iMeta｜复旦大学附属华山医院证实肾上腺皮质癌中瘤内菌的存在并与预后相关

　　瘤内微生物与肾上腺皮质癌患者的预后相关

　　研究论文

　　●?原文链接DOI: https://doi.org/10.1002/imt2.102

　　●?2022年3月3日，?复旦大学附属华山医院冯陈陈团队和香港大学化学系李泳新团队在?iMeta?在线发表了题为 “Intratumoral microbiota is associated with prognosis in patients with adrenocortical carcinoma?” 的文章。

　　●?本研究发现瘤内微生物在多种癌症中起着关键作用，不仅支持肿瘤内细菌的存在，而且揭示了瘤内微生物在肾上腺皮质癌 (ACC)?中的预后和生物学作用。对ACC生物学的深刻理解可能对新的治疗方式有很大帮助。

　　●?第一作者：李育青、章登位

　　●?通讯作者：姜昊文?(drjianghaowen@163.com)、冯陈陈(drfengchenchen@163.com)、李泳新(yxpli@hku.hk)

　　●?合作作者：王明华

　　●?主要单位：复旦大学附属华山医院、香港大学化学及太古海洋科学研究所、广东省南方海洋科学与工程实验室

　　亮? ?点

　　

　　●??肾上腺皮质癌(ACC)包含瘤内微生物。

　　●??瘤内微生物与ACC预后有关。

　　●??瘤内微生物可能与基因组事件、免疫状态和特定的致癌信号通路相关。

　　摘? 要

　　肾上腺皮质癌(ACC)是一种罕见但侵袭性强的恶性肿瘤。最近的研究发现，瘤内微生物在多种癌症中起着关键作用，但在ACC中的作用仍不确定。在此，我们分析了瘤内微生物在ACC中的作用，从测序数据中获得肿瘤内微生物组数据，并通过细菌16S rRNA荧光原位杂交和脂多糖染色在内部队列中进一步验证其存在。非监督聚类鉴定了ACC中两个自然聚集的不同微生物群，该分群与ACC患者的总体生存率相关。微生物特征合并临床分期提高了ACC患者预后的预测能力，且微生物特征带来的预后差异依赖于肿瘤免疫。基因组和转录组相关分析发现，基于微生物特征分群的预后更差的患者中细胞周期和p53信号通路高表达，提示该生物信号通路和微生物特征的相关性。我们的研究不仅支持肿瘤内细菌的存在，而且揭示了瘤内微生物在ACC中的预后和生物学作用，这可以促进对ACC生物学的深入理解。

　　视频解读

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　　全文解读

　　引? 言

　　肾上腺皮质癌(ACC)是一种罕见但侵袭性强的疾病。尽管大约50%的ACC患者存在激素过度分泌的问题，大多数患者初诊即为晚期，这使得患者5年生存率不到10%。作为一种罕见病，唯一的III期临床试验(即FIRM-ACT试验)对晚期ACC建议采用EDP+M方案(依托泊苷、多柔比星、顺铂和米托坦)，对生存具有一定的改善。因此，对ACC生物学的深刻理解可能对新的治疗方式有很大帮助。

　　二代测序(NGS)使我们能够更深入地了解ACC的遗传和基因组变化。到目前为止，NGS技术、癌症基因组图谱(TCGA)和Assie等人的基因组图谱对这种罕见疾病的基因组情况进行了前所未有的描述。该疾病的遗传驱动事件包括TP53、CTNNB1、MEN1、PRKAR1A、RPL22、NF1和MLL4的突变，以及基因拷贝数加倍，还包括一些可预测预后的mRNA和甲基化特征。除了提供宿主遗传学的图景外，来自组织或血液的NGS数据被发现包含微生物的遗传物质，这为更深入地了解肿瘤内的微生物群提供了机会。

　　驻留在癌症中的微生物，特别是肿瘤内细菌(ITB)，最近被发现在多种癌症类型中起着关键作用。关于癌症相关的微生物学研究总体上经历了三个阶段。传统的基于病理学的研究只确定了有限的致癌微生物组，例如胃癌中的幽门螺杆菌和肝癌中的乙肝病毒。虽然数量有限，但许多这样的研究极大地更新了人们对这种疾病的理解和治疗。第二个阶段，也是今天仍在延续的阶段，源自“受污染的”器官或胃肠道的癌症受到关注，肠道微生物组现在被认为是全能的，可以介导各种生理和病理生理活动，包括癌症。肠道细菌的代谢产物不仅能促进局部致癌，而且还提高了其他器官靶向治疗或免疫治疗的药物敏感性。最近，学者们从NGS数据中开发出表征肿瘤内微生物的算法，从而彻底改变了我们对各种癌症中肿瘤内微生物的理解。对肿瘤内微生物组的功能作用的研究具有重大意义，将肿瘤微生物学推向了第三阶段。

　　尽管与多种肿瘤有关，但肿瘤内的微生物群在ACC中仍未被确定。为了填补这一空白，本研究首次描绘了ACC中瘤内微生物的特征。通过利用Poore等人描述的瘤内微生物数据，我们发现肿瘤内的微生物群与ACC的预后、宿主基因组事件和免疫状态有关。此外，与单独的临床分期相比，微生物特征可以提高预后预测。我们的研究为更好地理解ACC的生物学特征和开发新的治疗策略提供了希望。

　　结果

　　ACC含有瘤内微生物

　　为了阐明ACC的瘤内微生物，我们收集并获得了不同癌症的瘤内微生物图谱，该数据是Poore等人的方法使用TCGA的全基因组测序(WGS)和RNA测序(RNA-Seq)数据进行处理得到(图1)。瘤内微生物由三种类型的微生物组成(即病毒、古菌和细菌)。经过数据标准化和去除污染，在不同的标准下产生了五种微生物丰度矩阵，包括未去除污染(NR)、去除可能的污染物(LR)、去除测序“平板-中心”组合污染物(CR)、去除所有假定的污染物(PR)和通过最严格的过滤去除污染物(SR)。

　　

　　图1. 分析流程概览

　　对TCGA的原发肿瘤进行全基因组测序和RNA测序，其中微生物丰度(包括病毒、古菌和细菌)由Poore等人鉴定并标准化(左图)。为了证实肿瘤内细菌的存在，我们对37例肾上腺皮质癌肿瘤组织微阵列芯片进行了荧光原位杂交和免疫组织化学染色。根据微生物数据进行无监督聚类，以探索具有不同微生物特征的患者，并评估对预后的影响。进一步地，鉴定与肾上腺皮质癌患者预后相关的特征微生物 (中间图)。挑选出的特征微生物被证实可以提高预后预测能力。肿瘤内微生物被发现与肿瘤免疫状态改变、基因组事件发生和致癌信号通路激活等相关(右图)。

　　TCGA中的ACC样本由79例患者原发瘤的RNA-Seq数据组成，其中在制备RNA-Seq文库时使用了Poly(A)对mRNA的富集。这可能会影响瘤内微生物的检测，因为只有部分原核生物的mRNA被多聚腺苷酸化。为了探索这个问题，我们首先试图比较WGS和RNA-Seq鉴定的瘤内微生物的差异。在TCGA库中，1837例患者同时包含WGS和RNA-Seq数据，而224例患者包含来自同一原发肿瘤的一个以上WGS数据集。我们使用Bray-Curtis差异度来评估每个个体内的微生物群落，从WGS和RNA-Seq或从不同的WGS数据中。我们观察到相比同一个体的不同WGS数据之间的差异，WGS和RNA-Seq之间的差异只有略微增加(图2A，补充材料：图S1)，没有发现明显的双峰，这意味着来自RNA-Seq数据的偏差对于下游分析来说可以忽略不计。

　　接下来，我们检查了去污前、后ACC中的微生物图谱。共有1794、1552、1406、1284和169个属分别被纳入NR、LR、PR、CR和SR组(图S2)。NR和LR中分别以分枝杆菌属和假单胞菌属为主，PR和CR中以类杆菌和链霉菌含量最高(图2B)。经过最严格的过滤后，链霉菌属和脱硫球菌属在SR中占主导地位。由于TCGA-ACC队列缺乏正常组织对照，我们选择与ACC具有相似部位和手术方式的肾上腺嗜铬细胞瘤(PCPG)作为对照。主坐标分析(PCoA)显示，PCPG(n=178)和ACC(n=79)之间的微生物组成显著不同(置换多变量方差分析(PERMANOVA)检验，p

　　为了验证ACC中微生物的存在，特别是最丰富的瘤内细菌，我们对ACC组织微阵列芯片(TMA)进行了染色，该芯片包含来自我们内部队列的37个样本。我们使用针对细菌16S rRNA的通用探针，采用RNA荧光原位杂交技术(FISH)检测ACC组织中的细菌RNA(图2D)。我们还对细菌脂多糖(LPS)进行了免疫组织化学(IHC)染色，该染色是针对革兰氏阴性菌的检测(图2D)。97.3%(36/37)和83.8%(31/37)的ACC标本16S rRNA和LPS染色阳性，这表明ACC中确实存在细菌(图2E)。

　　

　　图2. 肾上腺皮质癌(ACC)蕴藏着肿瘤内的微生物

　　(A)两种不同测序方法在肿瘤内微生物检测的比较（NR微生物数据）。Bray-Curtis差异度用于评估不同WGS之间或WGS与RNA Seq之间鉴定的微生物群落的差异。上面的箱形图和下面的密度图显示了Bray-Curtis差异度分布。(B)在 ACC和PCPG中基于Bray-Curtis差异度的主坐标分析(PCoA)。排列多元方差分析(Permutational multivariate analysis of variance, PERMANOVA)得到p值。(C)不同过滤标准下每种微生物组数据中微生物的相对丰度。每种微生物组的数据只显示前5个属。(D)含有37个ACC样本的组织中16S rRNA荧光原位杂交(FISH)染色(上)和LPS免疫组化(IHC)染色(下)的代表性图像。(E) 16S rRNA的FISH染色(左)和LPS的IHC染色(右)阳性结果(上)与阴性对照(下)比较的代表性图像。箭头用于标识阳性信号。

　　ACC瘤内微生物组的组成与预后有关

　　考虑到肿瘤微生物组与癌症预后之间的可能关系，我们试图确定ACC中微生物组的组成是否会影响患者预后。我们推测，肿瘤内微生物组的天然不同集群可能影响ACC的预后。为此，根据Bray-Curtis(BC)相异度、Jaccard距离和两者(CM距离)的组合度量，我们对77名患者的5种类型的微生物丰度数据(排除2名分期信息缺失的患者)应用了无监督聚类策略：PAM聚类。我们使用预测强度(PS)和轮廓指数(SI)来评估相应聚类的数量和质量。我们观察到较低的PS(

　　然后，我们使用基于BC差异的主坐标分析(PCoA)来确认每种数据类型MS1和MS2之间的微生物群落的差异。正如预期，我们发现采用NR聚类、LR聚类、PR聚类或CR聚类时，两个MS队列之间存在显著差异，(PERMANOVA检验，p

　　然后我们尝试探究两个MS队列之间的预后差异。为此，我们采用了Kaplan-Meier法来检验生存分布，并使用对数秩和检验来检验两个群组之间的差异。当应用NR-聚类(p

　　最后，我们评估了两个MS队列之间的临床特征。我们发现，四种聚类(NR聚类、LR聚类、PR聚类和CR聚类)中，MS1队列(预后较差)具有更多的非典型的有丝分裂像、带瘤状态和治疗后疾病进展(图3D，补充材料：表S1)。为了确定微生物组成是否可以作为一个独立的预后生物标志物，我们进行了多因素COX分析，结果显示在ACC队列中，微生物亚型以及非典型的有丝分裂像或术后3个月的临床状态都无法独立地预测患者预后。为了进一步探索，我们使用随机森林分析(补充材料：表S2)对可能与某些临床变量(例如，肿瘤状态和初步治疗后结果)相关的个体微生物进行了分析，其中一些属被证明与临床变量相关。例如，溶菌素菌属可能与初步治疗结果有关，即完全缓解(CR)或疾病进展(PD)。

　　

　　图3. 肾上腺皮质癌(ACC)的瘤内微生物组成与预后相关

　　(A)不同聚类数的聚类得分。基于CM距离，通过预测强度和轮廓指数来评估聚类结果。(B) 77例ACC患者的5种微生物数据聚类结果。每个小方块代表一个病人。(C)五种聚类结果下两个集群的Kaplan-Meier图。Log-rank检验得到p值。(D)不同聚类结果MS1、MS2与混杂因素的多因素cox分析。标红的临床因素代表独立影响预后的因素。显著性用星号表示。*p

　　瘤内微生物标志物可提高预后预测能力

　　考虑到特定的微生物可以改变预后，我们探求是否有微生物对ACC的预后产生影响。由于一些临床因素(例如，年龄、性别、种族和临床分期)可能与微生物组成有关，我们首先试图研究微生物特征的潜在混杂因素。根据BC差异性，通过PERMANOVA检验量化了14个临床因素的混杂效应。对于NR和LR，我们观察到微生物组的组成随肿瘤状态、术后3个月的临床状态、手术切缘和非典型性核分裂像(错误发现率(FDR)-adj.p

　　为了进一步确定可能与预后相关的微生物特征，我们接下来的分层根据35个属特征的中位丰度将患者分别分为两组，有效大小

　　1(图4A)。COX比例风险回归模型显示，根据15个属对患者进行单独分层时，有显著的风险率(图4B)。生存分布的差异也被Kaplan-Meier估计法所证实(补充材料：图S9-S12)，这15个属的高丰度与良好的预后密切相关。

　　目前关于ACC预后生物标记物的报道数量有限。以前的研究试图构建一个基于微阵列芯片的预后预测因子，并确定BUB1和PINK1基因对是ACC预后不良的最佳预测因子(AUC=0.83)。为了评估这15个属对总生存率的预测能力，我们进行了接受者操作特性(ROC)分析。令人惊讶的是，在我们的研究中，15个微生物属的组合观察到在NR聚类中的AUC为0.84，在LR聚类中AUC为0.83，在PR聚类中AUC为0.82(图4C)。此外，我们发现MS的加入提高了早期的预后预测能力(图4D) (T=22.07个月，p

　　

　　图4. 肿瘤内微生物特征提高预后预测能力

　　(A) 火山图：两个亚群间差异的309个微生物属。Y轴是log(FDR调整后的p值)，X轴是平均效应量。每个微生物属的效应值为MaAsLin2使用的线性模型中的系数值。每个点代表一个属，并根据属的分类着色。红色虚线表示截止1或1。(B)热图显示不同丰度的35个属的危险比。危险比

　　肿瘤内微生物组成与宿主基因组事件相关

　　一项大规模研究在ACC中发现了5个显著突变的基因(SMGs)(TP53、CTNNB1、MEN1、PRKAR1A和RPL22)，并显示较高频率的体细胞拷贝数变异(CNVs)。因此，我们接下来试图描述这些患者的基因突变和CNVs的情况。我们使用卡方检验(补充材料：表S5)比较了两个MS队列之间各种基因组事件的发生，观察到在预后更差的MS1队列中，CTNNB1和TP53突变率较高，以及14q11.2扩增，22q12.1丢失，9p21.3丢失频率也更高 (图5A，补充材料：图S13)。受基因组改变影响最大的通路是p53信号途径(补充材料：图S14)，这是大多数ACC肿瘤中常见的激活通路。我们还比较了两个队列之间的肿瘤突变负荷(TMB)，发现MS1队列中TMB较高，这与先前的发现一致，即高TMB水平与更差的预后相关(图5B)。虽然没有观察到在基因组改变分数(FGA)方面的差异，但MS1显著富集频发体细胞拷贝数改变(SCNA)的集群，其特征是侵袭性疾病表型(图5C，D，补充材料：图S15A)。

　　

　　图5. 肿瘤内微生物组成与宿主基因组事件有关

　　(A)瀑布图显示MS亚群的肾上腺皮质癌患者之间差异分布的基因组事件。小提琴图显示不同聚类情况下MS亚型间(B)肿瘤突变负荷和(C)基因组改变分数的差异。(D)堆叠条形图显示MS1和MS2在NR聚类中体细胞拷贝数改变分型的χ2检验。显著性用星号表示。*p

　　瘤内微生物可能以免疫依赖的方式发挥作用

　　ACC的特点是免疫惰性和免疫耐受。为了评估两个MS队列中的免疫状态，我们对肿瘤微环境的总体免疫基质细胞进行了评分，发现MS1的免疫浸润评分比MS2低(补充材料：图S16)。更具体地说，我们估计了28种免疫细胞类型的浸润水平，并在MS1队列中观察到较低比例的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)(图6A)，包括激活的CD4+T细胞、自然杀伤T细胞、2型T辅助细胞和嗜酸性粒细胞。在其他实体肿瘤中也观察到这些免疫细胞的差异，如乳腺癌和肺癌。由于许多肿瘤内微生物对TME的影响似乎抑制了局部抗肿瘤免疫，我们接下来探究了与多种免疫细胞相关的免疫抑制基因。因此，我们确定了几个MS1队列中上调的基因，包括CD8+T细胞负相关基因(CX3CL1)和T细胞负相关基因(EZH2、DNMT1、EDNRB、ICAM1和VEGFA) (图6B)。

　　

　　图6.?肿瘤内微生物可能以免疫依赖的方式发挥作用

　　(A)热图显示MS1/MS2患者的肿瘤微环境中28种免疫细胞的浸润率比值。比值>1表示MS1亚群的肿瘤免疫浸润较高，比值

　　瘤内微生物可能激活致癌途径

　　对微生物相关分子通路(MAMPs)的深入了解是识别瘤内微生物的“朋友或敌人”角色的标准流程。我们首先研究了ACC中的宿主转录组数据，以确定两个MS队列之间的差异表达基因(DEGs)。在四种聚类中分别对MS1(预后更差的队列)中上调的DEGs进行的KEGG通路富集分析，并可视化前10个富集通路(图7A)，发现有几个有趣的通路重叠。考虑到与ACC进展相关的信号通路和与微生物群相关的信号通路，细胞周期和p53信号通路引起了我们的注意。这两条通路在MS1中的上调也通过GSEA进行了验证(补充材料：表S6)，细胞周期和p53信号通路的NES分别为2.02(p=0.001)和1.61(p=0.005)(图7B)。另一方面，MS1队列富集具有侵袭性的C1A转录亚型和高类固醇表型(图7C，D，补充材料：图S15B)。根据一项研究中的基因表达分析，C1A转录组亚型被定义为预后较差的恶性肿瘤，这可作为除病理和肿瘤分期之外的一个独立的预后生物标志物；这已被认为是一个强有力的预测因子。此外，MS1显示出更高比例的高DNA甲基化水平(图7E，补充材料：图S15D)，表明MS1具有更恶性表型。然而，我们没有观察到MS特征与组织学、miRNA、蛋白质或肾上腺皮质分化评分(ADS)特征之间的任何关联 (补充材料：图S17A-D)。

　　

　　图7. 瘤内微生物可能激活致癌通路

　　(A)用KEGG富集分析显示不同聚类情况下MS1亚群前10条通路。圆点的大小表示该信号通路的基因数量。(B)基因集富集分析显示在MS1队列中细胞周期和p53信号通路相关基因的表达增加。堆叠条形图显示(C) C1A/C1B亚组，(D) mRNA亚组，(E) 甲基化亚组在NR聚类中MS1和MS2分布，χ2检验得到p值。

　　讨论

　　在这项研究中，我们利用Poore等人处理的微生物丰度数据，对ACC的瘤内微生物群进行了系统研究。我们使用细菌16S rRNA FISH和LPS染色，在我们的内部队列中验证了ITB的存在。无监督聚类法推断出ACC中两个自然不同的瘤内微生物群落特征，这两个微生物群与总体生存相关。微生物标志物结合临床分期可以提高疾病状态的预测能力。此外，我们还发现肿瘤内微生物与宿主基因组事件和免疫状态有关。总之，我们的研究为ACC的瘤内微生物提供了深刻的见解，并可能促进未来关于瘤内微生物如何指导靶向治疗和免疫治疗的研究。

　　肿瘤内微生物已经在大多数人类癌症中被发现，包括在邻近的正常和深层肿瘤组织中，这些组织通常被认为是无菌的。然而，瘤内微生物的组成在不同的癌症类型中差别很大。与以前对不同实体瘤的研究一致，我们首次使用16S rRNA FISH和LPS染色观察到超过80%-90%的ACC样本中存在ITB。无论位于肿瘤内或靠近肿瘤和/或TILs，瘤内微生物显示出强烈的癌症类型依赖性特征。事实上，我们发现ACC和PCPG的瘤内微生物有显著的差异，尽管它们在手术部位和手术方式上非常相似。因此，正如一些科学家(Poore等人)所声称的那样，肿瘤内微生物组的独特性可能作为鉴定或诊断的生物标志物。此外，新兴研究强调了肿瘤内微生物对更多临床表型的影响，如肿瘤复发、肿瘤转移和患者预后。近年来，肿瘤驻留的微生物群影响肿瘤生物学的机制研究进展已成为一个研究热点。例如，在口腔鳞状细胞癌(OSCC)中，肿瘤驻留的F. nucleatum触发了GalNAc/autophagy/TBC1D5信号，驱动肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的形成，以及OSCC进展。顺应这一趋势，我们的研究提出了肿瘤内微生物组的预后作用，目的是全面描述其潜在的生物学作用，为更深入的研究铺平道路。

　　无监督聚类是一种有效的机器学习技术，用于检测数据集中自然不同的类群，已被广泛应用于各种科学研究，如从单细胞RNA测序数据中识别细胞类型，或检测人类肠道微生物组的肠道类型。值得注意的是，一些因素，如聚类方法和距离度量，影响聚类检测，而没有任何一种聚类方法可以在所有数据集中表现最佳。在这项研究中，我们将PAM聚类法应用于ACC微生物组数据，通过测量预测强度和轮廓指数，检测出两个不同的聚类作为最佳选择。但是，我们观察到最大预测强度小于0.8，这是支持聚类的中等阈值。这可能是由于数据量较小，潜在的污染物，或ACC瘤内微生物没有显著差异等造成。特别地，在数据集中的潜在普遍污染可能会降低聚类检测的能力，因为这将使微生物群更加相似。尽管如此，我们仍然观察到两个聚类之间的预后差异，表明微生物群落与预后之间存在关联。

　　肿瘤内微生物组是否在预后中发挥作用是癌症生物学中一个相当重要的问题。先前基于微生物特征的泛癌生存分析显示，ACC是少数几种肿瘤类型中，瘤内微生物组对已建立的预后预测系统具有额外提高的癌症类型。在乔等人的一项里程碑式的研究中，鼻咽癌(NPC)中被证明含有细菌，其组成与鼻咽癌复发有关，而ITB载量与预后有关。令人惊讶的是，我们研究的基于微生物群的聚类法将患者区分为不同临床状态的亚组，包括带瘤状态和疾病复发。我们还提出了15个特征属可以作为预后标志，其预后预测的表现达到0.8以上的AUC值。其中，一些特征已被发现与实体瘤或其他肿瘤有关。例如奇异变形杆菌优先定位于肿瘤组织，并在乳腺肿瘤模型中显著抑制原发肿瘤生长和肺转移。等球菌属和独球菌属于浮游菌门，据报道一般情况下可以产生抗癌化合物。此外，与现有的工具，如ACC的肿瘤分期相比，根据微生物分群有望提高预后预测的性能，表明有潜在的临床转化价值。

　　DNA突变是瘤内微生物对癌症发展的影响之一。据报道，微生物群是几种癌症DNA损伤的重要原因，包括胃肠癌。微生物群造成的DNA损伤进一步增加宿主基因突变，最终可能导致肿瘤发生。与这些发现一致的是，我们发现，除了一些拷贝数变异外，一些驱动程序突变，如CTNNB1突变，大多发生在预后较差蛋MS1队列中。众所周知，TP53突变与免疫抑制微环境相关。这些基因组事件富含在p53信号和WNT途径中，这在其他专注于影响宿主细胞信号级联的细菌效应物的研究中也提到了。这些一致的发现进一步证明了瘤内微生物在肿瘤发生中的致病作用。然而，未来的研究仍然是有必要的。

　　致癌信号通路的激活是瘤内微生物的另一种影响方式。许多研究发现，某些微生物不仅可以直接或间接地影响IL-6和TNF-α等细胞因子，还可以激活NF-κB途径或STAT3途径来促进肿瘤进展。以前已经观察到了特定微生物与细胞周期途径之间的关联，并发现与无菌小鼠相比，常规小鼠蛋细胞周期相关基因或微小RNA的表达存在差异。此外，细胞周期往往与DNA损伤有关。我们的研究发现，细胞周期在MS1队列中显著丰富，该通路和p53信号通路是ACC中最活跃的通路。只有在微生物产生的鞣酸存在的情况下，p53途径才被认为是致癌的，这表明了微生物组与宿主功能基因组的相互作用。我们还探索了与属于这两个途径的基因的具有显著相关性的微生物(补充材料：图S18)，但我们并不计划夸大这些发现的合理性。考虑到样本大小有限，过度拟合可能会严重扭曲结果。

　　ACC的特点是惰性免疫和免疫治疗耐受，这指的是免疫抑制状态，表现为免疫细胞数量减少或T细胞、B细胞和NK细胞耗尽，从而降低肿瘤微环境中的肿瘤杀伤力。科学家已经证明，肿瘤周围细菌群落的失调既可以引起慢性促炎免疫反应，也可以通过抑制抗肿瘤免疫反应调节局部免疫监测。我们的研究表明，MS1中总体免疫或间质浸润的比例较低，TILs如活化的CD4+T细胞和自然杀伤T细胞，表明TME抑制状态。进一步的分析突出了大量免疫抑制基因的上调，支持上述结论。这与这样一个事实相对应，即富含C1A的MS1(特征为主要是免疫抑制或皮质醇的高类固醇生成表型)，被证明与更差的预后有关。Mahata等人研究结果表明，肿瘤诱导T淋巴细胞产生新的类固醇激素以逃避抗肿瘤免疫，证实了类固醇的免疫抑制作用。此外，我们发现在两个MS亚群中过度分泌的激素是不同的，这表明类固醇在瘤内微生物对肿瘤微环境的影响中起着关键作用。

　　从技术上讲，不同于肠道或体液微生物研究，鸟枪法宏基因组测序不适用于ITB检测，因为肿瘤内微生物的生物量极低。然而，一些转录组16S rRNA测序和FISH技术的研究已经提供了令人信服的证据，证明了ITB的存在和位置。Fu等人的研究表明，从自发性乳腺癌转基因小鼠身上培养的ITB可以通过改变细胞骨架的机械重塑来促进肿瘤转移。然而，这种培养方法对我们来说很难推及，因为目前缺乏转基因的ACC小鼠，且类器官没有报道过，更不用提从患者肿瘤样本中捕获ITB序列的可能性很小，因为宿主遗传物质是天文数字。Wang等人应用代谢组学方法，评估乳腺癌中细菌代谢产物三甲胺N-氧化物(TMAO)，并追踪分泌TMAO的ITB。这种方法在ACC中似乎更可行，唯一的问题是这种疾病的罕见性。

　　我们研究的局限性包括缺乏外部验证和缺乏在Silico和IHC中都被广泛接受的去污染方案。首先，ACC的稀有性使得在合理的样本量下对宏基因组和16S rRNA的测序技术进行测试非常困难。目前正在进行基于16S rRNA测序和体外培养的单个ITB的功能分析，以建立ITB与宿主之间的因果关系，但仍处于组织收集阶段。考虑到这种疾病的罕见性，很难在有限的时间内完成大量的标本采集。

　　此外，由于缺乏新鲜样本，很难验证基于RNA-Seq的特征和ITB分离。最后，尽管考虑了去污，但在整个分析过程中仍可能保留潜在的污染物。我们处理FFPE块的方式需要优化。尽管如此，我们的发现使我们对ACC的生物学特性有了更好的了解。

　　结论

　　综上所述，我们的研究证实了肾上腺皮质癌中肿瘤内微生物的存在，并描述了与预后相关的独特微生物群组成，其中15个微生物属对预后有良好的预测作用。瘤内微生物可以区分肿瘤微环境的免疫状态，并与p53信号和细胞周期信号等致癌途径相互影响。相关的功能分析值得进一步探索。

　　方法

　　在线数据采集

　　微生物丰度数据和相应的临床数据(文件“Metadata‐TCGA‐Kraken‐17625‐Samples.csv”) 是从Poore等人提供的在线存储库获得的(ftp://ftp.microbio.me/pub/cancer_microbiome_analysis)。本研究直接采用归一化和批次效应校正的微生物组数据进行生物信息学分析。这些微生物组数据包括原始计数的数据 (file“Kraken‐TCGA‐Raw‐Data‐17625‐Samples.csv”)，Voom-SNM标准化 的 数 据(文件“KRAKEN-TCGA-VOOM-SNM-Full-Data.csv”)，VOOM-SNM标准化的和去除可能污染物的数据(file“Kraken‐TCGA‐Voom‐SNM‐Likely‐Contaminants‐Removed‐Data.csv”)，VOOM-SNM标准化和去除假定污染物的数据(file“Kraken‐TCGA‐Voom‐SNM‐All‐Putative‐Contaminants‐Removed‐Data.csv”)，VOOM-SNM标准化和通过测序“平板-中心”组合去除污染物的数据(file“Kraken‐TCGA‐Voom‐SNM‐Plate‐Center‐Filtering‐Data.csv”)，以及VOOM-SNM标准化和最严格过滤的数据(file“Kraken‐TCGA‐Voom‐SNM‐Most‐Stringent‐Filtering‐Data.csv”)。所有的微生物组数据都由病毒、古菌和细菌组成，它们是在属的层面上进行量化的。去污染过程在原始文件中有详细说明。

　　RNA-Seq数据的基因表达谱，包括原始计数和标准化为FPKM(每百万个片断的转录本中每千碱基的片段)，从UCSC Xena数据集下载(https://xenabrowser.net/datapages/)。FPKM进一步转换为TPM(每百万个转录本)。在超过50%的样本中缺失的基因被过滤掉了。以25%的样本方差为截止点，低方差的基因也被丢弃，保留了14267个基因用于下游分析。从在线数据库下载用于单样本基因组富集分析(SSGSEA)的基因集，并且从MSigDB数据库获得用于GSEA的基因集(https://data.broadinstitute.org/gsea-msigdb/msigdb/release/7.5.1/)。

　　使用R软件包 “TCGAbiolinks”(v2.16.4)获取突变注释格式(MAF)形式的体细胞突变数据。从UCSC Xena数据库下载Gistic 2拷贝数数据集(https://xenabrowser.net/datapages/)。从郑等人的在线资源库中获得驱动基因突变或重复扩增和缺失的染色体片段，以及不同数据类型的分子分类。从cBioPortal数据库下载TCGA-ACC患者的临床数据(https://www.cbioportal.org/)。

　　微生物组数据的无监督聚类

　　使用R软件包“CLUSTER”中的PAM聚类法对五个标准化的ACC微生物组数据进行了非监督聚类，这是一种比K‐means更稳健的聚类方法。这种聚类算法依赖于预定义的距离度量，这些度量会影响微生物组中自然聚类的检测。聚类变化可以通过Bray-Curtis(BC)离散度度量和未加权UniFracDistance的组合度量来减少集群变异，前者既考虑微生物的存在/不存在又考虑其丰度，而未加权的UniFracDistance仅考虑微生物的存在/不存在。因此，我们采用了三种距离，即BC相异度，Jaccard距离(只考虑微生物的存在/不存在)，以及两个等权的组合度量，称为CM距离，用于PAM聚类。BC相异度和Jaccard距离由R包“VEGAN”中的vegdist功能计算；CM距离由R 包“MicobiomeCluster” 中的combMetric函数生成(https://github.com/YushuShi/MicrobiomeCluster)。我们将组合度量(CM距离)定义为dCM=0.5×dBC+0.5×dJD，其中dCM是CM距离，dBC是Bray-Curtis相异度矩阵，dJD是Jaccard距离矩阵。我们用预测强度(PS)和轮廓指数(SI)来评估最佳聚类数，其中PS的得分≥为0.90或SI的得分≥为0.75为支持较强的聚类。PS使用“fpc”程序包中的prediction.strong函数计算，SI使用“cluster”程序包中的pam函数计算。我们还使用调整后的Rand指数来比较不同微生物组数据应用不同距离矩阵时产生的集群。对于调整后的Rand指数，0分表示不相关的集群，1分表示两个相同的集群。这是使用R包“fossil”中的adj.rand.index函数运行的。

　　微生物群落的α多样性和β多样性

　　用基于BC相异度的主坐标分析(PCoA)检验ACC和PCPG(嗜铬细胞瘤和副神经节瘤)之间或不同集群之间的微生物群落(β多样性)的差异。基于BC异质性的多变量分析（PERMANOVA），用于比较组间微生物群落的差异，参数为 999次置换，该分析使用R包"vegan"中的adonis2进行。使用R包“phyloseq”中的函数estimate_richness来估计Shannon指数(α多样性)，该指数代表每个样本内微生物群落的丰富度和均匀度。两组间的统计学差异用Wilcoxon符号秩检验法进行检验，检验组间的统计学差异使用“ggpubr”中的函数stat_compare_means运行。

　　识别与总存活率相关的微生物标志物特征

　　利用基于BC差异的PERMANOVA分析（999次置换）观察临床因素对微生物群落的影响。使用FDR(错误发现率)方法进行多重比较并调整p值。调整后的p值

　　生存分析与预后预测

　　用Kaplan-Meier曲线估计各组间的生存分布，用log-rank检验各组间的组间差异。这是由软件包 "survival"中的Surv和survfit功能运行的，并使用 "survminer"包中的ggsurvplot进一步绘制。为了探索微生物特征对总体生存的影响，我们根据每个种属特征丰度中位数的截止点将患者分成两组。用COX比例风险回归模型对低丰度和高丰度的患者进行生存分析，这是用软件包“survival”中的coxph完成的。在Cox模型中计算危险比(HR)和相应的95%可信区间(CI)。结果用R包"forest- ploter"（v2.0.1）进行可视化。用R包“pROC”(v1.18.0)和“timeROC”(v0.4)绘制受试者工作特征(ROC)曲线，并用曲线下面积(AUC)评估可预测性。此外，我们使用R包“randomForest”(v4.6-14)来鉴别最可能与临床因素有关的微生物属。

　　基因组分析和可视化

　　体细胞变异是用R软件包 "maftools" (v2.4.12)检测和分析的。候选基因被限制在驱动基因事件中。使用mafCompare函数来比较不同组间的变异频率。使用R包“ComplexHeatmap”(v2.13.1)中的oncoPrint函数可视化富集通路的瀑布图。

　　转录组分析和可视化

　　是用R包“Estimate”(v1.0.13)进行免疫评分和间质评分。使用R包“GSVA”(v1.36.3)的ssGSEA评估28种免疫细胞在肿瘤中的相对比例，并用“ggpubr”(v0.4.0)包中的函数stat_compare_means检验差异。免疫相关基因从TIP网络服务器下载(http://biocc.hrbmu.edu.cn/TIP/)。使用R包“limma”(v3.50.0)检测差异表达基因，对数转换后的倍数改变的阈值为1。使用R包“clusterProfiler”(v3.16.1)对差异表达基因进行KEGG富集。使用包“GSEABase”(v1.50.1)进行基因集富集分析。

　　Procrustes分析

　　使用R包“vegan”(v2.5-7)进行Procrustes分析，以评估肿瘤微生物组组成与宿主基因表达之间的关系。我们根据微生物组成和基因表达矩阵来计算其BC差异度。然后，我们利用非度量多维标度(NMDS)进行降维，并设定k=2为降维数或轴数，其结果作为Procrustes分析中旋转和统计分析的输入，并使用函数protest（9999次置换）进行了显著性检验。

　　稀疏典型相关分析（Sparse CCA）和富集分析

　　为了对微生物和转录组两组数据进行综合相关性分析，我们应用稀疏CCA来识别配对宿主基因表达和微生物组数据之间的相关性，使用R包“PMA”(v1.2.1)中的CCA函数。超参数是使用CCA.permute函数调整的。稀疏CCA的相关细节详见Priya等人的描述。我们对各组内宿主基因进行通路富集分析，并用Fisher‘s精确检验进行显著性检验。使用R包“msigdbr”(v7.5.1)从MsigDB数据库下载KEGG基因集。使用Benjamini-Hochberg法校正p值以控制错误发现率(FDR)，FDR调整后的p

　　16S rRNA染色（直接标记的RNA原位杂交）

　　为了检测ACC中瘤内细菌的存在，我们在一个内部的ACC组织微阵列（TMA）芯片上进行了16S rRNA染色，该芯片包含37个福尔马林固定的样本。这些手术标本取自复旦大学附属华山医院行肾上腺切除术的ACC患者的肾上腺组织。然后，它们被福尔马林固定并包埋在石蜡中，形成FFPE块或石蜡块，可以用切片机切割，生成组织薄片，以便进行染色。为了进行下游染色，组织切片在180℃下处理4-6小时。对防护罩、刀片和相关器械进行彻底灭菌。我们采用了直接标记方法，因为使用地高辛标记的探针观察到了强烈的背景信号。简单来说，石蜡切片被脱蜡和脱水。在常温条件下使用蛋白酶K，然后使用工作液，将切片在42℃下孵化2小时。取100μM的EUB338-Cy5探针(序列：5‘-GCTGCCTCCCGTAGGAGT-3’)稀释到1μ的工作液中，在42°C中孵育12~18小时，最后进行DAPI (1：500)染色。用打乱的探针作为阴性对照，用同一组织块上的空白石蜡作为污染对照。

　　脂多糖（LPS）的免疫组织化学（IHC）

　　细菌脂多糖(LPS)免疫组织化学染色用相同的TMA块。简而言之，以5μm的厚度切片并装片，随后进行脱蜡和水化。抗原恢复后，用3%过氧化氢封闭切片。取山羊血清，以1：200倍稀释度涂抹针对大肠杆菌LPS的初级抗体(Abcam，ab35654)，再接种小鼠抗山羊抗体(Abcam，ab205719)。使用二氨基联苯胺(DAB)，切片用苏木精反染色。如前所述，该程序符合我们研究所(华山机构审查委员会，HIRB)的伦理豁免规定。

　　统计分析

　　除非另有说明，所有的分析和可视化均通过R软件(v4.0.2)运行。组间非参数统计检验采用卡方检验或Fisher精确检验。我们使用NS(p>0.05)、*0.05

　　代码和数据可用性

　　本研究的所有数据均来自公共基因数据集，未生成新的数据集。用于生成本研究的所有代码都链接到GitHub版本(https://github.com/ZhangDengwei/ACC_Project)。补充材料(图表、表格、脚本、图形摘要、幻灯片、视频、中文翻译版本和更新材料)可从在线DOI或iMeta Science http://www.imeta.science/中找到。

　　引文格式

　　Li, Yuqing, Dengwei Zhang, Minghua Wang, Haowen Jiang, Chenchen Feng, and Yong‐Xin Li. 2023. “Intratumoral Microbiota is Associated with Prognosis in Patients with Adrenocortical Carcinoma.” iMeta e102. https://doi.org/10.1002/imt2.102

　　作者简介

　　李育青（第一作者）

　　●?复旦大学附属华山医院泌尿外科博士研究生。

　　●??目前研究方向为瘤内微生物及肾癌肿瘤免疫微环境及治疗靶点的研究，相关学术成果已发表于iMeta、Journal of Experimental & Clinical Cancer Research等期刊。

　　章登位（第一作者）

　　●??香港大学化学学院博士研究生。

　　●??研究方向为人体微生物组及其代谢产物。以第一或共同第一作者在Microbiome、iMeta、Science Advances等期刊发表论文9篇。

　　冯陈陈（通讯作者）

　　●??复旦大学附属华山医院泌尿外科副主任，副主任医师、副研究员，硕士生导师。

　　●??研究方向为肾癌与肾上腺皮质癌肿瘤内微生物，近五年在Apoptosis、iMeta 等期刊发表学术论文10余篇，主持国家自然科学基金项目等课题，相关成果获得 3 项实用新型专利。

　　李泳新（通讯作者）

　　●?香港大学化学系助理教授。

　　●??研究方向在于整合生物信息学和合成生物学，挖掘微生物在疾病新疗法方面的潜力，尤其侧重于利用复杂微生物群（人类和海洋）中的生物活性分子。