步增加。tsi单独给药显著地抑制了小鼠脑组织血红蛋白含量的增加。人重组尿激酶原与tsi联合给药组的脑组织血红蛋白的含量也明显减少。表8是统计结果。[0207][0208]*p<0.05vs.sham组，#p<0.05vs.thrombus组，&p<0.05vs.thrombus+rhpro-uk。n＝6，平均值±标准误。[0209]9人重组尿激酶原与丹参多酚酸(tsi)联用减轻脑微血管内皮细胞间tjs的损伤[0210]图9是各组小鼠给药24小时后，tjs组成成分之一occludin的免疫荧光染色，通过双光子显微镜拍摄的图像。假手术组小鼠的脑微血管内皮细胞间的紧密连接蛋白occludin(图中红色标记)排列连续。血栓组小鼠脑微血管内皮细胞间的紧密连接蛋白occludin不连续，有多处断裂。人重组尿激酶原单独给药24小时后，小鼠脑微血管内皮细胞间的紧密连接蛋白occludin的断裂没有恢复。tsi单独给药24小时后，小鼠脑微血管内皮细胞间紧密连接蛋白occludin排列连续。人重组尿激酶原与tsi联合给药24小时后，小鼠脑微血管内皮细胞间紧密连接蛋白occludin排列较为连续。[0211]10人重组尿激酶原与tsi联用能够抑制ve-cadherin的低表达[0212]图10a显示给药24小时后，各组小鼠患侧大脑半影区脑组织提取蛋白中ajs蛋白的ve-cadherinwesternblot分析图示。如图10a所示，与假手术组相比，血栓组的ve-cadherin表达明显降低。人重组尿激酶原单独给药组的ve-cadherin表达也明显降低。单独使用tsi，以及人重组尿激酶原与tsi联合使用显著地抑制了ve-cadherin表达的降低。图10b为统计结果。统计数据见表9。[0213][0214][0215]*p<0.05vs.sham组，&p<0.05vs.thrombus+rhpro-uk。n＝6，平均值±标准误。[0216]11人重组尿激酶原与tsi联用减轻bm损伤[0217]图11显示的是各组小鼠给药后24小时，脑微血管bm组成成分collageniv和laminin免疫荧光染色图。假手术组小鼠脑微血管collageniv和laminin排列连续。血栓组小鼠脑微血管collageniv和laminin断裂、不连续。人重组尿激酶原单独给药组小鼠的脑微血管collageniv和laminin也有断裂、不连续现象。tsi组小鼠脑微血管collageniv和laminin不连续明显减少。人重组尿激酶原和tsi联用组小鼠脑微血管collageniv和laminin的不连续也有明显减少。[0218]12人重组尿激酶原与tsi联用能够抑制collageniv低表达[0219]如图12a显示是各组小鼠半影区脑组织提取蛋白中collageniv表达的westernblot分析图示。与假手术组相比，血栓组的collageniv表达明显降低。人重组尿激酶原单独给药组的collageniv表达同样明显降低。tsi单独使用，以及人重组尿激酶原与tsi联用显著地抑制了collageniv的低表达。图12b和表10是统计图和定量分析数据表。[0220][0221]*p<0.05vs.sham组，#p<0.05vs.thrombus组，&p<0.05vs.thrombus+rhpro-uk。n＝6，平均值±标准误。