阳离子脂质体共载7-O-香叶基槲皮素及IGF-1R-siRNA对乳腺癌细胞MDA

　　摘要

　　目的：以肽头部阳离子脂质体CDO14为载体，构建荷载7-O-香叶基槲皮素(GQ)和IGF-1R-siRNA（siIGF）的纳米共转运系统CDO14/GQ-siIGF，考察其体外抗乳腺癌细胞MDA-MB-231作用。

　　方法：（1）用阳离子脂质体CDO14包载GQ构建载药脂质体CDO14/GQ，将脂质体CDO14及CDO14/GQ分别与siIGF复合，构建基因复合物CDO14-siIGF及共转运系统CDO14/GQ-siIGF；采用激光粒度仪检测基因复合物、载药脂质体和共转运系统的粒径及Zeta电位；（2）采用CCK-8法检测载药脂质体、基因复合物及共转运系统对人乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖的影响；采用AO/EB和AV/PI染色法检测载药脂质体、基因复合物及共转运系统对人乳腺癌细胞MDA-MB-231的促凋亡作用；采用Western blot法考察载药脂质体、基因复合物及共转运系统对人乳腺癌MDA-MB-231细胞中IGF-1R蛋白以及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3表达的影响。

　　结果：（1）所构建的载药脂质体、基因复合物及共转运系统的粒径均在100~200 nm之间；空白脂质体及载药脂质体的Zeta电位在40-50mV之间，与siIGF复合后降至30 mV左右。（2）CCK-8法检测表明，siIGF和GQ均能抑制人乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖，二者合用后抑制作用增强；AO/EB和AV/PI染色结果表明，siIGF和GQ均能促进人乳腺癌细胞MDA-MB-231凋亡，二者合用后促凋亡作用增强；Western blot分析表明，CDO14/GQ-siIGF能下调IGF-1R蛋白表达，上调促凋亡蛋白Bax和Caspase-3的表达，下调抑凋亡蛋白Bcl-2的表达，作用强于单用CDO14/GQ或CDO14-siIGF。

　　结论：纳米共转运系统CDO14/GQ-siIGF荷载的GQ与siIGF具有协同抗乳腺癌作用。

　　关键词：乳腺癌 7-O-香叶基槲皮素 siIGF纳米共转运系统 脂质体

　　前言

　　近些年来，由于我国工业化程度的不断加深、人口老龄化的日益严重、生活环境愈发恶劣以及不健康的现代生活方式，中国居民患癌率逐年上升。根据最新的统计数据，癌症已经成为威胁中国居民生命健康的主要疾病之一。其中乳腺癌发病率是所有类型癌症的前五名，女性发病的首位，而且乳腺癌致死约占女性全部死因的五分之一[1]。

　　乳腺癌源于乳腺的腺上皮组织细胞的癌变，而且乳腺癌细胞非常松散，容易脱落并随着血管或者淋巴管播散至全身，对生命造成巨大威胁。目前针对乳腺癌的治疗，一般是根据患者的身体条件和癌细胞的发展程度，酌情采取手术切除、放疗这类局部疗法或化疗这种全身疗法。但是这些传统的疗法存在较大的局限性，比如化疗会造成比较严重的全身毒性，而且容易使癌细胞产生抗药性，严重影响治疗效果。基因治疗具有高疗效、强靶向作用和低毒性的特点，是一种极具潜力的治疗乳腺癌的手段。

　　基因治疗是通过基因载体将治疗基因传递到靶细胞，然后通过治疗基因作用于靶点基因，起到治疗的效果。基因沉默是基因治疗的一种常见的手段，它通过将小干扰RNA(small interference RNA, siRNA)传递到靶细胞，与靶mRNA结合成双链RNA，然后被RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex,RISC）水解，从而抑制靶细胞内靶基因的表达，达到治疗目的[2,3]。因为RNA具有很高的特异性，所以基因沉默有效的避免了全身毒性，且具有很高的疗效，远远优于传统的化疗[4-6]。但是RNA在人体中很容易被降解，这一缺陷导致该疗法很难用于临床，而开发一种高效、靶向的基因载体是解决这一问题的重要方法。

　　胰岛素样生长因子（Insulin-like growth factors, IGFs）信息系统能够调控细胞的增殖、分化、成熟和凋亡[7,8]。IGFs信息系统由IGFs，胰岛素样生长因子受体（Insulin-like growth factor 1, 2 receptor,IGF-1R, IGF-2R）和胰岛素样生长因子结合蛋白（Insulin-like growth factor-binding proteins, IGFBP）这三部分组成。该系统对机体的调控机制是在IGFBP的调控下，不同类型的IGFs与IGFs受体结合，释放不同信号，诱导下游细胞进行增殖、迁移、凋亡等活动[9]。据已有研究表明，IGFs信息系统与癌症的产生和发展有着密切联系，因此IGFs系统是基因治疗的理想靶点[10,11]。利用IGFs系统作为靶点治疗癌症有三种方式，分别是抑制IGFs的产生、抑制IGFs受体的活性、调节IGFBP的功能。

　　阳离子脂质体（cationic lipsome）是目前应用最多的非病毒基因载体，具有易制备、低毒性、易代谢、不易引发免疫排斥、转染效率高的优点[12]。其基本结构类似于磷脂双分子层，并带有正电荷，能够与靶基因上的负电荷作用，可以延长治疗基因或药物在体内的存留时间，提高治疗效果。本研究中使用本课题组自主开发的肽头部阳离子脂质体CDO14，前期研究证明，这种阳离子脂质体比市面上的商品脂质体更加高效、安全、毒副作用小[13,14]。

　　槲皮素是一种广泛分布于植物体内的类黄酮复合物，具有抗炎、抗过敏、抗菌、抗病毒、保护心脑血管等多种效用，而且有研究表明，槲皮素是已知的最强抗癌药物之一，在极低的浓度就能够抑制癌细胞的增殖[15-17]。7-O-香叶基槲皮素(7-O-geranylquercetin, GQ)是本课题组自主研发的一种槲皮素的氧烃化衍生物。根据之前研究结果，发现相比于槲皮素，该衍生物的脂溶性更好，抗癌效果更明显[19]。

　　综合疗法是癌症治疗的一个重要治疗手段，基因治疗与化疗联用以提高治疗效果是当前研究的热点。本研究以自主开发的肽头部阳离子脂质体CDO14为载体，负载抗肿瘤药物7-O-香叶基槲皮素和IGF-1R-siRNA，构建纳米共载药系统，并研究该系统对人乳腺癌MDA-MB-231细胞的体外抗肿瘤效果，以期开发一种治疗乳腺癌的有效手段，并为肿瘤的协同疗法开拓思路。

　　一、材料

　　1.1细胞株

　　人乳腺癌MDA-MB-231细胞，购于中科院上海细胞生物学研究所。

　　1.2药品及主要试剂

　　肽型阳离子类脂质CDO14、7-O-香叶基槲皮素为本实验室自主设计、合成，结构经质谱和核磁共振鉴定；经过柱层析、重结晶等方法纯化，经过HPLC测定，纯度大于98%。

　　DMEM培养基：Gibco，美国

　　胎牛血清：Gibco，美国

　　二甲亚砜(DMSO)：Solarbio，西班牙

　　胰酶：Gibco，美国

　　PBS：中杉金桥，北京

　　Cell Counting Kit-8 （CCK-8）：biotool，中国

　　AO/EB双染试剂盒，Solarbio，北京

　　Annexiin V-FITC凋亡试剂盒：三箭生物，天津

　　甲醇（色谱纯）：TEDIA，美国

　　siRNA：Invitrogen，美国

　　96孔细胞培养板、24孔细胞培养板购自中国Nest Biotechnology公司

　　RIPI裂解液（强）：碧云天，上海

　　BCA蛋白浓度测定试剂盒：碧云天，上海

　　2×loading buffer：Takara，日本

　　丙烯酰胺：Solarbio，北京

　　SDS：Solarbio，北京

　　过硫酸铵：Solarbio，北京

　　TEMED：Sigma，美国

　　Tris：Solarbio，北京

　　ECL化学发光自显影试剂盒：碧云天，上海

　　兔抗人IGF抗体：Proteintech，美国

　　兔抗人Bcl-2抗体：Proteintech，美国

　　兔抗人Caspase-3抗体：Proteintech，美国

　　兔抗人Bax抗体：Proteintech，美国

　　兔抗人actin抗体：Proteintech，美国

　　HRP-羊抗兔IgG抗体：Proteintech，美国

　　彩虹Marker：Thermo，美国

　　脱脂奶粉：BD，美国

　　1.3实验仪器

　　1.4所需溶液

　　1.4.1 PBS缓冲液（pH 7.2）

　　NaCl 8.00 g，KCl 0.20 g，Na2HPO4·12H2O 3.58 g，KH2PO40.27 g，溶解于0.8 L三蒸水中，调pH值至7.2，定容至1 L。121 ℃高压灭菌30 min，4 ℃保存。

　　1.4.2胰蛋白酶的配置

　　精密称取0.25 g胰蛋白酶粉末和0.02 g EDTA-2Na，用PBS缓冲液充分溶解并定容至100 mL，用0.22 μm微孔滤膜滤过除菌，无菌分装后至4 ℃冰箱保存。

　　二、实验方法

　　2.1siRNA的合成

　　siRNA由上海吉马公司合成。IGF-1R-siRNA以下简称siIGF，阴性对照siRNA以下简称siN.C（此序列不与人类基因序列同源），序列见表1。

　　表1 siRNA的序列

　　2.2共载药系统的构建

　　2.2.1CDO14/GQ载药脂质体的构建

　　称取GQ 0.1 mg、类脂CDO14 1 mg 、10 mg/mLDOPE 80.4μL和甲醇1 mL混匀，用旋转蒸发仪蒸发5-10 min，取1 mL三蒸水水化。储存于冰箱4 ℃，备用。

　　2.2.2纳米共转运系统的构建

　　将载药脂质体CDO14/GQ经超声处理后取25μL加入无血清培养基至体积达500μL，混匀，即得到脂质体稀释液；取siIGF 1 μg/μL母液1μL，加入无血清培养基至体积达500μL，混匀，即得到siIGF稀释液；最后将siIGF稀释液缓慢加入脂质体稀释液中，混匀并避免出现沉淀，混合液室温静置20 min，形成脂质体基因复合物。

　　2.3脂质体及共转运系统的物理性质表征

　　用激光散射粒度仪，于25 ℃，光散射角度90°条件下检测制备的载药脂质体的粒径及Zeta电位。具体实验步骤如下：打开仪器和软件，让仪器预热30 min，载药脂质体超声10 min，用移液枪取20 μL制备的载药脂质体稀释于1 mL三蒸水中，分别检测粒径和Zeta电位。

　　2.4细胞培养

　　将人乳腺癌MDA-MB-231细胞接种于装有含10%胎牛血清的DMEM培养基的细胞培养瓶中，于37 ℃、5% CO2、100%湿度的培养箱中培养24 h。待细胞生长至单层汇合时，吸取并弃去细胞培养液，用已经于37 ℃水浴中预热的PBS洗2遍，用0.25%胰蛋白酶（含0.02% EDTA）消化，适时吸弃胰蛋白酶，待所有细胞收缩呈圆形时，立即加入培养基以终止胰酶的消化作用。后反复轻轻吹打，以制成细胞悬液，1200 rpm离心5 min，弃上清，重悬后按适当的比例传到新的培养瓶中继续培养。

　　2.5肿瘤细胞增殖测定

　　取人乳腺癌MDA-MB-231细胞，以4000-5000个细胞/孔的密度接种于96孔板中，使每孔最终细胞悬液体积为100 μL。将细胞培养于37 ℃、5% CO2、100%湿度的培养箱中，孵育18-22h后使细胞密度达到约50%。用脂质体CDO14荷载siIGF，其中CDO14：siIGF=25：1，使CDO14与siIGF复合，室温下静置20 min，形成复合物。设置空白组、Control组、CDO14-siN.C组、CDO14-siIGF组、CDO14/GQ组及CDO14/GQ-siIGF组，每组6个复孔。每孔中siIGF用量为0.1μg，CDO14用量为2.5 μg，GQ终浓度为5 μM。给药后的培养板置于37 ℃、5% CO2、100%湿度的培养箱中继续培养24 h。然后用CCK-8法进行细胞增殖测定。用在37 ℃水浴下预热后的PBS洗涤细胞培养板3次，每次100 μL。在避光条件下每孔加入空白培养基100 μL和CCK-8溶液10 μL，再继续在CO2培养箱中孵育1-2 h。后用酶标仪测定450 nm下的吸光度，利用OD值计算出细胞增殖率（（ODtreatment-OD空白）/(ODcontrol-OD空白)×100%）。

　　2.6 AO/EB双染法色检测凋亡

　　将人乳腺癌MDA-MB-231细胞以2-3×104个/孔的密度接种于24孔细胞培养板中，使每孔最终细胞悬液体积达1 mL。将细胞于37 ℃、5% CO2、100%湿度的培养箱中培养24 h后，分别加入不同药物，设置Control组、CDO14-siN.C组、CDO14/GQ组、CDO14-siIGF组和CDO14/GQ-siIGF组。再于CO2培养箱中培养24 h，去掉培养基，用已于37 ℃水浴预热的PBS洗2遍，按照1 mL PBS中加入20 μL工作液的比例配制染色液，再每孔加入500 μL前述染色液，室温放置2-5 min后于荧光显微镜下观察。

　　2.7 AV/PI双染法检测细胞凋亡

　　将人乳腺癌MDA-MB-231细胞以0.5-2×105个/孔（每孔细胞悬液2mL）的密度接种于6孔板，孵育培养24 h。设置Control组、CDO14-siN.C组、CDO14/GQ组、CDO14-siIGF组和CDO14/GQ-siIGF组。按照分组加药处理细胞，每孔中siIGF用量为2μg，CDO14用量为50 μg，GQ终浓度为5 μM。培养24 h后用PBS清洗一遍，加入适量0.25%胰酶消化液，1200 rpm离心5min，弃上清，收集细胞。将收集的细胞重悬于500 μL结合缓冲液，加入5 μL Annexin V，于室温下避光孵育10min后加入5 μL PI，避光室温孵育5 min，加入500 μL PBS，使用流式细胞仪1h内检测。

　　2.8 Western blot检测蛋白

　　2.8.1蛋白的提取

　　将人乳腺癌MDA-MB-231细胞以0.5-2×105个/孔（每孔细胞悬液2mL）的密度接种于6孔板，孵育培养24 h。设置Control组、CDO14-siN.C组、CDO14/GQ组、CDO14-siIGF组和CDO14/GQ-siIGF组。按照分组加药处理细胞，每孔中siIGF用量为2μg，CDO14用量为50 μg，GQ终浓度为5 μM。将6孔培养板放置于培养箱中继续培养24 h。弃去上清培养基，用PBS液洗涤细胞3遍。每孔加入1 mL的PBS，用细胞刮棒刮下细胞并收集于1.5 mL EP管中，1000 rpm离心5 min，弃上清，每EP管加入100 μL裂解液(含1% PMSF)，冰上裂解20 min，每5 min将EP管中混合物进行混匀震荡，裂解完毕后于12000 rpm、4 ℃离心5 min，吸出细胞上清液，并移入另一个EP管中放置于-80 ℃冰箱保存备用。

　　2.8.2蛋白定量

　　用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定提取的蛋白浓度。然后根据测定结果将各组蛋白浓度调整至实验所需的同一浓度备用。

　　2.8.3蛋白样品的处理

　　取调整浓度后的蛋白样品，分别加入适量的2×Loading buffer，等体积稀释至1×Loading buffer。置于沸水浴中，100 ℃加热5 min使其变性，冷却至室温后于-20 ℃保存。

　　2.8.4电泳及转膜

　　根据目标蛋白分子量配制适宜比例的SDS-PAGE分离胶，并制备5%的浓缩胶，待胶凝后加电泳缓冲液，用准备好的蛋白样品进行上样，保证每孔上样量、上样浓度均相同。蛋白通过浓缩胶层时使用电压为80 V，分离胶层电压120 V，直到溴酚蓝指示剂到达分离胶层的底部，停止电泳。根据相应分子量的蛋白Marker切取所需蛋白所在位置的凝胶，并剪取与凝胶大小相同的PVDF膜。PVDF膜放入甲醇中活化10s后再放入转膜缓冲液中浸润1 min。在转膜仪的阳极一侧按顺序依次放入海绵垫、3张滤纸、PVDF膜、凝胶、3张滤纸、海绵垫，标记PVDF膜以了解蛋白顺序，尽量排除气泡，采用湿转法转膜。

　　2.8.5 Western blot抗体孵育

　　转膜完成后，取出PVDF膜，首先用5%的脱脂奶粉对PVDF膜进行封闭。在室温下置于摇床慢摇封闭2 h。封闭后取出PVDF膜用TBST缓冲液清洗，之后将PVDF膜孵育特定一抗，4℃孵育过夜；次日，将PVDF膜从一抗中取出，用TBST洗膜3次，每次10 min，之后弃去TBST。将PVDF膜孵育至相对应的二抗中，室温下置于摇床慢摇2 h。之后，将PVDF膜从二抗中取出，继续用TBST洗膜3次，每次10 min，之后弃去TBST。

　　表2蛋白的名称、分子量、分离胶浓度、转膜时间及抗体稀释比例

　　2.8.6显影

　　使用ECL发光液，按照ECL试剂盒的说明书操作，进行显色反应。取适量A液和B液1：1充分混匀，制备成显影工作液。首先将PVDF膜放置于凝胶成像仪中，在PVDF膜上均匀滴加显影工作液，保证显影液均匀的覆盖在整个膜上，开始显影，曝光时间约为30 s~2 min，并于分析软件中进行灰度分析，以actin作为对照校正系统误差后，作为蛋白表达的相对水平。

　　三、结果

　　3.1载药脂质体及纳米共转运系统的粒径及Zeta电位

　　载药脂质体CDO14/GQ、CDO14与siN.C形成的复合物、CDO14与siIGF形成的复合物、CDO14/GQ与siIGF形成的复合物的粒径均在100-200 nm之间。载药脂质体CDO14/GQ的Zeta电位在40-50 mV之间，CDO14与CDO14/GQ分别与siIGF形成的复合物及共转运系统的Zeta电位在30 mV左右。由于脂质体带正电荷，荷载带负电荷的siIGF后Zeta电位下降。

　　表2 载药脂质体及共转运系统的粒径及zeta电位

　　3.2载药脂质体及共转运系统对细胞的增殖抑制作用

　　各载药系统作用于人乳腺癌MDA-MB-231细胞24 h后，用CCK-8法检测其增殖率。如图1所示，CDO14-siN.C对细胞存活无明显影响；CDO14-siIGF及CDO14/GQ对细胞增殖有一定抑制作用；CDO14-siIGF与GQ共载给药后明显抑制细胞增殖。结果表明，脂质体CDO14能荷载GQ或siIGF进入细胞，并且GQ和siIGF能抑制MDA-MB-231细胞增殖，以CDO14共载GQ和siIGF具有协同抑制作用。

　　

　　图1 载药脂质体及共转运系统对MDA-MB-231细胞增殖的影响

　　与Control组比较**p<0.01

　　3.3载药脂质体及共转运系统对细胞形态的影响

　　人乳腺癌MDA-MB-231细胞经AO/EB染色后在倒置荧光显微镜下观察，由图2可见，仅给予CDO14-siN.C与Control组相比没有明显差别，仍呈现明亮绿色荧光；单独给予CDO14-siIGF或CDO14/GQ后细胞数减少，部分细胞呈橘黄色荧光；CDO14/GQ-siIGF共载给药时，与单独荷载GQ或siIGF相比，细胞凋亡更加明显，呈橘黄色荧光的细胞数增加。实验证明细胞在siIGF、GQ以及二者联合作用下产生了凋亡，联合给药增强了促凋亡作用。

　　

　　图2 载药脂质体及共转运系统对MDA-MB-231细胞形态的影响

　　3.4载药脂质体及共转运系统的促细胞凋亡作用

　　本实验采用流式细胞仪检测载药脂质体及共转运系统对人乳腺癌MDA-MB-231细胞的促凋亡作用。由图3可见，仅给予CDO14-siN.C与Control组相比没有明显差别；单独给予CDO14-siIGF或CDO14/GQ后细胞凋亡数增加；CDO14/GQ-siIGF共载给药时，与单独荷载GQ或siIGF相比，细胞凋亡更加明显。实验证明细胞在siIGF、GQ以及二者联合作用下产生了凋亡，联合给药增强了促凋亡作用。

　　

　　图3 载药脂质体及共转运系对MDA-MB-231细胞的促凋亡作用

　　与Control组比较**p < 0.01

　　3.5载药脂质体及共转运系统对细胞中IGF-1R及相关凋亡蛋白表达的影响

　　本实验采用蛋白印迹法考察了GQ与siIGF共载给药对人乳腺癌MDA-MB-231细胞中IGF-1R蛋白及凋亡相关蛋白表达的影响。结果如图4所示，细胞经CDO14-siIGF、CDO14/GQ及CDO14/GQ-siIGF作用24h后，均可使Bcl-2表达下调，Caspase-3、Bax表达上调，其中共转运系统较CDO14/GQ或CDO14-siIGF单独作用增强；CDO14/GQ、CDO14-siIGF、CDO14/GQ-siIGF作用细胞24 h后均可下调IGF-1R蛋白表达。

　　

　　图4 载药脂质体及共载药系统对MDA-MB-231细胞中IGF-1R及相关凋亡蛋白表达的影响

　　与Control组比较**p < 0.01

　　四、讨论

　　基因治疗是一种极具潜力的癌症治疗手段，但是目前的实际疗效仍然有限。将化学疗法与基因治疗联用，开发出一种协同抗癌系统，既可减少化疗用药的剂量，降低化疗的全身毒副作用及抗药性，也可以达到治疗的效果[20]。本研究以自主开发的肽头部阳离子脂质体CDO14为载体，负载抗肿瘤药物GQ和siIGF，构建纳米共载药系统，而且研究发现对乳腺癌有良好的治疗作用。

　　目前，常用的阳离子脂质体有DOTAP和lipofectamine2000。两者都是优良的基因治疗载体，但是均存在一定缺陷，如DOTAP转染的效率相对较低，lipofectamine2000细胞毒性较大。本研究中使用的CDO14是本课题组自主开发出的脂质体，其转染效率与lipofectamine2000相近，而毒性比DOTAP还低，性能远远高于上述常用脂质体[14,21]。

　　本课题组前期的研究发现，CDO14递送的GQ能有效抑制非小细胞肺癌A549和NCI-H1975细胞的增殖，并促进其凋亡，也能对乳腺癌MCF-7细胞发挥促凋亡作用[19,22]。还发现负载survivin siRNA或IL-10 siRNA与GQ的CDO14共载药系统对乳腺癌细胞也有明显的抑制增殖和促凋亡作用,且作用强于脂质体单独递送GQ、survivin siRNA或IL-10 siRNA[23]。IGF-1R与癌细胞的增殖、转移、凋亡有着密切联系，是十分理想的基因治疗靶点。本研究发现CDO14/GQ-siIGF共转运系统对人乳腺癌MDA-MB-231细胞也存在促凋亡作用。

　　载药脂质体的粒径、Zeta电位、稳定性、生物活性等性质与脂质体和被负载药物的质量比有着密切关系。课题组之前的研究结果表明，当siIGF与阳离子脂质体CDO14的质量比为1：3时，转染人乳腺癌MCF-7细胞的效率最高。当阳离子脂质体CDO14与GQ质量比为10：1时，脂质体的包封率和负载GQ后的形态最好。基于之前的结果，本研究通过预实验重新确定制备载药脂质体的最佳质量比，发现当siIGF和CDO14/GQ的质量比为1：25时，转染效率和GQ载药量较好且没有明显的毒性。

　　本实验只初步研究了CDO14/GQ-siIGF共转运系统在体外对人乳腺癌MDA-MB-231细胞活性的影响、促凋亡作用以及相关蛋白的影响，其深入的分子机制及体内作用还有待进一步研究。

　　五、结论

　　1.成功构建了以阳离子脂质体CDO14为载体，共载化学药物GQ和基因siIGF的纳米共转运系统CDO14/GQ-siIGF。

　　2.共转运系统CDO14/GQ-siIGF能够抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖，促进其凋亡；其作用强于脂质体单独递送GQ或siIGF；GQ和siIGF具有协同抗肿瘤作用。

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　　肿瘤基因治疗的研究进展

　　随着人类平均寿命的延长，恶性肿瘤对人类生命的威胁愈发突出。传统治疗手段包括手术切除，化疗，放疗及综合疗法。传统疗法存在疗效差，易复发，对病人伤害大等缺陷。在过去的几十年里，随着基因技术的发展，基因治疗有望成为肿瘤的一线治疗方案。相对于传统疗法，基因治疗具有高效性，特异性，低脱靶毒性等优点。在基因治疗的各种载体中，纳米颗粒因其优异的性能（低毒，可控，高效，多功能）而受到广泛关注。本文综述了基因治疗和基因治疗载体的发展概况，并重点介绍了纳米颗粒在肿瘤基因治疗中的设计和应用的最新进展，挑战和展望。

　　1.肿瘤基因治疗概况

　　根据最新的统计数据显示，恶性肿瘤死亡占居民全部死因的23.91％，恶性肿瘤已经成为严重威胁中国居民健康的主要公共卫生问题之一。近十几年来，恶性肿瘤的发病率、死亡率均呈持续上升趋势，每年恶性肿瘤所致的医疗花费超过2200亿，防控形势严峻。近些年来，肿瘤的治疗手段进步了很多，但效果仍然有限[1]。即使是在前期能进行有效治疗的前列腺癌和乳腺癌，也很容易复发并表现出极强的抗药性。化疗虽然控制比以前更好，但是其引起的毒性依然会造成恶心、口腔溃疡和认知障碍等副作用。相同地，放疗也会导致腹泻、粘膜炎、皮肤毒性和口干等副作用。同时，长期的化疗或放疗可能会诱导其他类型的癌症的产生[2]。因此，大量的研究工作致力于开发新的治疗方法，以提高疗效和减少脱靶毒性。

　　所谓基因治疗就是将特异性的外源基因负载到基因载体上，导入靶细胞中，然后通过外源基因的表达、抑制、校正、替代或补偿病变基因，以达到治疗的目的。1990年，美国食品和药物管理局(FDA)批准的第一项基因治疗研究，治愈了一个患有腺苷脱氨酶缺乏症的四岁女孩[3]。自此，基因治疗成为研究的热点，而且大部分基因治疗试验都是针对实体和血液恶性肿瘤的治疗。迄今为止，有多例慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、脑癌和其他的肿瘤的基因治疗的成功试验已被报道，然而却只有少数基因治疗产品能在临床得到应用。这些案例表明，基因治疗虽然在肿瘤治疗方面具有很好的前景，但是它们的临床应用依然饱受限制[4]。其根本原因在于目前的基因治疗还存在药效和药代动力学差、靶点特异性差、全身给药毒性大的缺点，而基因治疗载体的发展是解决这些问题的重要途径。

　　纳米颗粒，粒径一般为1-1000 nm，可以由多种材料合成，具有良好的生物相容性，对细胞的生长和代谢没有明显的影响。并且可以通过设计特定结构的纳米分子，实现对肿瘤的靶向，提高基因传递效能[5]。纳米颗粒能够改善基因治疗的药代动力学、提高对肿瘤靶向能力、携带多个治疗基因，是一种具有极大潜力的基因治疗载体。

　　2.肿瘤基因治疗方法

　　2.1自杀基因治疗

　　自杀基因治疗是各种基因治疗方法中疗效较好，发展前景较大的方法，也称为分子疗法。自杀基因治疗的作用机制是通过自杀基因表达，产生治疗性蛋白或将无毒化合物转化为有毒药物，杀死肿瘤细胞，从而达到治疗肿瘤的目的。在已报道自杀基因系统中，腺病毒介导单纯疱疹病毒胸苷激酶基因/丙氧鸟苷(HSV-tk/GCV)，胞嘧啶脱氨酶基因/5-氟胞嘧啶(CD/5-FC)，BCL-2样蛋白4基因(BAX)以强烈的肿瘤细胞毒性而受到广泛关注。

　　HSV-tk/GCV是目前研究最深入的自杀基因治疗系统之一。HSV-tk基因可产生病毒胸苷激酶，该激酶可将无毒前体GCV磷酸化为单磷酸更昔洛韦，并通过宿主激酶进一步转化为三磷酸GCV。三磷酸GCV取代DNA合成过程中的鸟嘌呤‐5′‐三磷酸，阻碍DNA链的延长，诱导肿瘤细胞凋亡。这种方法在一些癌症的临床前和临床治疗中显示出良好的疗效[6]。同样地，CD能将无毒前体5-氟胞嘧啶(5-FC)转化为5-氟尿嘧啶(5-FU)，再通过内源性酶转化为强效嘧啶抗代谢物(5-FDUMP, 5-FDUTP, 5-FUTP)，诱导细胞凋亡。CD/5-FC系统在神经胶质瘤、神经鞘瘤和乳腺癌中的疗效已得到证实[7]。BAX是BCL-2蛋白家族中首次发现的促凋亡蛋白。它通过激活细胞凋亡蛋白酶通路并诱导凋亡分子(如细胞色素c)从线粒体释放到细胞质，从而在细胞内传递促凋亡信号。通过这种机制，过表达BAX基因以诱导细胞凋亡。已经有研究证明BAX可以诱导多种细胞系的凋亡，包括来自前列腺癌、宫颈癌和脑癌的细胞系[8]。

　　2.2基因沉默

　　通过RNA干扰(RNA interference, RNAi)抑制基因表达，可以提供一种靶向肿瘤细胞，避免全身毒性的方式。这种方法将小干扰RNA(siRNA)或短片段RNA(shRNA)传递到靶细胞，与靶mRNA结合成双链RNA，进而被RNA诱导沉默复合体（RISC）降解，从而抑制靶细胞内靶基因的表达。这一过程可在保留正常组织的同时，靶向肿瘤细胞中的独特基因。致癌基因、突变的抑癌基因和促进细胞凋亡的基因都是基因沉默治疗肿瘤的潜在靶点。与大多数化疗方法不同的是，基因沉默可以同时靶向多种肿瘤基因以获得更大的治疗效果。此外，由于RNA的高特异性，避免了全身毒性，疗效优于传统的化疗。然而，由于治疗性RNA对内源性核酸酶的降解极为敏感，目前仅有少数siRNA/shRNA疗法进入临床试验阶段[9]。

　　反义寡核苷酸(ASOs)是一种短的单链核苷酸类似物，与mRNA互补并能选择性地靶向mRNA[10]。ASOs与相应的mRNA杂交可诱导特异性的基因表达抑制，一般有两种抑制机制：触发RNase H（一个非特异性核酸内切酶家族），通过核糖体的水解和翻译阻滞来催化RNA的裂解；通过物理上抑制剪接或翻译机制的进程来破坏细胞核中pre-mRNA的稳定性。在临床试验中，一般通过前一种抑制机制评估ASOs的功能。为了提高ASOs的稳定性、特异性和效率，可以在磷酸二酯主链、杂环核酸酶和糖基上进行了各种化学修饰。然而，目前还没有ASOs成功应用于癌症治疗。

　　适配体是化学合成的短链RNA或单链DNA，并折叠成二级和三级结构。适配体对包括氨基酸、药物、蛋白质和细胞在内的广泛靶标具有特定的亲和力。与其他核酸分子不同，适配体可以通过结构识别与目标物结合，这一过程类似于抗原抗体的反应，因此，它们也被称为“化学抗体”。适配体独特的化学特性和生物学功能使其成为生物医学研究中非常有吸引力的工具[11]。除了治疗特性外，由于适配体对目标组织的可调特异性，也被用于其他基因产物传递载体，如siRNA。

　　2.3 miRNA介导的治疗

　　microRNAs(miRNAs)是一种内源性的mRNA表达和功能调节因子，也是肿瘤基因治疗的重要靶点。自发现以来，miRNAs的异常表达已被确定与肿瘤的形成、恶化和转移以及化疗耐药性有关。基于miRNA的治疗是通过抑制或诱导肿瘤相关miRNA的表达来恢复正常功能。因此，通过使用拮抗剂和模拟剂，可以调节肿瘤中miRNA的功能和状态，达到治疗肿瘤的目的。miRNA拮抗剂的作用是中断RISC的组装和抑制性miRNA的合成，增加能够逆转恶性肿瘤的基因表达（如肿瘤抑制基因）。miRNA模拟剂是运用化学方法合成的miRNA模拟物，能模拟细胞中成熟miRNA的高水平表达，以增强内源miRNA的调控作用，刺激沉默基因的表达。临床前研究已经评估了几种miRNAs的治疗潜力，包括miRNA-16、miRNA-Let 7和miRNA-31的。特别是Mianc Therapeutics, Inc.开发的miRNA-34的miRNA模拟物已经进入临床试验[12]。

　　2.4免疫基因治疗

　　免疫疗法是利用患者自身的免疫系统来治疗感染或疾病。由于免疫系统在肿瘤的产生和治愈中起着至关重要的作用，近年来成为癌症研究的前沿。基因传递技术的发展极大地促进了获得性免疫治疗、主动免疫治疗新方法的发展。

　　获得性免疫治疗是将患者的T细胞进行体外改造以更好地识别和响应肿瘤抗原，然后再注入患者体内。这种体外改造一般通过自体T细胞的基因工程，使T细胞可以产生嵌合抗原受体(CAR)或亲和性T细胞受体(TCR)。CAR由融合了T细胞信号域的抗体衍生的靶向域组成，根据其靶向域赋予T细胞抗原特异性。TCR通常通过癌逆转录病毒载体转导来识别肿瘤靶抗原。CAR T细胞已经在免疫治疗中应用了近30年，近期，CD 19靶向的CAR T细胞的临床的成功为更广泛的临床应用铺平了道路，尤其是在实体肿瘤领域。TRC工程的T细胞已经用于黑色素瘤的早期临床试验，并且已经发现了显著的临床反应[13]。

　　除了T细胞外，自然杀伤(NK)细胞因在宿主对癌症的免疫中发挥的重要作用，也被用于获得性免疫治疗。通过基因工程增强NK细胞的靶向能力、持久性、细胞毒性和肿瘤定位能力。例如，将CARs引入NK细胞以提高其对B细胞恶性肿瘤、白血病、骨髓瘤和乳腺癌的特异性。利用病毒载体进行IL-2转导可显著延长NK细胞的扩增，增强其细胞毒性。转染NK细胞的淋巴结归巢受体CCR 7，可以促进其向淋巴结的迁移和归巢[14]。

　　通过使用癌症疫苗引发主动免疫也是一种强有力的免疫治疗手段。常见的癌症疫苗包括基因工程肿瘤细胞疫苗和DNA疫苗。肿瘤细胞疫苗通过提高肿瘤抗原性来恢复免疫系统识别肿瘤的能力。一般是通过使用病毒载体共刺激分子转染肿瘤细胞，使其分泌各种细胞因子并引起免疫反应。迄今为止，各种肿瘤细胞疫苗已成功用于乳腺癌、肺癌、白血病和前列腺癌的临床试验。DNA疫苗编码所需抗原DNA（如肿瘤相关抗原），然后运送到宿主的组织中表达，提高免疫系统识别能力。与肿瘤细胞疫苗相比，DNA疫苗更安全、更经济、更灵活，有更大的潜力。但由于免疫原性差，疗效并不明显[15]。

　　总的来说，免疫疗法改变了传统的肿瘤治疗方式，具有巨大的发展潜力，并能为某些类型的癌症提供治疗的可能。免疫学家、分子生物学家和临床医生的跨学科交流对于进一步改进免疫治疗方案是必要的。

　　3.基因治疗载体

　　基因治疗载体负责将治疗基因传递到靶细胞或靶组织，在基因治疗中起着至关重要的作用。一般分为两类，一类是病毒类基因载体，另一类非病毒类基因载体。另外，最近发展了一些比较特殊的载体，如细菌、哺乳动物的干细胞等。

　　3.1病毒基因载体

　　病毒类基因载体是目前所有方法中最有效的基因转移手段，已受到广泛研究，并在许多临床试验中得到验证。病毒载体可以让治疗基因在病变组织中良好表达，并且容易大量复制。病毒载体的主要类群包括腺病毒、逆转录病毒、腺相关病毒和慢病毒，它们在包装能力、宿主特异性、基因整合谱和诱发免疫反应的倾向上各不相同。在需要重复给药时，差异更加明显。目前，病毒载体的肿瘤基因治疗中尚未解决的问题主要是宿主免疫反应和毒副作用，尤其是腺病毒引起的肝毒性。而且一般需要重复给药才能获得较好的治疗效果，但这种方式又会促进对病毒载体的免疫应答，形成抗药性。同时也存在正常组织对病毒载体的摄入问题[16]。这些问题必须在临床应用之前得到充分解决。

　　3.2非病毒类基因载体

　　与病毒类载体相比，非病毒类载体以其制备简单、低毒性、低免疫原性、可生物降解等优点，成为近年来基因治疗的常用载体，其中最为重要的是纳米颗粒。纳米颗粒凭借其优越的物理化学、生物和药理特性，有成为高效基因治疗载体。它们具有高的比表面面积，能负荷大量治疗基因，能够多功能化，并对周围环境的刺激产生反应，并潜在对肿瘤的靶向能力。研究较多的纳米颗粒主要可分为脂质类、聚合物类和无机类纳米颗粒。基因可以通过静电作用附着在纳米颗粒上或偶联在纳米颗粒表面以实现负载[17]。

　　3.2.1脂质类纳米载体

　　在所有的脂质类纳米载体中，阳离子脂质体的研究最为广泛。脂质体是合成磷脂和胆固醇的微囊泡，可通过内吞作用进入细胞。由阳离子脂质体和电中性辅助脂质体组成的阳离子脂质体可与核酸形成脂质体，保护其在血液循环中不被酶降解，并与细胞膜相互作用，促进细胞内化。它们作为基因传递载体的优点包括：制备安全、相对较高的基因转染效率、生物相容性和生物降解性。使用最广泛的阳离子脂质体是N-[1-(2,3-二烯氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)和[1,2-双(oleoyloxy)-3-(trimethylammonio)丙烷](DOTAP)。二油基磷脂酰乙醇胺(DOPE)是一种常用的电中性脂质体，它在核内体中具有低pH值下的膜失稳作用以及分解脂质体的能力，可以提高阳离子脂质体转染细胞的能力[18]。

　　3.2.2聚合物类纳米载体

　　阳离子聚合物类纳米载体是目前应用最广泛的有机纳米载体之一，它们具有体积小，分布窄，能够封装多种治疗基因并保护它们不受酶降解、可调节的理化性质和良好的体内外稳定性等许多优点。天然蛋白质（如白蛋白、玉米蛋白）、多糖（如壳聚糖、海藻酸、透明质酸）和人工合成的聚合物（如聚乙烯亚胺、聚赖氨酸、聚酰胺、聚乳酸）等被广泛用作肿瘤基因治疗载体[19]。而且聚合物可以响应外部刺激，如温度、pH或电磁辐射，这些特性有利于控制基因的传递和释放，提高基因治疗的特异性。

　　3.2.3无机物类纳米载体

　　无机纳米载体，包括碳纳米管、磁性纳米颗粒、磷酸钙纳米颗粒、金纳米颗粒和硅纳米颗粒等，是另一类重要的基因治疗纳米载体。大多数无机纳米颗粒可以在很大程度上控制其大小、形状、组成以及化学性质。它们还具有较长的框架寿命，不受微生物影响。还能利用聚合物和官能团对无机纳米粒子进行化学修饰，从而实现靶向的基因传递。此外，无机纳米载体通常具有独特的电、磁、光学或等离子体特性。这些性质可以提高基因的传递效率，使纳米颗粒具有多种功能，为监测基因的转染效率提供了一种手段。例如，金纳米颗粒是光学成像、光声成像、计算机断层成像的良好造影剂，具有良好的光热性能，这些性质可用于基因治疗中的自我跟踪[20]。

　　4.展望

　　肿瘤基因治疗是基因治疗发展的重心，目前全世界超过一半的基因治疗试验是针对肿瘤治疗开展的。基因治疗作为一种肿瘤治疗方法，具有靶向、低毒、高效等优点，具有传统治疗方法无法比拟的优越性。在过去的十年里，肿瘤基因治疗取得了巨大的进步，不断开发新的基因治疗载体如纳米载体，提高治疗基因的效力和稳定性等。但是它依然存在许多问题，如治疗基因的种类还很少，治疗靶向性还不够高，载体传递基因效率依然有限，治疗基因在靶点的表达很难控制，治疗的安全性也缺乏保障，容易引发伦理问题等。但是随着科学的进一步发展，人们知识水平的提高，基因治疗的普及，基因治疗这一年轻的技术，必将得到的更加广泛而科学的应用，使肿瘤、遗传性疾病等疾病的治愈成为，为人类带来更加健康美好的未来。

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