肿瘤细胞免疫治疗之CAR-T技术详细介绍

　　目录

　　肿瘤细胞免疫治疗之CAR-T技术

　　1 CAR-T技术原理

　　1.1 过继性细胞治疗

　　1.2 CAR-T的治疗过程

　　1.3 CAR-T的结构

　　1.4 CAR-T的抗体结构

　　1.5 CAR-T的基因修饰方法

　　1.6 CAR-T的技术优势

　　1.7 CAR-T的技术风险与解决方案

　　2 CAR-T技术的应用

　　2.1 血液肿瘤

　　2.2 实体肿瘤

　　

　　一

　　

　　CAR-T技术原理

　　1. 过继性细胞治疗

　　过继性细胞治疗是细胞免疫治疗一个主要的研究方向。过继免疫细胞输注（adoptive cell transfer, ACT）属于肿瘤的被动免疫疗法，指的是分离肿瘤患者自体肿瘤浸润淋巴细胞( tumor-infiltrating lymphocytes，TIL)或者外周血淋巴细胞，在体外加以分选、扩增、活化，并回输至患者体内。

　　在恶性黑色素瘤和肾细胞癌，TIL是常用的ACT治疗。TIL是浸润于肿瘤中的淋巴细胞，分离后在IL-2等因子作用下进行体外扩增，最后再回输到患者体内。然而，多数情况下无法应用TIL：有些患者缺乏肿瘤标本或肿瘤和转移灶中TIL很少；获得新鲜的肿瘤组织并分离和扩增TIL 具有难度；回输的TIL 细胞功能受损，在体内往往不能有效识别肿瘤细胞; 肿瘤中强大的免疫抑制微环境降低回输细胞的杀伤能力。这些问题限制了TIL的广泛应用，仅对如恶性黑色素瘤和肾细胞癌的少数肿瘤有一定疗效，对大多数肿瘤疗效欠佳。

　　在这种情况下，ACT需要使用外周血淋巴细胞。目前使用外周血淋巴细胞的ACT包括淋巴因子激活的杀伤细胞（lymphokine activated killer cells，LAK）、细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-induced killer，CIK）、树突细胞-细胞因子诱导杀伤细胞（dendritic cells-cytokine induced killer，DC-CIK）、抗CD3抗体诱导的活化杀伤细胞（anti-CD3 antibody-induced activated killer cells, CD3-AK cells）等。然而CIK等是非特异性活化的淋巴细胞，缺乏肿瘤特异性反应能力。在这种情况下，科学家开始通过基因修饰，将识别肿瘤抗原的T细胞受体（T cell receptor, TCR）或CAR基因导入淋巴细胞使之成为TCR基因修饰T淋巴细胞（TCR-T）或CAR-T细胞，使之具备肿瘤抗原靶向识别能力。

　　

　　2. CAR-T的治疗过程

　　

　　简单来说，CAR-T治疗过程为包括从病人外周血中分离淋巴细胞T细胞，通过基因载体将肿瘤抗原特异性CAR基因转导入T细胞，生成CAR-T细胞，经体外扩增达到一定数量后静脉回输给患者。由于被转录的CAR基因编辑的功能，回输的CAR-T可以特异性结合癌症细胞，从而达到靶向治疗的作用。

　　3. CAR-T的结构

　　3.1 CARs结构总览

　　

　　CARs是靶向目标表面分子的重组受体，其结构主要包括胞外抗原结合域、跨膜区和胞内信号区三部分，对每个区域的不同设计影响CAR-T细胞功能的发挥。

　　3.2 胞外抗原结合域

　　胞外区源于单链抗体ScFv，由轻链和重链共同组成，负责抗原的识别。这种识别本质上是抗体与抗原的特异性结合，不需要依赖于MHC的递呈，有效避免了肿瘤细胞MHC表达下调这一免疫逃逸机制。CAR不仅能够识别肽类抗原，还能识别糖类和糖脂类抗原，更加广谱地杀伤肿瘤细胞。

　　目前已设计出的ScFv可识别抗原包括CD19、CD20、EGFR、Her2/neu、GD2、PSMA及RORI等。

　　3.3 跨膜区

　　跨膜区连接胞内区和胞外区，一般由二聚体膜蛋白组成，将CARs结构锚定于T 细胞膜上。

　　跨膜区的不同设计影响导入的CAR基因的表达能力。有文献证实包含CD28的TM区的CAR表达能力最强，其次是包含OX40的CAR，而包含CD3ζ的CAR表达能力最差。目前设计用于CAR的TM区主要包括H2-Kb、CD4、CD7、CD8、CD28等。

　　3.4 胞内信号域

　　胞内信号域采用免疫受体酪氨酸活化基序( immune-receptor tyrosine-based activation motifs，ITAM) ，通常是 TCRζ（CD-3ζ）或FcRγ，当胞外区ScFv与其识别的抗原结合时，就会向胞内传导 TCＲ 样信号。根据胞内区结构不同，可将CAR-T分为四代。

　　3.5 CARs结构变迁

　　根据胞内区结构不同，CARs结构经历了从第一代到第四代的变迁。

　　

　　第一代CAR只有一个胞内信号组份，主要是CD-3ζ或FcRγ。当第一代CAR受到特异性抗原识别并激发后，可为T细胞提供活化信号，并通过胞内结构域传导该信号，引起细胞的活化，表现为CAR依赖的细胞活化及细胞杀伤作用，分泌穿孔蛋白、颗粒酶及细胞因子，协同作用杀死肿瘤细胞。早期的实验证明了CAR-T的可行性，是首次不依赖人类白细胞抗原进行T细胞激活的尝试。然而，第一代CAR只能引起短暂地激活T细胞和分泌较低水平的细胞因子，不能提供长时间的T细胞扩增信号和持续的体内抗肿瘤效应。

　　为了解决这个问题，从第二代CAR开始引入了共刺激分子信号序列（costimulatory molecule，CM），如CD28、CD137（4-1BB）。与第一代CAR相比，第二代CAR含有一个活化结构域和一个共刺激区域，在保持抗原特异性一致的情况下，增强了T细胞增殖和细胞因子分泌的功能。

　　第三代CAR在前一版本上升级，胞内部分则由活化结构域和多重共刺激区域组成，具有三个胞内信号域，其中包括两个串联的共刺激域CD28、4-1BB或OX40和一个CD-3ζ。这些结构域的增加不仅能够加强CAR-T细胞特异性识别肿瘤抗原及结合等能力，更能够显著扩大由胞外区传递的细胞信号，引起下级细胞杀伤作用的级联放大，抗肿瘤能力更强。

　　第四代CAR是最近出现的新型CAR，又称TRUCKs ( fourth-generation CAR T-cells redirected for universal cytokine killing)。它的结构与前三代不同，引入促炎症细胞因子(如IL-12) 和共刺激配体( 4-1BBL 和CD40L) ，可以在具有免疫抑制性的肿瘤微环境中通过释放促炎性因子，招募并活化更多的免疫细胞而引起更为广泛的抗肿瘤免疫效应。同时，第四代CAR的出现可使患者免受回输前预处理治疗（如全身照射或大剂量化疗）的不良反应，减少回输细胞总量，拓宽了CAR-T 细胞的临床应用范围。

　　4. CAR-T的抗体结构

　　4.1 传统抗体

　　

　　传统抗体是分子量为150 k Da的四聚体多肽，由两对相同的重链（50 k Da）和轻链（25k Da）多肽组成，二者由链间的二硫键链接，形成Y型或T型结构。其中，轻链由N端的可变区（VL）和C端的一个保守的区域(CL)构成；重链由N端的可变区（VH）和三至四个恒定的区域（CH1,CH2,CH3,可能CH4）组成。

　　可变区的多样性决定了抗体的多样性与特异性，使得抗体具有结合特定抗原的能力。比较不同特异性抗体的VL和VH的氨基酸顺序显示，变异仅集中在其中少数区域的氨基酸上(15％～20％)，称为超变区。超变区是抗体的抗原结合位，与抗原决定簇的结构互补，故又称为互补决定区(complementarity－determining regions，CDRs)。

　　胞外抗原结合域源于抗体的抗原结合基序，可以连接受体上的VH和VL区域，形成单链可变区scFvs，从而特异性识别肿瘤抗原。

　　4.2 纳米抗体

　　

　　骆驼和鲨鱼类动物体内存在着天然缺失轻链的重链抗体，由体由两条同源的重链肽段组成，相对分子质量为90 kDa。如果克隆其可变区VHH，将得到只由一个重链可变区组成的单域抗体，是目前可以得到的具有完整功能的稳定的可结合抗原的最小单位，又称纳米抗体，相对分子质量仅为15 kDa，仅为常规抗体的1/10左右。

　　纳米抗体的VHH和人抗体重链可变区VH结构非常相似，其基因同源性达90%。纳米抗体VHH表面大概只有10个氨基酸和人VH不同，其中在FR2位置有四个特异的氨基酸：普通抗体的FR2中V37、G44、L45和W47这4个氨基酸残基是在进化中相当保守的疏水性残基；而在VHH中，它们突变为亲水性的氨基酸残基F37、E44、R45、G47，增加了VHH的溶解性。

　　VHH的CDR1区和骨架区FR2存在半胱氨酸残基(Cys)，可以和CDR3区中的Cys残基形成二硫桥，增加了可变区的稳定性和结构变化。VHH的FR2区中特殊的亲水性氨基酸残基的改变和CDR3区二硫键的存在，也使得其稳定性和亲水性也远远优于传统的抗体。

　　

　　相比于传统CAR-T，搭载纳米抗体的CAR-T在性能上有更多优势。

　　

　　5. CAR-T的基因修饰方法

　　稳定转染是效应T细胞稳定表达CAR的前提。目前用于CAR-T的基因转导的方法主要有逆转录病毒转导、慢病毒转导和mRNA转染。

　　逆转录病毒科包含七个成员，其中γ-逆转录病毒已成为治疗恶性肿瘤的临床基因转移常用载体。然而近年来，由于逆转录病毒转导有引起插入致瘤的风险、不能感染非分裂细胞、病毒滴度低等问题，在临床试验中已经逐渐被慢病毒转导所取代。

　　慢病毒载体含有顺式作用元件中央多聚嘌呤区，因而慢病毒不受细胞分裂的控制，能够在更广泛的细胞类型里进行有效的转导，包括静止细胞的转导。并且，慢病毒载体的整合位点更安全，转基因负荷量更大，基因毒性更小。在靶向CD19的CAR-T临床试验中，慢病毒传染的CAR-T显示出更显著的抗肿瘤效力。

　　当需要获得短暂存在的CAR-T细胞时，则需要用到mRNA转染。mRNA转染是一种快速高效的转染方式，T细胞在一周内瞬时表达，不能稳定持久存在，往往需要输注大量的T细胞才能够保证疗效。

　　6. CAR-T技术的优势

　　总的来说，从原理、结构和制作工艺上，目前的CAR-T都比TIL和TCR更有优势。

　　一、CAR-T细胞不受MHC限制，是抗原与抗体的特异性识别，能够更加有效地杀伤具备抗原特异性的肿瘤细胞。而TIL和TCR均只能识别MHC提呈的抗原，可能因肿瘤细胞下调或突变其MHC分子而逃避免疫监视，临床上有一定局限性。

　　二、CAR-T细胞疗法使用剂量比TIL和TCR-T下降了2--3个数量级。由于CAR-T细胞治疗靶点明确，具有高度识别肿瘤表面抗原的特异性，同时克服了 MHC限制性，因而在同样的治疗效果下，CAR-T疗法的单次注输细胞数量（1000万-1亿）远远少于TCR-T（10亿-100亿）和TIL（100亿-1500亿）。

　　三、CAR-T细胞疗法所需时间更短。由于同等治疗效果下CAR-T所需细胞数量更少，因而CAR-T培养T细胞所需时间最短。体外培育周期缩短至2周，大幅节约了时间成本。

　　四、CAR不仅能够识别肽类抗原，还能识别糖类和糖脂类抗原，扩大了肿瘤抗原靶点范围。出来不受MHC限制，CAR-T疗法也不受肿瘤细胞的蛋白质抗原限制，CAR-T可以利用肿瘤细胞的糖脂类非蛋白质抗原，更能够多维度识别抗原。

　　五、CAR-T具有一定的广谱可复制性。由于某些位点会在多种肿瘤细胞中表达，如EGFR，针对这种抗原的CAR基因一旦构建完成，便可以被广泛利用。

　　六、CAR-T细胞具有免疫记忆功能，能够长期在体内存活。这对预防肿瘤复发具有重要临床意义。

　　7. CAR-T技术的风险与解决方案

　　7.1 脱靶效应（off-target toxicity ）

　　脱靶效应（off-target toxicity）是所有过继性细胞免疫治疗的共性问题，它的概念要和正常组织毒性（on-target toxicity）区别开。

　　正常组织毒性指基因修饰T细胞对同样表达其靶点的正常组织的毒性。脱靶效应是指基因修饰T细胞对不表达这些靶分子的正常组织或器官的毒性。

　　如何鉴定出肿瘤细胞上合适的免疫原性的靶点，从而使得CAR-T细胞只攻击肿瘤细胞而不损伤正常组织，是CAR-T发展的关键。或者通过设计多个抗原复合的CAR结构，识别抗原组合，能够提高杀伤的特异性，如Wilkie实验室使用同时靶向抗原ErbB2和MUC1的CAR-T治疗乳腺癌。

　　7.2 细胞因子风暴( cytokine release syndrome，CRS)

　　当CAR-T细胞被回输至体内，细胞治疗过程中会释放的大量细胞因子，包括 IL-6、TNFα 和 IFNγ，这些炎性介质促发急性炎症反应诱导上皮及组织损伤，导致微血管渗漏等机体多种免疫炎症反应，称之为细胞因子风暴( cytokine release syndrome，CRS)。CRS发生于超过半数的CAR-T受试者，是最常见的不良反应之一。

　　CRS可发生于细胞输注后2-3周，常见症状为发热、寒战、疲劳、低血压、恶心、头痛、心动过速、呼吸困难，以及心、肝、肾功能异常等。

　　CRS的发生于CAR的结构、肿瘤负荷及类型以及患者基因多态性相关，可通过设计安全的CARs并严格限制每次输注的细胞数量来降低发生风险。或者可导入一个安全开关控制基因，如可诱导的Caspase 9，当此基因被某种可溶性的因子诱导表达时，可引起 CAR-T细胞凋亡，有助于降低细胞的毒性反应。并且，当CRS发生后，也可利用托珠单抗等药物进行治疗、控制。

　　7.3 神经毒性

　　另一常见且的不良反应为神经毒性。在成功利用托珠单抗治疗CRS之后，神经毒性已成为CAR-T治疗过程中的主要生命威胁事件，其发生机制仍有待探索。

　　多项临床试验曾报道包括脑梗死、谵妄、意识不清、抽搐、神经麻痹、视野缺损、共济失调、言语障碍在内的多种神经系统异常症状。

　　美国Juno Therapeutics公司正是因其临床试验中出现5例不可预期的脑水肿死亡，而不得不宣布关停“火箭计划”项目的临床试验。Juno分析推测神经毒性可能由预处理化疗药物氟达拉滨或CAR-T产品结构中的CD28共刺激结构域引起。

　　7.4 其他毒副作用

　　CAR-T尚有某些其他的毒副作用，如出凝血功能障碍、B细胞发育不良等。

　　其中凝血功能障碍主要表现为散在瘀斑瘀点、血栓形成及实验室指标异常，如血小板减少、D-二聚体升高、纤维蛋白原降低、纤维蛋白降解产物升高、活化部分凝血活酶时间延长等。

　　B细胞发育不良则主要是因为针对肿瘤细胞的靶点如CD19同样表达于正常B细胞表面，从而CAR-T细胞在清除肿瘤细胞的同时也会杀灭正常B细胞。且CAR-T细胞可在体内长期存续和发挥作用，因此患者体内可长期缺乏正常B细胞，造成丙种球蛋白低下，易形成感染。因此患者需要适当补充丙种球蛋白提高免疫力作为预防措施。

　　当CAR-T应用于实体瘤治疗时，还可能造成CAR-T细胞归巢和免疫抑制肿瘤微环境等问题。

　　

　　二

　　

　　CAR-T技术的应用

　　CAR-T细胞治疗综合运用了识别和靶向疾病的抗体技术，它是一种活体药物，不仅不会像传统药物被代谢掉，还会在病人体内复制，或者形成记忆细胞，一次给药可以延续很长时间。与单抗治疗相比，CAR-T细胞治疗具有许多优势，如强大的体外扩增能力、体内存续时间久、针对低表达量的靶分子仍然有效等。

　　CAR-T细胞治疗目前已成功运用于多种肿瘤疾病的临床试验中，包括多数血液肿瘤以及肾脏肿瘤、肝脏肿瘤、神经肿瘤等实体瘤。

　　1血液肿瘤

　　1.1 B系白血病

　　因血液肿瘤的特殊性质及靶点特异性，CAR-T细胞治疗法目前在血液系统恶性肿瘤治疗中取得了巨大的突破。

　　靶向CD19的CAR-T研究最多，首先被尝试用于治疗B细胞性恶性肿瘤（CD19阳性），包括复发难治性的B急性淋巴细胞白血病(B-acute lymphoblastic leukemia, B-ALL)、慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia, CLL)和B细胞淋巴瘤(B-cell lymphomas)。CD19在大多数B细胞恶性肿瘤细胞高表达, 在正常B细胞、滤泡状树突细胞和浆细胞中微弱表达，在造血干细胞中无表达。

　　2017 年7 月12 日，首个用于复发或难治性儿童/成人B-ALL的CAR-T细胞疗法CTL-019 获美国FDA专家咨询委员会全票通过，成为CAR-T疗法在血液肿瘤临床试验上的重要里程碑。其样本量为63，在关键临床试验中3个月应答率为82%，6个月生存率为89%，12个月生存率为79%，显示出CAR-T细胞疗法的显著效果，具备上市能力。诺华公司的该产品Kymriah获批用于治疗儿童和年轻成人(2~25岁)的急性淋巴细胞白血病，定价47.5万美元。

　　科学家进行了大量CAR-T 细胞治疗血液肿瘤的临床试验。

　　

　　除了CD19外，还有一些临床前研究针对白血病寻找新的靶抗原。如Haso构建了靶向CD22的二代CAR-T，在体外对CD22+ALL细胞株和患者原始细胞特异性杀伤，在体内也可延长CD22lowCD19high 模型小鼠的存活时间。另外，CD23或ROR1也被临床前研究用于治疗CLL。

　　1.2 急性髓系白血病

　　CAR-T 的出现为B 系白血病的治疗提供了新的治疗方案，然而在急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）的研究上，近50年的的治疗方案都未有突破。目前针对AML的潜在靶点包括LeY、CD33、CD123、CD44v6、FRβ，但进展缓慢。

　　截止2018年7月23，clinicaltrials.gov已注册的针对AML的CAR-T临床试验只有12例项目，以CD23和CD123靶点治疗AML研究最多。其中完成的只有1例针对CD123靶点的CAR-T疗法，该项目有患者12例。

　　

　　1.3 多发性骨髓瘤

　　多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是血液系统中第二大常见恶性肿瘤，源自浆细胞恶变，多发于中老年患者。它主要通过侵犯骨髓，产生溶骨性病变。临床以骨痛、病理性骨折、贫血、出血、反复感染和免疫球蛋白异常为特征性功能损害。美国癌症协会预估，2017年美国将有超过30,200新增多发性骨髓瘤病历，并有12590名患者因为这个疾病而去世。这种疾病的预后一般，经诊断后的5年生存率约为50%。其标准治疗包括化疗、放疗和干细胞移植，虽然有一定疗效，但MM目前认为仍是不可治愈的疾病。近几年，越来越多的CAR-T研究在此领域开始拓展。

　　从2012年开始，宾大和诺华公司合作，第一次开始研究针对BCMA靶点的CAR-T用于治疗MM。B细胞成熟抗原（BCMA），多数在MM中表达，而在非浆细胞中不表达。并且BCMA信号途径能诱导浆细胞增殖与生存，即下调MM细胞中的BCMA表达，可逃避CART细胞对其检测和限制肿瘤的进展。

　　2017年8月10日，Kite Pharma宣布，其靶向BCMA的CAR-T疗法KITE-585的IND申请已获FDA批准，将开展1期临床试验。

　　2017年12月11日，南京传奇生物科技有限公司申请的一款靶向BCMA的CAR-T疗法“LCAR-B38M CAR-T细胞自体回输制剂”新药注册申请正式获CFDA受理，是国内第一款提交的CAR-T临床申请。该药的研究显示，35名既往治疗后复发的MM患者中，有33人(94%)在接受试验性抗BCMA CAR-T细胞(LCAR-B38M)治疗后2个月获得临床缓解，骨髓瘤客观缓解率达到100%。值得一提的是，南京传奇使用的是拥有自主知识产权的搭载纳米抗体的靶向BCMA CAR-T疗法。

　　除开CAR-T领域，2017年11月，GSK的抗BCMA单克隆抗体-药物偶联物（ADC）GSK2857916作为单药疗法已被FDA授予用于既往接受至少3种疗法治疗失败（包括一种抗CD38抗体疗法，以及对一种蛋白酶抑制剂和一种免疫调节剂难治）的多发性骨髓瘤（MM）患者的突破性药物资格（BTD）。该药将化疗药MMAF和单克隆抗体结合起来阻滞BCMA，总反应率为60%（35位患者中有21例反应），其中PR占51%。该药之前也在2017年10月被EMA授予优先药物资格；且被FDA和EMA都授予了治疗MM的孤儿药地位。这一情况也为BCMA靶点作为治疗MM的CAR-T研究提供了学术支持。

　　另外，科学家也在积极研究靶向CD19、CD138z、LeY、CD56、NY-ESO-1、CD38、CS1等靶点的CAR-T疗法对MM的特异性杀伤作用。

　　1.4 淋巴瘤

　　淋巴瘤主要可以分为霍奇金淋巴瘤（Hodgkin’s lymphoma，HL） 和非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphomas，NHL）两类。其中NHL 包括套细胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma，MCL）、滤泡性淋巴瘤（follicular lymphoma，FL）、弥漫大B 细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）、Burkitt’s 淋巴瘤（Burkitt’s lymphoma，BL）、边缘区淋巴瘤（marginal zone lymphoma，MZL）。

　　NHL占所有淋巴癌的80-90%，美国每年诊断出约72000例NHL新病例，DLBCL约占三分之一。

　　CAR-T 在淋巴瘤中的应用主要针对CD19、CD20、CD70、CD38 几个靶点，其中CD19 最为常用。

　　2017年10月18日，FDA批准了第二个CAR-T上市，即Kite Pharma公司开发的一种靶向CD19的CAR-T疗法Yescarta，也是首款获批用于治疗NHL的基因疗法，定价37.3万美元。FDA公布，其样本量为101，经Yescarta治疗的完全缓解率达到51%，即51%患者的癌细胞完全清除，值得注意的是，有两例患者出现了脑水肿死亡。FDA批准Yescarta，是CAR-T治疗复发性或难治性大型B细胞淋巴瘤的里程碑。2017年12月5日，复星医药与Kite Pharma在中国合资成立复星凯特，由此获得Yescarta在中国的商业化权利以及后续产品的优先授权。今年5月，该产品已收到CFDA的《受理通知书》。

　　另外，诺华的Kymriah (CTL019)也被评估其在 r/r DLBCL 中的疗效。数据显示：81例患者在3个月或更早时间的随访中，总体有效率(ORR)为53%，完全缓解率(CR)为40%，部分缓解率(PR)为14%。Kymriah输注6个月后，总体有效率(ORR)为37%，完全缓解率(CR)为30%，，部分缓解率(PR)为 7%。

　　美国时间2018年5月1日，美国FDA批准诺华用于治疗复发或难治性大B细胞淋巴瘤的成人患者(先前接受过两次或以上的系统治疗)的CAR-T细胞治疗药物Kymriah (tisagenlecleucel，CTL019)第二个适应症。

　　除了CD19，CD20也是常用的靶点。2008年，Till实验室首次尝试用CD20zCAR-T治疗淋巴瘤，然而研究中的5例患者均未达到缓解。2012年，Till又构建CD20.CD28.41BB.z CAR-T，在3例MCL患者中2例得到完全缓解，并分别维持12 个月和24 个月；1例FL患者达到部分缓解。

　　

　　2. 实体肿瘤

　　一直以来，CAR-T细胞在治疗实体瘤中的临床疗效不佳，主要原因有：

　　一、肿瘤特异性抗原的选择。现在已发现的CE2、HER2等靶点都有脱靶效应的风险，研究更加有特异性的靶点是未来的重点。

　　二、T细胞难以归巢到肿瘤部位。CAR-T细胞要达到肿瘤细胞，需要穿过细胞外基质，再克服免疫抑制微环境，当CAR-T细胞到达肿瘤时，数量和活性已经减低。为了提高CAR-T细胞的归巢能力，可使CAR-T细胞高表达肝素酶。

　　三、实体瘤高度免疫抑制微环境。肿瘤细胞能够利用肿瘤抗原缺失、共刺激信号异常、MHC类分子表达低下、肿瘤分泌的免疫抑制因子(IL-10、TGF-B、IL-33等)以及肿瘤微环境中各种免疫抑制性细胞等多种途径抑制免疫细胞的活性, 导致肿瘤微环境中的免疫系统耐受, 因此患者自身的免疫应答常不能抑制肿瘤生长。为促进CAR-T细胞在肿瘤微环境的存活，可导入具有趋化因子RANTES和细胞因子IL-15的溶瘤病毒。

　　四、实体瘤是一群异质性肿瘤细胞，不同突变肿瘤细胞上的靶点不一样，单一种类的CART很难杀光全部肿瘤细胞。

　　五、实体瘤内部结构复杂且致密，CART进入不充分。特别是脑部的肿瘤，还需CAR-T能够穿过血脑屏障。

　　目前，随着CAR-T代数的更迭，CAR-T在增殖、细胞因子释放等方面有了明显改进，越来越多的临床试验开始尝试将CAR-T用于实体瘤的治疗。

　　Pule等将GD2作为靶抗原，利用第二代CAR修饰EBV特异性T细胞治疗儿童神经细胞瘤。接受治疗的11例患者中，6例肿瘤减退或肿瘤细胞坏死。Ahmed等利用HER-2特异性的二代CAR-T治疗HER-2（+）复发转移肉瘤。接受治疗的19例患者中，4例病情稳定，存活时长12 周至14个月。

　　另外，具有代表性的抗原靶点还包括mesothelin，用于治疗间皮瘤、胰腺癌、卵巢癌、肺癌；CEA，用于治疗肺癌、结肠癌、胃癌、乳腺癌和胰腺癌；MUC-1，用于治疗肝癌、肺癌、胰腺癌、结肠癌、胃癌; GPC3，用于治疗肝癌; EGFＲvII，用于治疗神经胶质瘤、头颈部肿瘤；PSMA，用于前列腺癌等。