荧光显微光谱成像系统及教学设计

　　原创 刘东奇 鄢小卿 等 物理与工程

　　摘要

　　本文介绍了一种自组荧光显微光谱成像系统。该系统性能稳定、功能多样，可以实现空间显微分辨和光谱探测功能的有机结合，具有白光照明成像、激光激发荧光成像、显微光谱成像、荧光光谱探测和应力调控等功能。实验结果表明，该系统的光学分辨率 385nm，光谱分辨率小于 1nm，可以完成量子点和单层二维材料的荧光光谱探测、白光照明成像和显微光谱成像等。依托该系统设计开展的实验内容充足、层次分明，可满足不同学生的学习需求，为目前国内荧光光谱相关的物理实验教学提供思路。

　　关键词 荧光光谱；显微成像；光谱成像

　　Abstract In this paper, a home-built fluorescence microscopic spectral imaging system is introduced. The system has stable performance and diverse functions, and realizes the combination of spatial microscopic resolution and spectral detection. It has the functions of white light illumination imaging, laser excitation fluorescence imaging, microscopic spectral imaging, fluorescence spectrum detection, strain control and so on. The experimental results show that the optical resolution of the setup is 385nm, and the spectral resolution is less than 1nm. It can complete the fluorescence spectrum detection, white light illumination imaging and microscopic spectral imaging of quantum dots and monolayer two-dimensional materials. The abundant and multi-leveled experiment content based on the system can meet the learning needs of different students and provide helpful ideas for fluorescence spectrum related physics experiment teaching.

　　显微光谱成像技术可以用于分析待测样品的光谱成分，并对该样品选定区域直接进行光谱图像的采集，给出该样品的光谱成分信息和空间位置信息的一一对应关系，可以为细胞成像、生物组织成像、药物筛选和癌症检测等领域提供光学显微分辨率下待测样品的光谱信息和空间定位信息[1-8]。

　　随着国家强基计划的实施，国内众多高校聚焦于通过研究型物理实验提高学生的科研能力[9-11]。目前，我国大学物理实验教学中对于显微光谱探测等内容尚不普及。我们在学校自制实验教学仪器设备项目和后续滚动培育项目等的支持下，前期在物理实验教学中心已完成了荧光显微装置的设计搭建[12]、光谱成像功能的引入[13]等工作。在后续工作中，我们进一步优化了装置的光路，拓展了显微多光谱成像功能、透射和反射两种方式白光照明成像功能、样品应力调控功能等。目前，该自制的荧光显微光谱成像实验系统实现了空间显微分辨能力和光谱探测能力的优势互补，不仅可以完成光学分辨率下的空间成像和位置定位，还可以对柔性样品施加可控应力，提供样品的多光谱成分分析，对不同光谱成分进行微区成像。该实验系统在今年举办的第 56 届中国高等教育博览会上荣获全国高校教师教学创新大赛——第六届全国高等学校教师自制实验教学仪器设备创新大赛自由设计类二等奖。同时，我们依托该实验系统开展了多种适宜的荧光材料的测试表征和研究，进一步扩展了基于该实验系统的物理实验内容。本文主要根据这些研究进展在物理实验教学中设计了分层次的教学内容。

　　1 实验系统及功能

　　荧光显微光谱成像实验系统的装置实物图和光路图如图 1 所示。图中的光源包括白光照明光源和激光激发光源。白光光源有两种放置位置，可以分别实现透射式和反射式白光照明成像。激光激发光源经过双色镜、扫描振镜、物镜聚焦在样品上，通过振镜控制激光光束的照射位置，样品受激发射的荧光经同一个物镜收集进入后方的光谱仪或成像相机，获取荧光光谱或监测激光光斑的照射位置。通过计算机控制光谱仪和振镜的联动，可以获取光谱图像。

　　

　　目前，该实验系统具有白光照明成像、激光激发荧光成像、荧光光谱探测、显微光谱成像、应力调控等五大功能，如图 2 所示。其中，白光成像可以对透明样品进行透射式成像，也可以对不透明样品实现反射式成像；显微光谱成像通过有序控制振镜和光谱仪可以对单一荧光样品实现微区光谱成像，也可以对多种荧光样品进行显微多光谱成像；应力调控可以对柔性样品进行弯曲应变和拉伸应变等。

　　

　　在样品处，放置样品的三维平移台可以调节样品成像区域和激光光束的聚焦状况。同时，三维平移台上安装了可以对样品施加应力的装置，应力装置示意图和实物图如图 3 所示。实验时，将二维层状荧光样品放置在柔性衬底上，通过控制平移台移动实现对柔性衬底施加可控应力，衬底发生形变，引起二维样品的拉伸或收缩，实现对样品的应力调控。

　　

　　2 系统性能和应用

　　利用标准光学分辨率板对该实验系统进行测试，测试结果表明，在数值孔径为 0.8 的 60× 物镜下，该实验系统可以分辨 1300lp/mm 的线对，如图 4（a）所示，光学分辨率 385nm，表明该实验系统可以清晰分辨微米级样品。图 4（b）是该实验系统测试的 632.8nm 氦氖激光器的光谱，从图中可以看到，光谱谱线半高宽为 0.84nm，表明该实验系统的光谱分辨率小于 1nm。另外，该实验系统的光谱范围可以覆盖 400nm 至 1050nm[12]。

　　

　　以三种核壳量子点为荧光测试样品，所用衬底为石英衬底，分别标记为 QD1、QD2 和 QD3，对应的量子点分别为 CdSe/ZnS、CdTe/CdSe/ZnS、CdTe/CdSe/ZnS，其中 QD2 和 QD3 的粒径不同。所选取的量子点样品均可以被 532nm 激光激发发出荧光。图 5（a）（b）（c）分别是三种量子点 QD1、QD2、QD3 样品的荧光光谱曲线，光谱采集时间 1s，激光功率 200μW。从图中可以看到，三种量子点样品的荧光峰值分别位于 585nm、652nm、808nm 处，半高宽分别为 52nm、35nm、84nm。表明该自制系统可以完成不同荧光样品的荧光光谱测试。

　　

　　为了验证该实验系统的显微多光谱成像功能，进一步对混合有上述三种量子点的荧光样品进行了测试。首先，将白光光源切入主光路，通过显微成像系统对样品进行白光照明成像，选定合适的样品区域；接着，将激光光源切入主光路，通过程序控制扫描振镜和光谱仪之间的联动，逐点扫描选定区域的荧光样品，光谱仪采集相应的光谱数据，单点的光谱数据采集时间为 10ms；采集得到的数据通过编写的数据自动存储和数据处理程序模块进行实时的光谱图像呈现。

　　图 6（a）是样品选定区域的整体光谱图像，图中绿色区域显示含有 QD1 样品，红色区域为 QD2 样品，蓝色区域为 QD3 样品。进一步结合同一样品区域的白光照明图像，如图 6（b）所示，可以看到该区域所采集的光谱图像和白光照明图像的整体形貌是相互吻合的，并且所得的光谱图像可以进一步给出更多的样品成分信息。比如，从图 6（a）中可以看到该区域右侧主要为绿色区域，表明含有 QD1 量子点样品；而红色区域内有部分绿色区域，表明含有 QD2 量子点样品的区域内某些特定区域也含有 QD1 量子点样品。这表明该实验系统可以完成选定区域的白光成像和显微多光谱成像，并且给出样品光谱信息的空间分布情况。

　　

　　为了进一步拓展荧光显微光谱成像系统的应用范围，我们以 WSe2 为例，展示该实验系统在二维荧光材料中的实际应用效果。图 7 是在 532nm 激光激发下单层 WSe2 样品的荧光光谱曲线，采集时间 1s。从图中可以看到，单层 WSe2 样品的荧光峰处于 745nm，与文献报道结果一致[14,15]。随后，对该区域样品进行显微光谱成像，如图 8（a）所示。从图中可以看到，该单层 WSe2 样品呈三角型，尺寸约 14μm。这与白光照明成像结果图 8（b）是相互对应的。这些结果表明，该实验系统可以完成微米级尺寸的二维荧光样品荧光光谱采集和显微光谱成像，基于此可以进一步研究不同样品或不同条件下，比如应力作用下，二维材料的荧光性能、激子行为和分布情况等[16,17]。

　　

　　

　　3 实验教学设计

　　目前，该荧光显微光谱成像实验系统功能多样，运行稳定，结果可靠，且可以与前沿科学研究紧密联系，已在我们的物理实验课程中进行了初步尝试。实际教学中发现不同学生的知识储备、动手能力、教学需求等都不尽一致，针对不同学生需要设计不同水平的实验内容，以期实现教学效果的提升。

　　结合前期的教学经验和现在的实验结果，我们对依托该实验系统的实验教学课程进行了分层次的实验教学设计。具体的实验内容设计和课程设计如表 1 和表 2 所示。我们将实验教学内容设为 4 个层次，分别为基础内容、应用内容、拓展内容和创新内容。基础内容主要包括装置的原理、调节和基本的性能指标测试等内容；应用内容主要包括各类荧光材料的成像和光谱测试。这两类内容与目前物理实验课程中的光谱仪相关教学内容可以直接衔接，有机地将光谱探测技术和荧光显微技术整合起来引入物理实验教学中。实验可以实现光谱探测和空间显微分辨功能的有效结合，并且应用到零维、一维、二维和三维等的荧光材料中，获取各类样品的空间位置信息和光谱信息，实现光学分辨率下的空间成像和位置定位，以及光谱成分分析和微区光谱成像等。

　　

　　

　　拓展内容主要包括显微多光谱成像、荧光性能调控以及装置的性能指标改善等；创新内容主要包括新样品或新条件下的能带调控、激子行为等的研究以及装置功能模块的扩展等。拓展内容和创新内容对学生的实验装置熟悉程度和知识储备都有较高的要求，且一般需要较多的实验时间才能完成，尤其是创新内容，更需要课前相关文献的搜集整理和课后实验数据的处理和研究报告撰写。该实验课程的部分内容可以开设为物理本科生的基础物理实验和近代物理实验，或者物理本科生、理工科伯苓班本科生或研究生的创新物理实验，也可以开设成本科生的毕业设计。循序渐进的实验内容设计有利于学生对新装置和新内容的理解、掌握。实验内容可以针对不同学生进行选取，实验课时可灵活设置。

　　4 结语

　　该自制的荧光显微光谱成像系统结构紧凑、性能稳定，实现了空间显微分辨和光谱探测功能的有机结合，具有白光照明成像、激光激发荧光成像、荧光光谱探测、显微光谱成像、应力调控等功能，可以对零维、一维、二维、三维荧光材料进行空间定位和光学成像，以及荧光光谱探测和显微光谱成像等。依托该自制荧光显微光谱成像实验系统设计了分层次的实验教学内容，可以将荧光显微技术和光谱成像技术引入物理实验教学中，所开展的实验内容既包含基础和应用内容，也包含拓展和创新内容，实验设计层次清晰，可满足不同学生的学习需求。同时，与前沿科学研究联系紧密，可以直接用于热点荧光材料和新荧光材料的相关荧光性能的研究。

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　　基金项目：高等学校教学研究项目（DJZW201909hb，DJZW202010hb）；港澳与内地高等学校师生交流计划项目（202111120070）；南开大学自制实验教学仪器设备滚动培育项目（2018NKZZYQ25）；国家基础科学人才培养基金项目（J1210027）；南开大学物理基地能力提高项目（J1103208）。

　　作者简介：刘东奇，男，南开大学实验师，研究方向为物理实验、光子学与光学成像。

　　通讯作者：王槿，女，南开大学高级实验师，研究方向为物理实验、仪器仪表及生物医学光子学，wangjin8208@nankai.edu.cn。

　　引文格式: 刘东奇, 鄢小卿, 惠王伟, 等. 荧光显微光谱成像系统及教学设计[J]. 物理与工程, 2022, 32(6): 5-10, 20.

　　Cite this article: LIU D Q, YAN X Q, HUI W W, et al. Fluorescence microscopic spectral imaging system and teaching design[J]. Physics and Engineering, 2022, 32(6): 5-10, 20. (in Chinese)

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