生物信息学

　　1.本发明涉及用于肿瘤抗原鉴定的装置和用于肿瘤抗原鉴定的方法；在使用所述装置和/或方法后鉴定的肿瘤抗原；包含所述肿瘤抗原的药物组合物；使用所述装置和/或所述方法治疗癌症的方法；使用所述装置和/或所述方法对患者进行癌症治疗分层的方法；涉及使用所述装置和/或方法对患者进行癌症治疗分层然后施用癌症治疗剂的治疗方案；以及使用所述装置和/或所述方法鉴定的肿瘤抗原用作癌症疫苗或免疫原性剂或癌症疗法。背景技术：2.cd8+t细胞在检测和消除因病原体感染(例如病毒感染)或恶性转化而在其表面呈现异常肽的细胞方面具有关键作用。t细胞受体(tcr)的交叉反应性是指t细胞可以识别种类繁多的不同靶肽。这种现象使相对少量的t细胞能够识别多种pmhc(肽:主要组织相容性复合物)分子，这些分子代表着异常细胞，因此有可能威胁到健康或生命。3.然而，这种机制的一个不理想的副作用是，针对病原体的免疫反应可能会克服对高度同源的自身抗原的耐受阈值，造成有害的脱靶效应，这种效应是由t细胞的交叉反应性介导的；这一过程被称为分子模拟。在自身免疫领域，自身肽和致病性肽之间的这种同源性的潜在有害后果是众所周知的，然而，它还没有在癌症中得到探索。4.事实上，人们一直认为癌症免疫疗法治疗成功的最佳预后标志是高的肿瘤抗原突变率和丰富的t细胞浸润。这种想法是基于这样一个事实，即具有大量突变的肿瘤将有更高的机会被浸润的t细胞识别和消除。5.然而，一些研究已经表明，肿瘤抗原的质量特性可能比其数量更重要。此外，已经观察到抗病毒t细胞在肿瘤微环境中的存在[28]，但是仍然不清楚它们的作用是主动的还是只是旁观者。[0006]肿瘤免疫学和免疫疗法在过去十年中已经完全改变了癌症的治疗方式，特别是在使用检查点抑制剂(ici)时，已经看到了突出的临床效果，但不幸的是，只在少数患者中出现。越来越清楚的是，使用ici的免疫疗法只有在针对特定的肿瘤抗原时才能完全发挥作用。然而，目前还没有一种简单而快速的方法来鉴定这些肿瘤抗原。[0007]在此，我们假设肿瘤可能会出现与病原体衍生的肽(特别是病毒肽)具有高度同源性或亲和力评分，这可能使病原体产生的交叉反应性t细胞能够识别并杀死肿瘤细胞。[0008]为此，我们开发了一种名为hex(异种肽(xenopeptide)的同源性评价)的生物信息学装置，可以自动且非常简单地鉴定与病毒肽高度相似的肿瘤抗原。利用该装置，我们观察到，由与癌症抗原具有高度同源性或亲和力的肽介导的抗病毒t细胞免疫，在预防性和治疗性情况下也能积极控制肿瘤生长。这一观察结果表明，激活的t细胞对同源的病毒衍生的肽和肿瘤衍生的肽都有交叉反应性。[0009]随后，我们还发现，对巨细胞病毒(cmv)的体液反应能够对黑色素瘤患者对检查点抑制剂疗法(抗pd1)的反应进行分层。事实上，通过使用装置hex鉴定的与cmv和黑色素瘤同源的肽，被发现在cmv血清阳性的黑色素瘤患者的外周血单核细胞(pbmc)中促进inf-g的释放。技术实现要素：[0010]根据本发明的第一方面，提供了一种用于肿瘤抗原鉴定的装置，其包括：[0011]至少一个含有多个支撑物的流动通道，这些支撑物上连接有至少一个分子或至少一个复合物，该分子或复合物上结合有至少一个抗mhc(主要组织相容性复合物)抗体或至少一个抗泛人类白细胞抗原(hla)抗体，从而能用所述至少一个抗体从所述样本中提取流经所述通道的样本中的pmhc(肽:主要组织相容性复合物)。[0012]本文提到的抗泛hla抗体是指识别哺乳动物(特别是人类)中存在的任何不同hla或对其具有特异性的抗体。[0013]更理想地是，所述抗体识别特定的hla类型如mhc-i或对其具有特异性，该mhc-i选自以下组中的至少一个：mhc i类a、b和c。[0014]另外地或可替代地，所述抗体识别特定的hla类型如mhc-ii或对其具有特异性，该mhc-ii选自以下组中的至少一个：mhc ii类dp、dm、do、dq和dr。[0015]然而，更优选地是，所述抗体是抗人的。[0016]在本发明的一个优选实施方案中，所述分子或复合物是硫醇和烷基(“烯”)官能团的复合物，理想地是，包含0.15:0.1-1500:1000(四硫醇:三烯丙基)范围内的1.5与1.0的化学计量比。[0017]更理想地是，所述装置的制造基于硫醇和烷基(“烯”)官能团之间由紫外线引发的光反应。在本发明的另一个优选实施方案中，所述装置是通过与生物素-peg4-炔基(sigma，764213)进行紫外线光聚合而制成的。随后与亲和素:链霉亲和素反应。尽管如此，在将生物体(biotic)连接到柱之前将亲和素连接到生物上是在本发明的范围内的，反之亦然。[0018]在另一个优选实施方案中，所述装置通过使所述抗体与所述链霉亲和素反应而被功能化。理想地是，一个以上的抗体与所述链霉亲和素反应，从而使每个用链霉亲和素功能化的复合物携带多个(如2个或3个)所述抗体，例如多个抗泛hla抗体。[0019]在本发明的另一个优选实施方案中，在链霉亲和素功能化后和抗体结合前，微柱阵列用蛋白质如牛血清白蛋白(bsa)(理想地是100μg/ml，在15mm pbs中，孵育10分钟)预处理。[0020]在本发明更优选的方面，所述支撑物包括多个微柱，例如存在于微流控装置中的微柱，并且，优选地，所述微柱在所述装置中排列成阵列。理想地是，所述微柱由与常规微流控装置(例如用于实施固定化酶反应)中使用的相同或相似的成分制成。[0021]根据本发明的另一个方面，提供了一种用于肿瘤抗原鉴定的方法，其包括：[0022]i)将肿瘤样本溶解或悬浮在液体中；[0023]ii)使所述液体通过用于肿瘤抗原鉴定的装置，该装置包括：至少一个含有多个支撑物的流动通道，这些支撑物上连接有至少一个分子或至少一个复合物，该分子或复合物上结合有至少一个抗mhc(主要组织相容性复合物)抗体或至少一个抗泛人类白细胞抗原(hla)抗体，从而能用所述至少一个抗体从所述样本中提取流经所述通道的样本中的pmhc(肽:主要组织相容性复合物)；[0024]iii)将所述至少一个抗体与所述样本中的至少一个pmhc(肽:主要组织相容性复合物)结合；[0025]iv)可选地，从所述装置中移除部分iii)的所述至少一个结合的pmhc(肽:主要组织相容性复合物)；[0026]v)将所述结合的pmhc(肽:主要组织相容性复合物)的所述肽与病原体衍生的抗原文库进行比较，以确定所述肽是否与至少一个病原体衍生的抗原或其部分显示出同源性或亲和力(分子模仿)，并且其中存在大于60％的同源性/亲和力；[0027]vi)将所述肽鉴定为用于癌症疗法的肿瘤抗原。[0028]在本发明任何方面的优选实施方案中，所述同源性/亲和力可以是以下百分比中的任何一个：61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99和100％。[0029]本文提到的同源性/亲和力包括指使用以下之一对上述v)部分的序列结构进行比较：本文定义的同源性/亲和力；或同一性，其由给定比对中定义长度上的相同残基的数量决定；或相似性，其由给定比对中定义长度上具有相似物理化学性质的相同残基或保守替代的数量决定。[0030]在本发明的优选方法中，所述文库是人类病原体衍生的抗原，它包括已知病原体衍生的抗原的策划文库(curated library)，理想地衍生自致病病毒，或更合适的是其蛋白质组，这些病毒感染哺乳动物，理想地是人类，例如以下病毒中的任何一种或多种，或理想地是任何组合：[0031]abyssoviridae；ackermannviridae；actantavirinae；腺病毒科(adenoviridae)；agantavirinae；aglimvirinae；异疱疹病毒科(alloherpesviridae)；甲型线形病毒科(alphaflexiviridae)；疱疹病毒甲亚科(alphaherpesvirinae)；alphairidovirinae；alphasatellitidae；alphatetraviridae；alvernaviridae；amalgaviridae；amnoonviridae；ampullaviridae；指环病毒科(anelloviridae)；沙粒病毒科(arenaviridae)；arquatrovirinae；动脉炎病毒科(arteriviridae)；artoviridae；囊泡病毒科(ascoviridae)；非洲猪瘟病毒科(asfarviridae)；aspiviridae；星状病毒科(astroviridae)；自复制短尾噬菌体亚科(autographivirinae)；鳄梨日斑类病毒科(avsunviroidae)；avulavirinae；硅藻dna病毒科(bacilladnaviridae)；杆状病毒科(baculoviridae)；杆状rna病毒科(barnaviridae)；bastillevirinae；bclasvirinae；百保病毒科(belpaoviridae)；benyviridae；乙型线形病毒科(betaflexiviridae)；疱疹病毒乙亚科(betaherpesvirinae)；乙型虹彩病毒(betairidovirinae)；双尾病毒科(bicaudaviridae)；双dna病毒科(bidnaviridae)；双rna病毒科(birnaviridae)；波纳病毒科(bornaviridae)；葡萄孢欧尔密病毒科(botourmiaviridae)；brockvirinae；雀麦花叶病毒科(bromoviridae)；bullavirinae；杯状病毒科(caliciviridae)；calvusvirinae；carmotetraviridae；花椰菜花叶病毒科(caulimoviridae)；ceronivirinae；chebruvirinae；脊索动物痘病毒亚科(chordopoxvirinae)；产黄青霉病毒科(chrysoviridae)；chuviridae；圆环病毒科(circoviridae)；clavaviridae；长线形病毒科(closteroviridae)；豇豆花叶病毒亚科(comovirinae)；冠狀病毒科(coronaviridae)；corticoviridae；crocarterivirinae；cruliviridae；crustonivirinae；cvivirinae；囊状噬菌体科(cystoviridae)；dclasvirinae；丁型线形病毒科(deltaflexiviridae)；浓病毒亚科(densovirinae)；双顺反子病毒科(dicistroviridae)；endornaviridae；昆虫痘病毒亚科(entomopoxvirinae)；equarterivirinae；弯曲噬菌体亚科(eucampyvirinae)；euroniviridae；丝状病毒科(filoviridae)；fimoviridae；firstpapillomavirinae；黄病毒科(flaviviridae)；微小纺锤形噬菌体科(fuselloviridae)；丙型线形病毒科(gammaflexiviridae)；疱疹病毒丙亚科(gammaherpesvirinae)；geminialphasatellitinae；双生病毒科(geminiviridae)；genomoviridae；globuloviridae；gokushovirinae；guernseyvirinae；微滴形病毒科(guttaviridae)；hantaviridae；嗜肝dna病毒科(hepadnaviridae)；肝炎病毒科(hepeviridae)；herelleviridae；heroarterivirinae；疱疹病毒科(herpesviridae)；hexponivirinae；减毒病毒科(hypoviridae)；hytrosaviridae；iflaviridae；丝状噬菌体科(inoviridae)；虹彩病毒科(iridoviridae)；jasinkavirinae；kitaviridae；lavidaviridae；leishbuviridae；letovirinae；光滑病毒科(leviviridae)；脂毛噬菌体科(lipothrixviridae)；lispiviridae；黄症病毒科(luteoviridae)；软体动物疱疹病毒科(malacoherpesviridae)；mammantavirinae；marnaviridae；marseilleviridae；风疹病毒科(matonaviridae)；mccleskeyvirinae；mclasvirinae；medioniviridae；medionivirinae；巨大双分核糖核酸病毒科(megabirnaviridae)；mesoniviridae；metaparamyxovirinae；转座病毒科(metaviridae)；微病毒科(microviridae)；拟菌病毒科(mimiviridae)；mononiviridae；mononivirinae；mymonaviridae；肌尾噬菌体科(myoviridae)；mypoviridae；内罗病毒科(nairoviridae)；nanoalphasatellitinae；矮化病毒科(nanoviridae)；裸露rna病毒科(narnaviridae)；nclasvirinae；线头病毒科(nimaviridae)；野田村病毒科(nodaviridae)；nudiviridae；nyamiviridae；nymbaxtervirinae；okanivirinae；正冠状病毒亚科(orthocoronavirinae)；正粘病毒科(orthomyxoviridae)；副黏病毒亚科(orthoparamyxovirinae)；orthoretrovirinae；[0032]ounavirinae；ovaliviridae；乳头瘤病毒科(papillomaviridae)；副粘病毒科(paramyxoviridae)；partitiviridae；细小病毒科(parvoviridae)；细小病毒亚科(parvovirinae)；pclasvirinae；peduovirinae；peribunyaviridae；permutotetraviridae；phasmaviridae；白纤病毒科(phenuiviridae)；藻类dna病毒科(phycodnaviridae)；小双节病毒科(picobirnaviridae)；小rna病毒科(picornaviridae)；picovirinae；piscanivirinae；芽生噬菌体科(plasmaviridae)；pleolipoviridae；肺病毒科(pneumoviridae)；短尾噬菌体科(podoviridae)；polycipiviridae；多分dna病毒科(polydnaviridae)；多瘤病毒科(polyomaviridae)；portogloboviridae；马铃薯纺锤形块茎类病毒科(pospiviroidae)；马铃薯y病毒科(potyviridae)；痘病毒科(poxviridae)；procedovirinae；假病毒科(pseudoviridae)；qinviridae；quadriviridae；quinvirinae；regressovirinae；remotovirinae；呼肠孤病毒科(reoviridae)；repantavirinae；逆转录病毒科(retroviridae)；弹状病毒科(rhabdoviridae)；杆套病毒科(roniviridae)；rubulavirinae；古噬菌体科(rudiviridae)；sarthroviridae；secondpapillomavirinae；secoviridae；光滑呼肠孤病毒亚科(sedoreovirinae)；sepvirinae；serpentovirinae；猴动脉炎病毒亚科(simarterivirinae)；长尾噬菌体科(siphoviridae)；smacoviridae；solemoviridae；solinviviridae；sphaerolipoviridae；刺突呼肠孤亚科b.中描述)进行成对细化比对，以便在位置加权法中细化比对。在tcr相互作用区域(肽的中心部分)具有高相似性的一对肽获得较高的相似性分数。最后，使用netmhc4.0或netmhcpan4.1作为独立的命令行工具对肿瘤和病毒的同源肽进行mhc结合亲和力预测。这些结果最终会在工具中被自动解析和整理，并创建一个总结上述分析的最终分数。[0044]根据本发明的又一个方面，提供了一种癌症治疗剂或免疫原性剂或癌症疫苗，其包括使用上述装置和/或方法中的任何一种或两种鉴定的肿瘤抗原。[0045]根据本发明的又一个方面，提供了一种使用上述装置和/或方法中的任何一种或两种鉴定的用于癌症治疗的肿瘤抗原。[0046]根据本发明的又一个方面，提供了一种用于制造治疗癌症的药物的肿瘤抗原，其中所述抗原是用上述装置和/或方法中的一种或两种鉴定的。[0047]最优选地，所述癌症治疗剂或免疫原性剂或癌症疫苗或肿瘤抗原是表1-6中所列的任何一种或多种。[0048]根据本发明的又一个方面，提供了一种治疗癌症患者的方法，其包括：[0049]使用本发明的所述装置和/或方法鉴定肿瘤抗原，然后向个体施用所述肿瘤抗原，或使用所述肿瘤抗原扩大对所述肿瘤抗原有活性的t细胞群，然后向患者施用所述t细胞。[0050]在优选的实施方案中，所述t细胞是体外t细胞和/或培养的t细胞，无论是异体还是自体t细胞。[0051]根据本发明的又一个方面，提供了一种药物组合物或免疫原性剂或疫苗，其包括本发明的肿瘤抗原和药学上可接受的载体、佐剂、稀释剂或赋形剂。[0052]合适的药用赋形剂是本领域技术人员熟知的。药物组合物可以通过任何合适的途径配制施用，例如瘤内、肌内、动脉内、静脉内、胸腔内、囊内、腔内或腹腔注射、口腔、鼻腔或支气管(吸入)、透皮或肠胃外，并且可以通过药学领域熟知的任何方法制备。[0053]该组合物可通过使上述肿瘤抗原与载体结合来制备。一般来说，制剂的制备方法是将肿瘤抗原与液体载体或细小的固体载体或两者均匀而密切地结合，然后如果有必要，对产品进行整形。本发明延伸到制备药物组合物的方法，该方法包括将本文定义的肿瘤抗原与药学上或兽医学上可接受的载体或媒介联合或结合。[0054]根据本发明的又一个方面，提供了一种用于治疗癌症的组合治疗剂，其包括：使用本发明的所述装置和/或方法鉴定的肿瘤抗原和至少一种另外的癌症治疗剂。[0055]优选地，另外的癌症治疗剂包括最合适的环磷酰胺，因为它能下调t调节细胞。然而，正如本领域技术人员所理解的，所述另外的治疗剂可以是本领域已知的任何抗癌剂。[0056]优选地，另外的癌症治疗剂包括检查点抑制剂(ici)。[0057]检查点抑制的最佳特征途径是细胞毒性t淋巴细胞蛋白4(ctla-4)途径和程序性细胞死亡蛋白1途径(pd-1/pd-l1)。因此，本发明可以与至少一种检查点调节剂如抗ctla-4、抗pd1或抗pd-l1分子联合使用，以对抗免疫抑制性肿瘤环境并引起强烈的抗免疫反应。[0058]根据本发明的又一个方面，提供了一种对患者进行接受检查点抑制剂癌症治疗分层的方法，其包括：[0059]i)从患者身上提取肿瘤样本；[0060]ii)将样本溶解或悬浮在液体中；[0061]iii)使所述液体通过用于肿瘤抗原鉴定的装置，该装置包括：至少一个含有多个支撑物的流动通道，这些支撑物上连接有至少一个分子或至少一个复合物，该复合物上结合有至少一个抗mhc(主要组织相容性复合物)抗体或至少一个抗泛人类白细胞抗原(hla)抗体，从而能用所述至少一个抗体从所述样本中提取流经所述通道的样本中的pmhc(肽:主要组织相容性复合物)；[0062]iv)将所述至少一个抗体与所述样本中的至少一个pmhc(肽:主要组织相容性复合物)结合；[0063]v)可选地，从所述装置中移除部分iv)的所述至少一个结合的pmhc(肽:主要组织相容性复合物)；[0064]vi)将所述结合的pmhc(肽:主要组织相容性复合物)的所述肽与人类病原体衍生的抗原文库进行比较，以确定所述肽是否与至少一个人类病原体衍生的抗原或其部分显示出序列同源性/亲和力，并且其中存在大于60％的同源性/亲和力；[0065]vii)将所述肽鉴定为肿瘤抗原；以及[0066]viii)当发现所述肽时，向所述患者施用有效量的至少一种检查点抑制剂(ici)。[0067]根据本发明的又一个方面或实施方案，提供了一种对患者进行接受检查点抑制剂癌症治疗分层的方法，其包括：[0068]确定患者是否为cmv血清阳性，如果是这样，则选择患者使用有效量的至少一种检查点抑制剂(ici)进行治疗。[0069]根据本发明的又一个方面，提供了一种治疗癌症的方法，其包括：[0070]i)从患者身上提取肿瘤样本；[0071]ii)将样本溶解或悬浮在液体中；[0072]iii)使所述液体通过用于肿瘤抗原鉴定的装置，该装置包括：至少一个含有多个支撑物的流动通道，这些支撑物上连接有至少一个分子或至少一个复合物，该分子或复合物上结合有至少一个抗mhc(主要组织相容性复合物)抗体或至少一个抗泛人类白细胞抗原(hla)抗体，从而能用所述至少一个抗体从所述样本中提取流经所述通道的样本中的pmhc(肽:主要组织相容性复合物)；[0073]iv)将所述至少一个抗体与所述样本中的至少一个pmhc(肽:主要组织相容性复合物)结合；[0074]v)可选地，从所述装置中移除部分iv)的所述至少一个结合的pmhc(肽:主要组织相容性复合物)；[0075]vi)将所述结合的pmhc(肽:主要组织相容性复合物)的所述肽与人类病原体衍生的抗原文库进行比较，以确定所述肽是否与至少一个人类病原体衍生的抗原或其部分显示出序列同源性/亲和力，并且其中存在大于60％的同源性/亲和力；[0076]vii)将所述肽鉴定为肿瘤抗原；以及向所述患者施用有效量的所述肽，以刺激或激活针对肿瘤抗原和从其提取样本的癌症的t细胞，或使用所述肿瘤抗原扩大对所述肿瘤抗原有活性的t细胞群，然后向患者施用所述t细胞。[0077]根据本发明的又一个方面或实施方案，提供了一种治疗癌症的方法，其包括：[0078]确定患者是否为cmv血清阳性，如果是这样，则向所述患者施用有效量的至少一种检查点抑制剂(ici)。[0079]根据本发明的又一个方面，提供了一种对患者进行腺病毒癌症治疗分层的方法，其包括：[0080]i)从患者身上提取肿瘤样本；[0081]ii)将样本溶解或悬浮在液体中；[0082]iii)使所述液体通过用于肿瘤抗原鉴定的装置，该装置包括：至少一个含有多个支撑物的流动通道，这些支撑物上连接有至少一个分子或至少一个复合物，该分子或复合物上结合有至少一个抗mhc(主要组织相容性复合物)抗体或至少一个抗泛人类白细胞抗原(hla)抗体，从而能用所述至少一个抗体从所述样本中提取流经所述通道的样本中的pmhc(肽:主要组织相容性复合物)；[0083]iv)将所述至少一个抗体与所述样本中的至少一个pmhc(肽:主要组织相容性复合物)结合；[0084]v)可选地，从所述装置中移除部分iv)的所述至少一个结合的pmhc(肽:主要组织相容性复合物)；[0085]vi)将所述结合的pmhc(肽:主要组织相容性复合物)的所述肽与人类病原体衍生的抗原文库进行比较，以确定所述肽是否与至少一个人类病原体衍生的抗原或其部分显示出同源性/亲和力，并且其中存在大于60％的同源性/亲和力；[0086]vii)将所述肽鉴定为肿瘤抗原；以及[0087]viii)当发现所述肽时，将所述肽连接到腺病毒载体的衣壳上，并将有效量的所述腺病毒载体施用于所述患者。[0088]在优选的实施方案中，所述肽使用已知的技术如wo 2015/177098中描述的技术和/或本文包含的技术连接到所述腺病毒载体，参见pepticrad制备。[0089]本文提到的“有效量”是指足以达到所需生物效应(如癌细胞死亡)的量。[0090]可以理解的是，有效剂量将取决于接受者的年龄、性别、健康状况和体重、同时进行的治疗(如果有的话)种类、治疗频率以及所需效果的性质。通常情况下，有效量由实施治疗的人决定。[0091]最优选地，本文所指的癌症包括下列癌症中的任何一种或多种：鼻咽癌、滑膜癌、肝细胞癌、肾癌、结缔组织癌、黑色素瘤、肺癌、肠癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、脑癌、喉癌、口腔癌、肝癌、骨癌、胰腺癌、绒毛膜癌、胃泌素瘤、嗜铬细胞瘤、催乳素瘤、t细胞白血病/淋巴瘤、神经瘤、von hippel-lindau病、zollinger-ellison综合征、肾上腺癌、肛门癌、胆管癌、膀胱癌、输尿管癌、少突胶质瘤、神经母细胞瘤、脑膜瘤、脊髓肿瘤、骨软骨瘤、软骨肉瘤、尤文氏肉瘤、原发部位不明的癌症、类癌、胃肠道类癌、纤维肉瘤、乳腺癌、佩吉特氏病、宫颈癌、食道癌、胆囊癌、头癌、眼癌。颈癌、肾癌、威尔姆斯瘤、肝癌、卡波西氏肉瘤、前列腺癌、睾丸癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、皮肤癌、间皮瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、内分泌胰腺癌、胰高血糖素瘤、甲状旁腺癌、阴茎癌、垂体癌、软组织肉瘤、视网膜母细胞瘤、小肠癌、胃癌、胸腺癌、甲状腺癌、滋养细胞癌、葡萄胎、子宫癌、子宫内膜癌、阴道癌、外阴癌、听神经瘤、蕈样真菌病、胰岛瘤、类癌综合征、生长抑素瘤、牙龈癌、心脏癌、唇癌、脑膜癌、口腔癌、神经癌、腭癌、腮腺癌、腹膜癌、咽癌、胸膜癌、唾液腺癌、舌癌和扁桃腺癌。[0092]在本发明的特别优选的实施方案中，所述样本取自黑色素瘤，并且所述肿瘤抗原与cmv抗原或肽同源。[0093]在所附的权利要求书和前面对本发明的描述中，除非由于明确的语言或必要的暗示，上下文有不同的要求，否则“包括(comprise)”一词，或诸如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”的变体是在包含的意义上使用的，即明确指出所述特征的存在，但不排除在本发明的各种实施方案中存在或增加进一步的特征。[0094]本说明书中引用的所有参考文献，包括任何专利或专利申请，均通过引用的方式并入本文。不承认任何参考文献构成现有技术。此外，不承认任何现有技术构成本领域公知常识的一部分。[0095]本发明每个方面的优选特征可以结合其他任何方面进行描述。[0096]本发明的其他特征将从下面的实施例中变得明显。一般来说，本发明扩展到本说明书(包括所附的权利要求书和附图)中公开的特征中的任何新颖的一个或任何新颖的组合。因此，与本发明的特定方面、实施方案或实施例结合描述的特征、整数、特性、化合物或化学部分，应理解为适用于本文所述的任何其他方面、实施方案或实施例，除非与之不相容。[0097]此外，除非另有说明，否则本文公开的任何特征都可以由服务于相同或相似目的的替代特征所取代。[0098]在本说明书的整个描述和权利要求中，除非上下文另有要求，否则单数包含复数。特别是，在使用不定冠词的情况下，除非上下文另有要求，否则本说明书应被理解为考虑到多数和单数。附图说明[0099]现在将参考以下仅以举例的方式描述本发明的实施方案，其中：[0100]图1.[a]peptichip内部。peptichip内部由数以千计的柱子组成，这些柱子上涂有连接剂，连接剂上连接有生物素。然后生物素与链霉亲和素反应，链霉亲和素随后可以与三个分子的hla特异性捕获抗体反应。[b].微芯片技术作为一种新型的免疫纯化平台，用于快速发现抗原。[0101]描述新开发的微芯片方法的示意性概述。含有表面游离硫醇的硫醇-烯(thiol-ene)微芯片被生物素-peg4-炔烃硫醇烯(thiolene)衍生化(步骤1)，并用一层链霉亲和素功能化(步骤2)，之后生物素化的泛hla抗体被固定在微柱表面(步骤3)，细胞裂解物被装入微芯片(步骤4)。经过充分的孵育时间和清洗步骤后，加入7％醋酸洗脱hla分子(步骤5)。[0102]图2.用生物素化的泛hla抗体对微芯片功能化的选择性进行表征。[0103]a)alexafluor 488-链霉亲和素在两个不同的链霉亲和素孵育时间(15分钟和1小时)在预涂有生物素-peg4-炔烃的硫醇-烯微柱上的结合效力。b)链霉亲和素(非荧光)浓度对通过alexafluor 488标记的第二抗体定量的固定化生物素化泛hla抗体量的影响。c)bsa孵育对通过alexafluor 488标记的第二抗体定量的固定化生物素化泛hla抗体的数量的影响。在固定生物素化的泛hla抗体之前(bsa-泛hla)或之后(泛hla-bsa)，通过用bsa预处理微柱阵列来评估bsa在阻断非特异性结合位点中的效率。d)生物素化的泛hla抗体结合在单个芯片上的总量是负载周期的函数。对于每个周期，使用相同(恒定)泛hla抗体浓度的新批次。显著性是通过双尾非配对学生t检验评估的，*p《0.05。[0104]图3.从jy细胞系获得的hla-i多肽组(peptidome)数据集的特性。a)从50×106、10×106和1×106个jy细胞中洗脱出来的独特肽的数量。b)从jy细胞系得到的三个数据集中hla肽的总体肽长度分布。c-e)hla肽的长度分布以50×106(c)、10×106(d)和1×106(e)的独特肽数(左y轴)和出现的百分比(右y轴)描述。[0105]图4.从jy细胞系分离的hla配体的精确分析。a)分析了洗脱的9mer与hla-a*02:01和hla-b*07:02的结合亲和力。结合物(绿点)和非结合物(黑点)是在netmhcpan 4.0服务器中定义的(应用等级为2％)。b)hla-i共有结合基序。进行gibbs聚类分析以定义洗脱的9mer肽中的共有结合基序。右上角描绘了参考基序。显示了具有最佳适配性的聚类(较高的kld值，橙色的星形)，序列标志用每个聚类的hla-i的数量表示。[0106]图5a.hex算法的流程图。根据肿瘤肽(参考肽)的氨基酸组成生成一个矩阵。然后用这个矩阵来扫描病毒数据库，并将产生的病毒肽按识别的对数似然的次序进行排序。对每个病毒肽分配一个排列分数和一个mhc-i结合预测的分数。候选病毒肽基于以下标准进行排序。mhc-i结合预测分数》排列分数》b-分数，对评分最高的肽进行实验分析。[0107]图5b.现有软件的使用流程图。长度为8到12个氨基酸的肿瘤肽列表可以作为软件的输入。首先使用blast工具在病原体衍生的抗原文库中找到hits(相似序列)。对于这项任务，通常使用pam30，但是blosum和pam替代矩阵两者在几个进化距离上都支持。接下来，至少使用blosum62，理想地还使用kim等人开发的替代矩阵(描述于bmc bioinformatics.2009；10:394，2009年11月30日出版，doi:10.1186/1471-2105-10-394derivation of an amino acid similarity matrix for peptide:mhc binding and its application as a bayesian prior.kim y,sidney j,pinilla c,sette a,peters b.)进行成对细化比对，从而以位置加权方式细化比对。在tcr相互作用区域(肽的中心部分)具有高相似性的一对肽获得较高的相似性分数。最后，使用netmhc4.0或netmhcpan4.1作为独立的命令行工具对肿瘤和病毒的同源肽进行mhc结合亲和力预测。这些结果最终在工具中被自动解析和整理，并创建一个总结上述分析的最终分数。[0108]图6：用与肿瘤抗原同源的病毒肽进行免疫，减缓了肿瘤生长。[0109]a：动物实验的方案：为了评估与肿瘤肽相似的病毒肽是否能影响肿瘤生长，我们组成了4组c57bl6小鼠。一组幼稚小鼠作为模拟，其他三组各自用不同的病毒肽库进行免疫。在肿瘤移植前的2个时间点，即14天和7天，对小鼠进行免疫。[0110]b：在第一次免疫两周后，小鼠皮下注射3×105个小鼠黑色素瘤b16-ova细胞。移植后，每隔一天通过用数字卡尺测量来跟踪肿瘤生长，持续19天。使用双因素anova多重比较和tukey校正来计算p值。[0111]c：达到终点时对小鼠实施安乐死。收集每组小鼠的脾细胞并合并起来进行elispot测定。然后用各自的病毒肽(与tyr1同源的病毒肽、与trp2同源的病毒肽、与gp100同源的病毒肽)对每个库(pool)进行脉冲，以评估对治疗的反应。虚线表示由阴性对照产生的背景。[0112]图7：对mhc有更高亲和力的病毒肽更具有免疫原性，能引起更强的交叉反应。[0113]a：为了评估对各自原始肿瘤表位的反应，将每组免疫的脾细胞合并起来，用相应的肿瘤肽进行脉冲。[0114]b：用合并的病毒肽和相应的原始肿瘤肽对脾细胞进行脉冲所引起的反应之间的比较。[0115]c：预测的原始肿瘤和各自相似的病毒肽库对小鼠mhc i类的亲和力。50n m被认为是根据iedb指南定义具有“高亲和力”和“中/低亲和力”的肽的阈值。[0116]d：来自ifn-γ反应的数据和预测的亲和力之间的相关性。[0117]e：根据肽的亲和力和刺激ifn-γ产生的能力对肽进行的分层。高亲和力的肽(ic50《50nm)与中/低亲和力的肽(ic50》50nm)相比，促进inf-γ的产生明显较高。使用t检验和曼-惠特尼校正来计算p值。根据以下标准，p值的范围用星号标记：》0.05(ns)，≤0.05(*)，≤0.01(**)，≤0.001(***)，≤0.0001(****)。[0118]图8.与肿瘤抗原同源的病毒肽可以减少已经建立的肿瘤中的肿瘤生长。[0119]a：动物实验的方案：对于每个待测的肿瘤细胞系，组成4组c57bl小鼠。在第0天给小鼠皮下注射b16-ova或b16f10细胞。一旦肿瘤可触及，就用盐水溶液(模拟组)、未包被的腺病毒(未包被病毒组)、包被有与trp2同源的病毒肽库的腺病毒(viral pepticrad,vpc)或包被有trp2肽的腺病毒(trp2 pepticrad,tpc)治疗小鼠。[0120]b：b16 ova肿瘤个体生长。定义治疗成功的阈值是由最后一天所有肿瘤体积的中位数来确定的。[0121]c：终点的b16 ova肿瘤体积。肿瘤体积的中位数显示为虚线，定义了治疗成功的阈值。[0122]d：b16 ova列联图(contingency plot)显示每组治疗的反应者数量。[0123]e：b16 f10肿瘤个体生长。定义治疗成功的阈值是由最后一天所有肿瘤体积的中位数来确定的。[0124]f：终点的b16 f10肿瘤体积。肿瘤体积的中位数显示为虚线，定义了治疗成功的阈值。[0125]g：b16 ova列联图显示每组治疗的反应者数量。[0126](c-f)：使用单因素anova和tukey校正来计算p值。根据以下标准，p值的范围用星号标记。》0.05(ns)，≤0.05(*)，≤0.01(**)，≤0.001(***)，≤0.0001(****)。[0127](d-g)：使用可能性比的卡方(和fischer精确)检验来计算p值。根据以下标准，p值的范围用星号标记。》0.05(ns)，≤0.05(*)，≤0.01(**)，≤0.001(***)，≤0.0001(****)。[0128]图9.具有高度同源性/亲和力的病毒和肿瘤抗原之间的t细胞交叉反应性。用表2中的肽对来自hla-a*02:01和高血清水平的抗cmv抗体患者的pbmc进行脉冲。通过elispot测定检测由cd8+t细胞激活的ifn-γ分泌水平。虚线表示来自阴性对照(dmso)中ctl非特异性激活的噪音水平(a)。使用cmv特异性hla-a*02:01限制性肽nlvpmvatv，通过elispot测定检测来自hla-a*02:01和高血清水平的抗cmv抗体患者和来自cmv反应阳性的健康供体(hs)的pbmc的抗cmv反应。使用t检验和曼-惠特尼校正来计算p值(b)。[0129]图10.基于微芯片的平台揭示了稀缺肿瘤活检中的免疫肽组学(immunopepetidomic)概况。a)这里总结了样本处理前的重量、总数量和独特肽以及在7-13mer样本中的富集。b)肽关于其绝对数量和百分比的长度分布显示为条形图。[0130]图11.ccrcc和膀胱肿瘤患者衍生类器官(pdo)的免疫肽组学分析。a)在ccrcc和膀胱pdo中检测到的独特肽的数量。b)肽的长度分布显示为独特肽的总数量(左y轴)和每个pdo出现的百分比(右y轴)(ccrcc上方小图，膀胱下方小图)。[0131]图12.肽的测试。balb/c小鼠的左右两侧皮下注射合成的肿瘤模型ct26(第0天，图12a)。当肿瘤建立后(第7天，图12a)，用我们列表中的每对聚赖氨酸修饰的肽(pepticrad1，pepticrad2，pepticrad3，表)包被valo-md901，只在右侧肿瘤内进行瘤内注射。pepticrad4由用gp70423-431(ah1-5)包被的valo-md901组成，已知ct26的免疫显性抗原来自基因组中编码的自体抗原。模拟组和valo-md901组也被用作对照。pepticrad1和pepticrad2改善了肿瘤生长的控制，也改善了注射的病灶中的valo-md901(图12b，图右侧)，这也显示在每个治疗组的每只小鼠的单个肿瘤生长中。严格地说，只有pepticrad1显著提高了未经治疗的肿瘤中的抗肿瘤活性，而valo-md901没有引发任何效果(图12b，图左侧)。[0132]pepticrad1中的肽由hex分析得出。pepticrad4由用gp70 423-431(ah1-5)包被的valo-md901组成。[0133]图13.描绘了本发明的示意性概述。本发明的装置以示意图的形式描绘，它先前已被多个抗mhc(主要组织相容性复合物)抗体或抗泛人类白细胞抗原(hla)抗体功能化，这些抗体能够捕获pmhc(肽:主要组织相容性复合物)。肿瘤裂解物通过该装置，抗体提取pmhc。pmhc被洗脱，pmhc复合物中的肽被分析，例如通过液相色谱与质谱分析(lc-ms/ms)，结果是产生一个肿瘤肽列表。每种肿瘤肽与病原体衍生的蛋白质(包括抗原)文库进行比较，以确定使用该装置鉴定的每种肿瘤肽与该文库中的病原体衍生的蛋白质(包括病原体抗原/病原体肽)之间的同源性/亲和力水平。这产生了一个候选列表，理想地在同源性/亲和力方面进行优先排序，以用于癌症治疗。[0134]表1.用于动物实验的肽。用hex分析已知的黑色素瘤肿瘤肽(trp2180-188、hgp10025-33和tyr208-216)。选择软件提出的最佳病毒候选肽，并对由每个原始肿瘤表位的最佳4种异种肽(xenopeptide)组成的库进行体内测试。[0135]表2.用于对患者的pbmc进行elispot的肽。用hex分析已知的黑色素瘤相关的抗原。选择每种抗原的最佳人类cmv衍生的候选肽进行体外测试。[0136]表3.基于微芯片的免疫沉淀技术与标准程序的比较分析。该表报告了涂布到基于微芯片的ip技术和标准程序中的抗体总量。[0137]表4.显示hex输出鉴定的13个肿瘤mhc限制性肽与它们对应的病原体衍生的肽。[0138]表5.在elispot测定中测试的肽的表。[0139]表6.用于图12所示的体内pepticrad测定的所选肽的表。具体实施方式[0140]方法和材料[0141]装置制造[0142]本发明的装置(称为peptichip)是一种流动构造，包含数千个柱子，柱子上包被有连接剂，连接剂上连接有生物素。生物素又与链霉亲和素连接，链霉亲和素与hla特异性捕获抗体结合，具体来说就是三个分子的hla特异性捕获抗体。[0143]使用传统的微流控制造技术，peptichip的制造是基于紫外线引发的硫醇和烯丙基(“烯”)官能团之间的光反应，二者根据以下的非化学计量比150:100(四硫醇:三烯丙基)。[0144]在上述制造之后，peptichip立即用生物素-peg4-炔烃(sigma，764213)通过紫外光聚合进行衍生化，然后与亲和素反应。如下进行。[0145]步骤1：我们制备了1mm的生物素-peg4-炔烃溶液(10mm生物素-peg4-炔烃在乙二醇(ethyleglycol)中的储备液)。我们取了一个小的等分试样，加入1％(m/v)的光引发剂(tpo-l，basf)，使用甲醇中的10％光引发剂储备液，因此，最终溶液是1mm生物素+1％ lucirin在eg-meoh 9:1*中。[0146]我们用一体积的生物素-peg4-炔烃和1％ lucirin在eg:meoh 9:1(v/v)中的溶液填充芯片，暴露在紫外线下1分钟(使用led紫外线灯l＝365nm，l＝15mw/cm2)。[0147]我们首先用甲醇彻底冲洗，然后用milli-q水冲洗，我们将1-2ml的每种溶剂冲过通道，并将其干燥储存(如有必要)。[0148]步骤2：在用生物素衍生后，芯片用链霉亲和素功能化。我们在pbs中制备了0.01mg/ml的链霉亲和素储备液，并在室温下将其加入chip，在黑暗中放置15分钟。我们用200ul的pbs清洗3次。[0149]我们加入在pbs中15mm的100ug/ml bsa，在室温下放置10分钟。[0150]步骤3：与抗泛hla抗体反应。我们加入25ul生物素抗人hla-a、hla-b、hla-c 1.6ug/ul(biolegend cat.号311434)，在室温下放置15分钟。然后我们用200ul pbs清洗三次，然后chip准备好进行mhc复合物的免疫沉淀。[0151]肿瘤样本制备：我们用edta 4mm分离细胞，用pbs清洗一次。加入25ul pbs中1％的igepal+蛋白酶抑制剂。在4℃下以500xg离心10分钟。在4℃下以20000xg离心10分钟。[0152]优化的微流控柱阵列[0153]通过将生物素化的泛hla抗体添加到链霉亲和素预功能化的固体支撑结构(即微柱阵列)，然后将hla固定在泛hla抗体包被的固体表面，在单个微流控芯片内进行免疫纯化步骤。[0154]综上所述，用紫外光复制技术(uv-replicamolding technique)制造了基于非化学计量的硫醇-烯(off-stoichiometric thiol-ene，oste)聚合物的微柱阵列，并进行了生物素化。接下来，生物素化的微柱被链霉亲和素功能化，并加入生物素化的泛hla抗体，之后将细胞裂解物直接装入微流控芯片，以选择性地捕获hla-i复合物。在充分清洗后，在室温下通过应用7％醋酸来洗脱被捕获的hla-i复合物(图1b)。此后，该方案按照标准免疫肽组学工作流程进行，包括用在乙腈中纯化洗脱的hla肽，并通过真空离心将其蒸发至干。[0155]在荧光alexafluor488-链霉亲和素的帮助下，对两种不同的孵育时间(15分钟和1小时)的微柱阵列上的链霉亲和素功能化的效率进行了检查。发现较短的孵育时间足以建立第一个链霉亲和素层(图2a)。此外，为了确定链霉亲和素浓度对固定化生物素化泛hla抗体的最终数量的影响，在固定数量的生物素化的泛hla抗体存在下，测试了几种浓度的非荧光链霉亲和素。在这种情况下，生物素化的泛hla抗体被孵育15分钟，然后用pbs清洗三次(每次200μl)。为了对每个链霉亲和素浓度下的固定化生物素化泛hla抗体的数量进行定量，使用了荧光标记的alexafluor488二级抗体来滴定固定化生物素化泛hla抗体。有趣的是，即使链霉亲和素浓度增加10倍，也不会对固定化生物素化泛hla抗体的数量产生很大影响(图2b)，这可能是由于立体障碍限制了可用的链霉亲和素结合位点的数量。基于这一发现，没有进一步探索链霉亲和素的浓度，但在所有后续实验中使用了测试的最高链霉亲和素浓度(0.1mg/ml)，以确保生物素化的泛hla抗体的最大结合。然而，为了进一步研究抗体与链霉亲和素功能化的微柱表面结合的选择性，研究了另外的牛血清白蛋白(bsa)包被步骤对固定化生物素化泛hla抗体数量的影响，以消除非特异性相互作用。为此，在链霉亲和素功能化后，用bsa(100μg/ml，在15mm pbs中，孵育10分钟)对微柱阵列进行预处理，并在荧光标记的第二抗体的帮助下再次确定生物素化的泛hla抗体后续结合的效率。与非预处理的表面相比，这个过程大大减少了固定化的泛hla抗体的数量(图2c)，这表明非特异性结合位点可以通过简单的bsa预孵育步骤来阻断。因此，bsa孵育步骤适用于所有进一步的实验。[0156]最后，我们试图通过使用优化的方案来表征固定化生物素化泛hla抗体在单个芯片上的最大量。这是通过在单个微流控芯片上使用相同浓度(0.5mg/ml)的新抗体批次的多个负载周期来评估的。在这种情况下，固定化的泛hla抗体的数量是通过elisa测定比较进样液和输出液中的泛hla抗体数量来确定的。据观察，固定化抗体的数量几乎随着负载周期的增加而线性增加(图2d)，从而可以根据负载周期的数量准确调整固定化生物素化泛hla抗体的总量。七个周期后，固定化的抗体量达到了约45μg，这至少在理论上足以对稀缺的生物材料进行免疫肽组研究，因为10mg的泛hla(3.88×1016个抗体分子)是现有技术的方法研究109个细胞所需的[22a](表3)。[0157]通过微芯片的设置，1.74×1014个抗体分子可以被固定，技术上可以研究4.5×106个细胞。[0158]在免疫肽组学工作流程中实施的基于微芯片的抗原富集可以鉴定自然呈现的hla-i肽[0159]为了评估所开发的硫醇-烯微芯片是否可以作为抗原发现的平台，我们从人类b细胞类淋巴母细胞系jy免疫纯化了hla肽。jy系具有高表达的i类hla，并且是人类中常见的三个等位基因(hla-a*02:01、hla-b*07:02和hla-c*07:02)的纯合体，它已被广泛用于配体组(ligandome)分析。因此，jy细胞系被认为是衡量基于微芯片的抗原富集免疫沉淀技术的合适模型。[0160]因此，hla-i复合物使用硫醇-烯微芯片进行免疫亲和纯化，用上述量的泛hla抗体进行功能化。此外，为了确定我们方法的灵敏性，我们使用低至50×106、10×106和1×106的总细胞数来挑战该方案。裂解物被装入微芯片，在用pbs充分清洗后，用7％的醋酸洗脱肽，并用串联质谱分析。整个工作流程，从链霉亲和素功能化到肿瘤肽的洗脱，平均需要《24小时。对肽和蛋白质的鉴定采用了1％的严格的假发现率阈值，以产生具有高置信度的数据。我们能够从50×106、10×106和1×106个细胞中分别鉴定出5589、2100和1804条独特的肽(图3a)。[0161]由于我们试图仔细分析微芯片技术富集天然hla-i结合物并避免潜在的共洗脱污染物的能力，我们广泛地表征了洗脱的肽。首先，来自jy细胞系的洗脱的肽代表了配体组数据集的典型长度分布，其中9mer是最丰富的肽种类(图3b-图3e)。接下来，确定jy细胞中表达的两个hla-i等位基因(hla-a*0201和hla-b*0702)的预测的结合亲和力。jy细胞也有低水平的等位基因hla-c*0702，但其结合基序与hla-a*0201和hla-b*0702的基序重叠；因此，在随后的分析中只考虑这些等位基因。[0162]在独特的9mer中，78％、83％和67％被分别预测为与50×106、10×106和1×106个细胞的hla-a*0201或hla-b*0702等位基因的结合物(在netmhcpan4.0中被描述为结合物，应用等级2％[24a-26a])(图4a)。此外，进行吉布斯分析，以从洗脱的9mer肽中的各自hla-i等位基因的共有结合基序去卷积；这些基序聚集在两个不同的组中，倾向于降低p2和ω位置处的残基的氨基酸复杂性，与hla-a*0201和hla-b*0702的已知基序非常匹配(图4b)。[0163]接下来，为了确定所鉴定的肽的作用，对我们的9mer结合物源蛋白列表进行了基因本体论(go)术语富集分析。我们观察到细胞核中和细胞内蛋白质的富集，主要是那些与dna、rna相互作用或参与分解代谢活动的蛋白质。最后，我们建立了一个体外杀伤测定，以进一步证明微芯片技术在分离与hla-i复合的肽方面的能力。为此，从我们的jy数据集中选择了一组三种肽来刺激hla匹配的pbmc；从pbmc中纯化出cd8+t细胞，并作为效应细胞与jy细胞共培养。为了说明效应细胞本身引起的非特异性细胞毒性，未受刺激的pbmc用作对照。然后监测实时的细胞溶解。有趣的是，用肽qlvdiiekv(seq id no:75；基因名称psme3)和kvleyvikv(seq id no:76；基因名称magea1)脉冲的cd8+t细胞显示出大约10％的特异性细胞溶解，而用肽ildkkvekv(seq id no:77；基因名称hsp90ab3p)脉冲的cd8+t细胞诱发了15％的特异性细胞溶解，表明在有限定的肽存在时有特异性溶解。[0164]为了评估我们通过微芯片技术鉴定的hla-i肽列表的有效性，我们查询了systemhc，一个由质谱法产生的免疫肽组学数据集的数据库。在我们的数据中鉴定的独特的9mer结合物中，69％、77％和81％的结合物也分别在先前公开的源自50×106、10×106和1×106个细胞的jy细胞系(pride id pxd000394)[3a]的配体组数据集中找到(图6a)。此外，源蛋白的丰度和hla呈现之间的正相关被证实，最丰厚的蛋白是hla肽的主要来源。[0165]因此，这些结果表明，基于芯片的方案可以作为免疫肽组学工作流程中一个可靠的免疫沉淀平台。[0166]装置使用[0167]将样本应用于芯片并洗脱级分以进行后续分析。[0168]我们通过多个周期应用样本并孵育5分钟(在4℃下工作)。我们用200ul的pbs清洗3次，并抽吸最后一次清洗来清空芯片。我们制备了50％ meoh和50％ milliq的溶液。我们用之前的溶液制备了7％的醋酸溶液。我们将该溶液施加在chip上并收集级分。洗脱时间为5分钟。在同一天，我们对收集到的级分进行了纯化。我们为hla-i肽样本的每个组织样本准备了seppak滤芯，并标记它们。使用注射器和专用的适配器，我们先用1ml 0.1％ tfa中的80％ acn清洗滤芯一次，然后用1ml 0.1％ tfa清洗两次。我们将每个生物样本装在seppak滤芯上。我们将它们慢慢通过(速度为约1ml/20s)。我们用1ml 0.1％ tfa清洗滤芯两次。我们用300ul 0.1％ tfa中的30％ can将hla结合肽洗脱到收集管中。[0169]hex(异种肽的同源性评价)[0170]异种肽的同源性(/亲和力)评价(hex)是一个新的计算机模拟平台，它比较了肿瘤肽(参考肽)和病原体衍生的(如病毒)肽(查询肽)之间的相似性。它利用几个指标来加速候选肽的选择。这是通过合并新的方法(肽评分和排列评分算法)和整合的现有方法(mhc-i结合预测)来完成的。hex带有一些预编译的已知蛋白质数据库，例如来自病毒病原体和人类蛋白质组的蛋白质(33)。[0171]相关的评分矩阵是根据参考肽的氨基酸组成临时生成的，而不是通过实验。特别是在代表肽中氨基酸位置的矩阵行和代表20个标准氨基酸中每个氨基酸的列中，参考肽的氨基酸位置被赋予相同的高分，其他位置被赋予相同的低分。[0172]在查询集中的肽与参考集中的肽之间成对地计算排列。对于给定的一对肽，它们的排列是通过对同一位置的氨基酸对之间的距离分数进行加和来计算的。评分是加权的，优先考虑肽中更多中心氨基酸之间的相似性。hex支持跨越几个进化距离的blosum和pam替代矩阵。具体来说，blosum 62是本研究选择的矩阵。[0173]mhc i类结合亲和力的预测是通过iedb的应用程序编程界面(http://tools.iedb.org/main/tools-api/)使用netmhc[27]进行的，然后在该工具内进行解析和整理。用户可以指定他们想要的评分方法或返回一些推荐的结果。支持对一些人类和鼠类mhc-i等位基因的预测。[0174]用户能够按自己的标准选择肽，或允许用随机森林模型选择肽。随机森林是根据作者选择的肽的实验结果训练的。特征的重要性由袋外(oob)均方误差(mse)的增加来确定，并在看不见的肽样本上进行交叉验证。hex是使用r软件包shiny开发的网络应用程序，可在https://picpl.arcca.cf.ac.uk/hex/app/上获得，无需用户注册。源代码可在https://github.com/whalleyt/hex上获得。[0175]在本发明的替代实施方案中，hex支持跨越几个进化距离的blosum和pam替代矩阵。具体来说，blosum 62是本研究中使用的矩阵。hex，首先使用pam30进行blast搜索，找到参考文库中的hits(相似序列)。接下来，hex使用blosum62和kim等人开发的替代矩阵进行成对细化比对。[0176]参考文献：kim y,sidney j,pinilla c,sette a,peters b.derivation of an amino acid similarity matrix for peptide:mhc binding and its application as a bayesian prior.bmc bioinformatics.2009；10:394，2009年11月30日发表，doi:10.1186/1471-2105-10-394。[0177]使用netmhc4.0(或netmhcpan4.1)作为一个独立的命令行工具进行mhc i类结合亲和力预测，然后在该工具中进行解析和整理。用户可以指定他们想要的评分方法或返回一些推荐的结果。支持对一些人类和鼠类mhc-i等位基因的预测。[0178]患者和样本[0179]在赫尔辛基大学中心医院(huch)综合癌症中心，共有16名4期转移性黑色素瘤患者接受了抗pd1单克隆抗体治疗。患者被随机选择，每隔一周接受纳武单抗(nivolumab)(n＝7)输注，或每隔三周接受帕博利珠单抗(pembrolizumab)(n＝9)输注。该研究得到了赫尔辛基大学中心医院(huch)伦理委员会的批准(dnro115/13/03/02/15)。收到了所有患者的书面知情同意书，研究是按照赫尔辛基宣言进行的。[0180]在三个时间点采集外周血液样本(3ml edta血液，50ml肝素血液)；开始治疗前，治疗后一个月和三个月。通过离心分离血浆，然后储存在-70℃。使用vidas cmv igg(biomérieux，marcy-l'etoile，法国)和siemens enzygnost抗ebv/igg试剂盒(siemens healthcare diagnostics，marburg，德国)从解冻的edta血浆样本中测量cmv和ebv igg水平。解冻的肝素血浆中的免疫球蛋白(iga、igm、igg)是在赫尔辛基大学中心医院的中心实验室(huslab)测量的。[0181]细胞系和人类样本[0182]小鼠黑色素瘤细胞系b16-f10购自美国模式培养物集存库(atcc；manassas,va,usa)。细胞在含有10％胎牛血清(fbs)(life technologies)、1％ glutamax(gibco,thermo fisher scientific,us)和1％青霉素和链霉素(gibco,thermo fisher scientific,us)的rpmi(gibco,thermo fisher scientific,us)中在37℃/5％ co2下培养。[0183]细胞系b16-ova是一种经过改良的小鼠黑色素瘤细胞系，可以组成性表达鸡卵白蛋白(ova)，由richard vile教授(mayo clinic,rochester,mn,usa)友好地提供。这些细胞在含有10％ fbs(gibco,thermo fisher scientific,us)、1％ glutamax、1％青霉素和链霉素(gibco,thermo fisher scientific,us)和1％遗传霉素(gibco,thermo fisher scientific,us)的rpmi低葡萄糖(gibco,thermo fisher scientific,us)中在37℃/5％ co2下培养。[0184]用商业检测试剂盒(lonza–basel，瑞士)检测所有细胞的支原体污染情况。分离的人类pbmc在补充有10％ dmso的fbs中冷冻，然后在液氮中保存，直到使用。将冷冻保存的pbmc解冻，在补充有10％ fbs、1％ glutamax、1％青霉素-链霉素的完全rpmi培养基中，在37℃/5％ co2下静置过夜，然后将其涂板用于elispot。[0185]肽[0186]本研究中使用的所有肽都购自浙江鸿拓生物技术有限公司(中国浙江)，5mg，》90％纯度。本研究中使用的所有肽的序列见表1和表2。[0187]pepticrad制备[0188]本工作中描述的所有pepticrad复合物都是按照以下方案通过混合腺病毒和加polyk尾巴的肽制备的：1×109vp(病毒颗粒)与20ug加polyk尾巴的肽(重悬于水中)混合；涡旋后，混合物在室温下孵育15分钟；孵育后加入pbs，达到注射体积(50ul/小鼠)，随后，将溶液再次涡旋，用于测定或动物注射。对于trp2-pepticrad，1×109vp与20ug的6k-trp2180-188肽混合，而病毒-pepticrad是用1×109vp与5ug的与trp2180-188同源的每种病毒6k-肽混合制备的。[0189]在每次实验前使用新鲜试剂制备新的pepticrad。在制备pepticrad的孵育前，所有需要的病毒和肽的稀释都在无菌pbs或水中进行。然后在测定所需的缓冲液中稀释pepticrad。[0190]病毒的产生、繁殖和表征如其他地方所述[20]。[0191]动物实验和伦理许可[0192]所有的动物实验都经过了赫尔辛基大学实验动物委员会和南芬兰省政府的审查和批准。[0193]所有的实验都使用从scanbur(karlslunde，丹麦)获得的c57bl/6jolahsd小鼠进行。[0194]对于免疫实验，将8至9周龄的有免疫能力的雌性c57bl/6j小鼠分为4组。n＝3只小鼠用作模拟组，n＝7只小鼠分别组成三个不同的处理组。每个治疗组都接种不同组别的异种肽。小鼠接种两次，间隔一周(第0天和第7天)在尾根部注射40ug肽和40ug佐剂(vaccigrade poly(i:c)-invivogen)，最终注射量为100ul。幼稚小鼠(注射pbs)用作模拟组。在第14天，在小鼠右侧注射3*105个b16-ova细胞，并跟踪肿瘤生长，直到达到终点。[0195]对于已建立的肿瘤的治疗，我们测试了两种不同的肿瘤细胞系：b16-ova细胞和更具侵略性的b16f10细胞。在8至9周龄的有免疫能力的雌性c57bl/6j小鼠的右侧皮下注射3*105个b16-ova细胞和1*105个b16-f10细胞。随后，将这些小鼠随机分为4组，每组7-8只小鼠，用于每种肿瘤细胞系。模拟组用pbs处理；第二组用未包被的腺病毒处理；第三组用包被有trp2180-188的腺病毒(trp2-pepticrad)处理；最后一组用包被有trp2同源病毒肽的腺病毒(viral-pepticrad)处理。[0196]小鼠接受两次瘤内治疗，间隔两天(从肿瘤移植开始的第10天和第12天)进行注射，并跟踪肿瘤生长，直到达到终点。最后一天的肿瘤体积测量的中位数确定了治疗成功的阈值，显示为虚线。在终点显示肿瘤体积低于阈值的小鼠被认为是应答者，而高于阈值的小鼠被认为是无应答者。[0197]用数字卡尺测量肿瘤的两个尺寸来跟踪肿瘤生长。随后，根据以下公式对体积进行数学计算：[0198]((长边)×(短边)2)/2[0199]在所有的实验中，每隔两天或三天测量一次肿瘤，直到肿瘤大小达到允许的最大值，然后处死小鼠并收集脾脏。[0200]elispot测定[0201]为了评估活跃的抗原特异性t细胞的数量，通过elispot测定来测量干扰素-γ(ifn-γ)的分泌，immunospot(ctl，美国俄亥俄州)用于测定小鼠ifn-γ，mabtech(mabtech ab，瑞典nacka strand)用于测定人ifn-γ。[0202]使用了在实验终点时采集的新鲜小鼠脾细胞。该程序根据制造商的说明进行。简而言之，对于小鼠ifn-γ，在第0天时，3*105个脾细胞/孔被涂板。用2ug/孔的肽刺激细胞。在37℃/5％ co2下孵育3天后，根据试剂盒的方案发展板。[0203]对于人ifn-γelispot，人pbmc被解冻并在37℃/5％ co2下在完全培养基中静置过夜。第二天，3×105个pbmc/孔被涂板，并用2ug/孔的肽刺激。在37℃/5％ co2下孵育48小时后，根据制造商的方案发展板。板被送到ctl-europe股份有限公司进行分析。[0204]细胞系和试剂[0205]在补充有1％ glutamax(gibco,invitrogen,carlsbad,ca,usa)和10％热灭活胎牛血清(hi-fbs,gibco,invitrogen,carlsbad,ca,usa)的rpmi 1640(gibco,invitrogen,carlsbad,ca,usa)中培养eb病毒转化的人类淋巴母细胞b细胞系jy(ecacc hla型集合，sigma aldrich)。[0206]链霉亲和素(streptomyces avidinii，亲和纯化，从10mm磷酸二氢钾中冻干，≥13u/mg蛋白质)购自sigma-aldrich(saint louis,missouri,usa)。[0207]生物素缀合的抗人hla-a、b、c克隆w6/32购自biolegend(san diego,ca,usa)，用于分析。[0208]以下肽购自ontores biotechnologies co.,ltd.，在整个研究中使用：kvleyvikv(seq id no:75；基因名称mage a1)，ildkkvekv(seq id no:76；基因名称hsp90)和qlvdiiekv(seq id no:77；基因名称psme3)。[0209]此外，以下肽购自chempeptide(中国上海)：[0210]vimdalkssy(seq id no:78；基因名称nnmt)，flaegggvr(seq id no:79；基因名称fga)和evaqpgpsnr(seq id no:80；基因名称hspg2)。[0211]卵巢肿瘤活检和伦理学考虑[0212]卵巢肿瘤活检采集自卵巢转移性肿瘤(高等级浆液性)患者，该患者签署了知情同意书，研究由北萨沃医院区研究伦理委员会批准，批准号为350/2020。将样本切成小块，用含有d型胶原酶(罗氏)1mg/ml、透明质酸酶(sigma aldrich)100μg/ml和dnase i(罗氏)1mg/ml的消化缓冲液在37℃下处理1小时。细胞悬液依次通过500μm和300μm的细胞过滤器(pluriselect)，以获得单细胞。[0213]肾细胞癌和膀胱肿瘤样本和伦理考虑[0214]用于类器官培养的患者组织样本从赫尔辛基大学中心医院的deducer研究(泌尿系统癌症诊断和治疗的发展)获得，批准号为hus/71/2017,26.04.2017，伦理委员会批准号为15.03.2017dnro 154/13/03/02/2016，并获得患者同意。肾脏样本从患有透明细胞肾细胞癌(ccrcc，ptnm阶段pt3a g2)的成年男性的肾切除手术中获得。良性肾脏组织样本被用于实验。尿道癌(膀胱癌，高级别，iii级，1x1 cm)从成年女性获得，癌症组织样本用于类器官培养。[0215]透明细胞肾癌和膀胱肿瘤类器官培养[0216]通过将组织解离成小块并用胶原酶(40单位/毫升)处理2-4小时，立刻从手术后的原始组织中分离出细胞。将透明细胞肾细胞癌患者细胞的肾脏的良性细胞和癌细胞在f-培养基[3:1(v/v)的f-12营养混合物(ham)-dmem(invitrogen)，5％ fbs，8.4ng/ml霍乱毒素(sigma)，0.4μg/ml氢化可的松(sigma)，10ng/ml表皮生长因子(corning)，24μg/ml腺嘌呤(sigma)，5μg/ml胰岛素(sigma)，10μm rock抑制剂(y-27632，enzo life sciences，lausen，瑞士)和1％青霉素-链霉素与10％基质胶(matrigel)(corning)]中作为类器官生长。膀胱肿瘤衍生的类器官在补充有5％csfbs(thermo fisher scientific)、10μm y-27632rho抑制剂(sigma)、10ng/ml表皮生长因子(corning)、1％ glutamax(gibco)、1％青霉素-链霉素和10％基质胶的肝细胞钙培养基(corning)[15a]中生长。通过离心收集6×106个细胞，在pbs中清洗以去除基质胶，并在分析前快速冷冻。[0217]hla分型[0218]肿瘤样本(ccrcc和膀胱)的临床hla分型是由欧洲免疫遗传学联合会(efi)认证的芬兰红十字血液服务机构hla实验室进行的。三种典型hla-i基因hla-a、hla-b和hla-c的等位基因测定是根据制造商提供的方案(workflow,gendx,utrecht，荷兰)通过基于定向pcr的下一代序列(ngs)技术进行的。[0219]4视野分辨率水平的等位基因分配由ngsengine版本：2.11.0.11444(gendx,utrecht，荷兰)使用ipd imgt/hla数据库3.33.0版(https://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla)实现。[0220]流式细胞仪分析[0221]使用以下抗体分析hla-a2和hla-a、b和c的细胞表面表达：pe缀合的抗人hla-a2(克隆bb7.2，biolegend 343306，san diego，ca，usa)、pe缀合的抗人hla-a、b和c(克隆w6/32，biolegend 311406，san diego，ca，usa)以及人trustain fcx块(biolegend b247182，san diego,ca,usa)。[0222]使用bdlsr fortessa流式细胞仪获得数据。使用bd accuri 6plus(bd biosciences)对肾细胞癌和膀胱肿瘤衍生的类器官进行流式细胞术分析，并用flowjo软件(tree star,ashland,or,usa)进行分析。[0223]结果[0224]开发异种肽的同源性评价(hex)工具，用于鉴定具有高分子模仿性的病毒和肿瘤衍生的肽[0225]为了研究病毒和肿瘤之间的分子模拟是否会影响肿瘤生长，我们需要鉴定具有高度同源性/亲和力的肽。然而，在这个范围内，缺乏一种工具来促进相关靶标的鉴定。因此，我们开发了hex(异种肽的同源性评价)，这是一种将输入序列与病原体衍生的抗原/肽或蛋白质序列的数据库进行比较的装置，并根据以下三个标准中的至少两个来选择高度同源的候选肽对：1)对应于肽被给定tcr识别的可能性的b分数；2)位置加权比对分数，以优先考虑与tcr相互作用区域的相似性；3)mhc i类结合亲和力的预测(图5a)。在另一种情况下，可以使用传统的软件，如图5b所示，以及如上所述。[0226]我们从三个黑色素瘤相关的抗原开始，这些抗原已经成功地应用于一些接种研究。trp2180-188(酪氨酸酶相关蛋白2)、gp10025-33(又名pmel；黑色素体前蛋白)和tyr1208-216(酪氨酸酶1)。据预测，tyr1208-216不是小鼠mhc的结合物，因此，被认为是“不相关的靶标”。通过hex，我们鉴定了与输入的肿瘤表位有高度同源性/亲和力的病毒肽。每个原始肿瘤表位有4个病毒衍生的肽库(表1)被选中在体内进行进一步评估。[0227]抗病毒免疫力通过与肿瘤抗原的分子模拟控制肿瘤生长[0228]为了评估病毒衍生的肽是否会影响肿瘤生长，我们决定用选定的病毒肽库免疫c57bl6小鼠，然后进行肿瘤移植，以此来模拟病毒感染(图6a)。与模拟相比，所有免疫小鼠的肿瘤生长都有所减少。此外，还观察到治疗组之间的显著差异。用与trp2或gp100同源的肽病毒库免疫的小鼠的肿瘤生长减少最多(图6b)。[0229]为了进一步研究选定的病毒肽对减少肿瘤生长的贡献，我们在终点收集小鼠的脾细胞进行elispot测定(图6c)。与用tyr1同源表位免疫的小鼠的脾细胞相比，用与trp2或gp100同源的病毒肽库免疫的小鼠的脾细胞促进了更高的ifn-γ反应，这与肿瘤生长的结果相关。[0230]我们进一步研究了这些来自病毒预免疫小鼠的脾细胞对其各自的同源肿瘤抗原的反应性(图7a)。当并排比较时，只有与trp2同源的病毒肽与同源的肿瘤肽相比显示出更高的ifn-γ分泌(图7b)。此外，我们回顾性地评估了每种肿瘤抗原及其同源病毒库与c57bl/6j mhc i类分子的亲和力(图7c)，并观察到与它们各自刺激ifn-γ分泌的能力显著相关(图7d)。按照免疫表位数据库(iedb)的指导方针，我们使用50nm的阈值将肽分为高亲和力和低亲和力(http://tools.iedb.org/mhci/help/)，并观察到与低mhc-i亲和力的肽相比，具有高mhc-i亲和力的肽促进了更多inf-γ的产生(图7e)。总之，这些结果验证了hex工具鉴定同源肽的预测效率，并强调病毒和肿瘤之间的分子模仿在交叉反应t细胞的抗肿瘤免疫反应中发挥作用。[0231]与肿瘤表位具有高度相似性的病毒表位可减少体内已建立的黑色素瘤的生长[0232]我们已经证明，病毒和肿瘤抗原之间的分子模拟可以影响预免疫小鼠中的肿瘤生长。接下来，我们想评估分子模拟定向反应是否能对幼稚小鼠中已经建立的肿瘤产生影响。为此，小鼠被植入b16ova肿瘤，或更具侵略性和免疫抑制性的b16f10肿瘤，随后，用先前开发的疫苗平台pepticrad(20)处理来模拟病毒感染(图8a)。简而言之，pepticrad是一种疫苗技术，由包被有mhc-i限制性肽的腺病毒组成，该肽带有正电荷的聚氨基酸物。在这种情况下，我们使用第一次体内实验中最有效的肽库来进行。通过用原始的trp2180-188表位(trp2-pepticrad)或相应的类似于trp2的病毒衍生肽库(病毒pepticrad)包被腺病毒来制备疫苗。对b16ova(图8b-图8c)和b16f10肿瘤(图8e-图8f)而言，与用盐水缓冲液或未包被病毒治疗相比，瘤内注射pepticrad显著减少了肿瘤进展。用原始肿瘤抗原或病毒同源物治疗的小鼠在两种肿瘤模型中都显示出显著较高的反应者数量(图8d，图8g)。在这两种肿瘤模型中，当小鼠接受与肿瘤肽相似的病毒肽治疗时，我们观察到肿瘤生长显著减少，再次表明分子模拟可能在参与交叉反应的t细胞的抗肿瘤免疫中发挥基本作用。[0233]研究cmv和肿瘤抗原之间的分子模仿是否可以解释更好的预后[0234]我们选择了一个黑色素瘤相关的蛋白质库[21]，使用hex将该蛋白质库与cmv蛋白质组进行比较，产生了一个与cmv具有高度相似性的肿瘤肽的列表(表2)。肿瘤肽和它们的cmv对应物被用于elispot测定，显示了在应答患者中，pbmc总是对病毒和它们的对应肿瘤抗原都有反应，这表明cmv感染扩大了病毒t细胞克隆，其可以攻击和杀死肿瘤细胞，使血清阳性患者更容易对与cmv相似的黑色素瘤特异性表位产生反应(图9a，图9b)。虽然很诱人，但这一观察受到了没有直接显示病毒和肿瘤肽是否扩大了相同的t细胞克隆的限制。[0235]基于微流控芯片的新型平台鉴定了稀缺的肿瘤活检组织中的免疫肽组概况[0236]我们对该平台进行了挑战，对稀缺的肿瘤活检进行研究。因此，我们从患者身上收集了卵巢转移性肿瘤(高等级浆液性)，并从肿瘤边缘取了四块(s1、s2、s3和s4)；同时也收集了肿瘤的中心部分(s5)。接下来，对样本进行称重，如图10a所总结的，其大小平均为0.01g至0.06g。样本消化后，得到的单细胞悬液被裂解并通过微芯片处理。应用严格的错误发现率阈值1％进行肽和蛋白质鉴定，在s1、s2、s3、s4和s5中分别鉴定了916、695、172、1128和256条独特的肽(图10a)。与典型的配体组概况相一致，在7-13mer样本中观察到普遍的富集(超过70％)(图10a)。就绝对数量和百分比而言，氨基酸长度分布显示，9mer标本是最具代表性的(图10b)，证实了我们和其他以前的免疫肽组分析。接下来，我们应用基因本体论(go)富集分析进一步研究了在我们的数据中发现的源蛋白。与典型的配体组概况相一致，代谢过程在所有检查的样本中都得到了富集。此外，该分析揭示了皮肤发育途径的蛋白质增加，这与本文分析的卵巢浆液性肿瘤的上皮性质一致。总的来说，这些结果强调了利用所开发的微流控芯片平台分析稀缺的肿瘤活检并获得用于肿瘤治疗的个性化抗原肽的可行性。[0237]基于微芯片的方案揭示了患者衍生的类器官中的免疫肽组景观[0238]微芯片技术面临的挑战是来自患者衍生的类器官(pdo)的少至6×106个细胞。我们从正在进行的泌尿系统癌症精准医学研究中选择了两名患者，一个是包含来自透明细胞肾细胞癌(ccrcc)患者的良性和癌症组织的肾切除样本，另一个是来自膀胱癌患者的1x1 cm样本，被进一步处理为3d原始类器官培养。[0239]通过应用开发的微芯片技术和严格的假发现率阈值1％进行肽和蛋白质鉴定，我们能够在ccrcc和膀胱pdo中分别鉴定出总共576和2089条独特的肽(图11a)。检索到的肽的数量在两个样本之间有所不同，膀胱样本产生的肽比ccrcc样本多。众所周知，hla的表达会影响分离出的hla-i肽的数量[22a]，与此相一致，流式细胞仪分析显示我们的膀胱样本中hla-a、hla-b和hla-c的表面水平高于我们的ccrcc样本，解释了我们样本中检索到的肽的不同产量。肽的分析显示出对9-12mer的偏好(ccrcc为56.4％，膀胱肿瘤为47.9％)，在9mer群体中富集，这与配体组分析[33]的典型长度分布相一致(图11b)。为了区分hla-i结合物和污染物，进行了吉布斯聚类和netmhc4.0分析。首先，9mer的去卷积显示，膀胱和ccrcc pdo中分别有55％和67％与患者的hla等位基因的至少一个相匹配。接下来，netmhc4.0被应用于我们的数据集中鉴定的所有9mer。其中，46％和69％被预测为患者特定hla的结合物。接下来，研究了存在于我们的两个数据集中的源蛋白。为此，进行了基因本体论(go)富集分析。与我们以前的观察和已发表的数据一致，两个样本都显示了与rna相互作用并参与分解/代谢过程的细胞内和细胞核蛋白的富集。[0240]为了证明该技术可被用于快速开发治疗性癌症疫苗，我们建立了一个杀伤性测定。我们的分析集中在ccrcc样本上。我们使用转录组学水平来选择推定的肿瘤抗原，使用pbmc和健康肾脏组织作为参考集。接下来，用选定的肽对健康志愿者的pbmc进行脉冲，并将从这些细胞中分离出来的cd8+t细胞用于测定。用肽evaqpgpsnr(基因名称hspg2)脉冲的t细胞显示出大约10％的特异性细胞溶解。[0241]最后，我们试图研究ccrcc患者的回忆性t细胞反应。为此，用肽evaqpgpsnr体外刺激来自患者的未分级的pbmc，而采用未刺激的pbmc作为对照。然后将衍生的cd8+t细胞加入ccrcc pdo中，与对照组相比，杀伤活性增加了约7％。[0242]源自患者类器官的肽在体内研究中被证明具有治疗效果[0243]用hex对肽列表进行了分析。首先，该软件优先考虑同时具有强结合力(根据netmhc4.0，ic50的截止值范围为50nm-500nm)和显示较高加权排列分数(截止值为0.8-1的归一化加权排列分数)的肽。后者将肽的相似性集中在最有可能与cd8+t细胞的tcr接合的相互作用区域，以诱发介导的免疫反应；然后根据其与病原体衍生的抗原/肽的总体同一性百分比和ic50结合亲和力分数，对所得的肽进行进一步分类。最终的结果由13个多肽与它们对应的致病性多肽组成(表4)。[0244]为了确定多肽的免疫原性，通过在佐剂poly(i:c)的存在下皮下注射每种单一的肽，对小鼠进行预免疫；一组小鼠单独注射poly(i:c)或生理盐水作为对照。收获这些小鼠的脾细胞，并在elispot测定中测试特定刺激下的ifnγ产生(表5)。[0245]然后，我们试图验证候选多肽是否可以作为癌症疫苗用于治疗已建立的肿瘤。为此，我们采用了pepticrad，即我们以前开发的癌症疫苗平台，该平台将溶瘤腺病毒与(通过聚赖氨酸接头)连接的聚赖氨酸修饰的衣壳结合起来。这里使用的腺病毒是valo-md901，即经过基因修饰以表达小鼠ox40l和cd40l，并且先前证明在小鼠黑色素瘤模型中引起肿瘤生长控制和全身性抗肿瘤反应。因此，在balb/c小鼠的左、右侧皮下注射同系肿瘤模型ct26(第0天，图12a)。当肿瘤建立后(第7天，图12a)，用我们列表中的每一对聚赖氨酸修饰的肽(pepticrad1、pepticrad2、pepticrad3，表6)包被valo-md901，只在右侧肿瘤内进行瘤内注射。pepticrad4由包被有gp70423-431(ah1-5)的valo-md901组成。模拟组和valo-md901组也被用作对照。pepticrad1和pepticrad2以及valo-md901改善了注射病灶中的肿瘤生长控制，(图12b，右侧图)。有利的是，pepticrad1改善了未治疗的肿瘤的抗肿瘤生长控制，而valo-md901则没有引发效果。[0246]总结[0247]hex是一种生物信息学工具，它可以分析多肽序列，并将其与病原体衍生的病毒蛋白质组的策划数据库进行比较，以寻找具有高度相似性的序列。[0248]由于提出的肽主要参与与mhc的锚定残基的相互作用[25]，我们的软件返回一个排列分数，该分数是按位置加权的，以优先考虑发生在肽中心部分的相似性，也就是最参与与tcr相互作用的位置[26]。此外，为了增加我们的靶标是提出的表位的机会，我们根据对所选mhc的结合亲和力对所得到的肽进行排序，在一个实例中，使用iedb netmhc预测工具api[27]；或netmhc4.0或netmhcpan4.1b作为单独的工具。[0249]我们使用hex来鉴定与三种广泛表征的肿瘤相关抗原同源的病毒肽。[0250]我们发现，用我们选择的病毒肽库进行预免疫，在肿瘤建立之前模拟了一种抗病毒免疫状态，并有效地减缓了小鼠皮下注射的黑色素瘤细胞的生长，这表明预先暴露于病毒衍生的肽可以影响肿瘤生长。[0251]接下来，我们观察到，在肿瘤发展过程中施用时，肿瘤同源病毒衍生的肽对已经建立的肿瘤有相似的效果，表明在肿瘤发展过程中发生的病毒感染仍然可以影响其生长。[0252]综上所述，我们的结果表明，病毒衍生的抗原和肿瘤衍生的抗原之间的分子模拟能够对肿瘤生长产生控制作用，即使不依靠预先暴露或预先获得的免疫力。[0253]与其他常用的疗法(如放疗和化疗)相比，新型icpi显著改善了几种实体瘤(尤其是转移性黑色素瘤)的患者生存率。然而，尽管生存率和有效反应率得到了改善，但尚不清楚为什么有些患者不能从icpi疗法中获益。我们的结果表明，具有高滴度的cmv特异性igg水平的患者的无进展生存期明显延长。[0254]我们观察到，具有高抗cmv-igg滴度的患者的pbmc与黑色素瘤抗原的反应类似于cmv肽。这一数据表明cmv血清阳性有助于黑色素瘤特异性t细胞免疫，从而为这些接受icpi疗法的患者提供临床优势。[0255]这里我们显示，病毒感染可能对肿瘤生长和清除产生影响。此外，我们显示了细胞毒性t细胞对使用hex选择的病毒衍生抗原和同源肿瘤衍生抗原的交叉反应性。基于我们的结果，我们得出结论，分子模拟现象在未来可以被利用来开发新的疗法，或者当与免疫疗法一起使用时，有可能增强这些疗法所达到的抗肿瘤免疫效果。[0256]此外，设计有效的肿瘤排斥和保护策略需要可靠地鉴定与hla-i结合的肿瘤肽。直接从hla-i复合物鉴定多肽仍然是最好的方法。然而，免疫肽组学的工作流程相对复杂，因此是抗原发现过程中的一个主要瓶颈。目前，传统平台中无法分析少量生物材料(如组织针头活检)的免疫肽组、样本通量、成本和采用的亲和基质(其生产既费力又昂贵)被描绘成需要解决的主要技术挑战。[0257]在这项工作中，我们解决了阻碍配体组研究的几个技术问题，主要集中在分析材料的有限可用性、消耗品的成本和冗长的方案上。[0258]通过利用良好表征的生物素-链霉亲和素相互作用来将生物素化的泛hla抗体固定在链霉亲和素功能化的表面上，我们能够基于通过交联反应制备的亲和基质以及微芯片平台来取代传统的技术。材料(如针头活检)的匮乏所带来的局限性激发了我们对实施微流控方案的工作。在这项工作中，我们采用了定制的微芯片方案，其涉及基于硫醇-烯聚合物的微柱阵列作为进一步生物功能化的固体支撑物，使整个ip程序在单个微流控芯片上执行。[0259]在体外杀伤测定中对鉴定的多肽进行验证，证实了实施本发明时鉴定的肽确实存在于jy细胞表面，因为它们是以特定的cd8+t细胞依赖性方式被杀死。在我们的数据集中发现的肽ildkkvekv(seq id no:3)引起了较高比例的特异性细胞溶解。[0260]因此，我们的方法为免疫亲和纯化提供了一个尚未开发的工具。[0261]参考文献[0262]20.c.capasso,m.hirvinen,m.garofalo,d.romaniuk,l.kuryk,t.sarvela,a.vitale,m.antopolsky,a.magarkar,t.viitala,t.suutari,a.bunker,m.yliperttula,a.urtti,v.cerullo,oncolytic adenoviruses coated with mhc-i tumor epitopes increase the antitumor immunity and efficacy against melanoma,oncoimmunology 5,e1105429(2016).[0263]21.d.weinstein,j.leininger,c.hamby,b.safai,weinstein 2014 diagnostic and prognostic biomarkers in melanoma,j.clin.aesthet.dermatol.7,13–24(2014).[0264]25.j.sidney,e.assarsson,c.moore,s.ngo,c.pinilla,a.sette,b.peters,quantitative peptide binding motifs for 19 human and mouse mhc class i molecules derived using positional scanning combinatorial peptide libraries,immunome res.4,2(2008).[0265]26.a.k.sharma,j.j.kuhns,s.yan,r.h.friedline,b.long,r.tisch,e.j.collins,class i major histocompatibility complex anchor substitutions alter the conformation of t cell receptor 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