用于eEF1A2的基因疗法载体及其用途的制作方法

　　用于eef1a2的基因疗法载体及其用途1.相关申请交叉引用2.本技术要求于2020年7月23日提交的美国临时专利申请序列号63/055,775的优先权的权益，所述美国临时专利申请在此通过引用整体并入。3.关于序列表的声明4.与本技术相关的序列表以文本形式提供以代替纸质副本，并且特此通过引用并入本说明书中。含有序列表的文本文件的名称为ropa_019_02wo_st25.txt。所述文本文件为约101千字节，于2021年7月20日创建，并通过efs-web以电子方式提交。背景技术：5.eef1a2基因编码真核伸长因子1，α-2(eef1a2)，一种参与蛋白质合成、抑制细胞凋亡并调节肌动蛋白功能和细胞骨架结构的蛋白质。小鼠和人类直系同源物在463个氨基酸位置中的462个位置处具有同一性。eef1a2是一种潜在的癌基因，因为它在卵巢癌中过表达。在卵巢癌研究中，实验性地使用编码eef1a2的慢病毒载体转导永生化的卵巢表面上皮(iose)细胞，从而证明eef1a2促进非致瘤前体细胞中的肿瘤发生。sun等人《国际癌症杂志(int j cancer.)》123(8):1761–176(2008)。6.eef1a2在中枢神经系统(cns)以及心脏和肌肉中高度表达。小鼠中eef1a2的完全丧失导致运动神经元变性，这种表型被称为“废弃”，其基因型被称为wst。davies等人《科学报告(sci rep.)》7:46019(2017)。人类eef1a2基因中的点突变最近已被证明可导致癫痫、智力残疾和/或自闭症。cao等人《人类分子遗传学(human molecular genetics.)》26(18):3545–3552(2017)；lam等人《分子遗传学与基因组医学(mol genet genomic med.)》4(4):465-74(2016)；nakajima等人《临床遗传学(clin genet.)》87(4):356-61(2015)。7.利用携带野生型eef1a2的转基因小鼠在细菌人工染色体(bac)上的实验已经证实，当在发育过程中存在时，野生型eefl1a2补充了wst基因型。newbury等人《生物化学杂志(j.bio.chem.)》282:2891-50(2007)。8.eef1a2相关疾病很少见。全世界只有大约100人被鉴定为具有eef1a2突变。对疾病的病因仍然知之甚少。因此，尚不清楚是否可以通过出生后表达野生型eef1a2来挽救疾病表型。此外，向cns提供基因疗法具有挑战性且不可预测。9.对用于eef1a2相关疾病的疗法存在未满足的需求。本文提供的基因疗法满足了这一需求。技术实现要素：10.本发明总体上涉及神经疾病或病症的基因疗法，其使用编码eef1a2或其功能变体的多核苷酸的基于腺相关病毒(aav)的递送。11.在一方面，本公开提供了一种重组腺相关病毒(raav)病毒粒子，其包括衣壳和载体基因组，其中所述载体基因组包括与启动子操作性地连接的编码eef1a2蛋白或其功能变体的多核苷酸序列。所述启动子可以是神经元特异性启动子，例如，人突触素1(hsyn)启动子。所述衣壳可以是aav9衣壳或其功能变体。可以使用其它启动子或衣壳。12.在另一方面，本公开提供了一种治疗和/或预防有需要的受试者的神经疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用本公开的raav病毒粒子或其药物组合物。所述raav病毒粒子可以脑内和/或静脉内施用。13.在另一方面，本公开提供了一种在有需要的受试者的脑中表达eef1a2的方法，所述方法包括向所述受试者施用本公开的raav病毒粒子或其药物组合物。所述raav病毒粒子可以脑内和/或静脉内施用。14.在另外的方面，本公开提供了多核苷酸(例如，载体基因组)、药物组合物、试剂盒和其它组合物和方法。15.下文的详细描述中公开了各个其它方面和实施例。本发明仅由所附权利要求限制。附图说明16.图1示出了eef1a2的结构域图，所述结构域图示出了与疾病相关的点突变。17.图2示出了载体基因组的非限制性实例的载体图。18.图3示出了载体基因组的非限制性实例的载体图。19.图4示出了载体基因组的非限制性实例的载体图。20.图5示出了载体基因组的非限制性实例的载体图。21.图6示出了载体基因组的非限制性实例的载体图。22.图7示出了在新生儿注射、脑内(ic)或静脉内(iv)施用aav9-hsyn-eef1a2-2a-egfp或对照后，小鼠的免疫荧光显微镜检查。比例尺，300μm。23.图8a示出了在新生儿注射、脑内(ic)或静脉内(iv)施用aav9-hsyn-eef1a2-2a-egfp或对照后，小鼠的免疫组织化学分析。图8b示出了相同载玻片的放大视图。比例尺，300μm。24.图9a示出了与脑内(ic)、静脉内(iv)或两者的组合(ic+iv)治疗的小鼠相比，未经治疗的wst/wst(无效)小鼠中的存活期。25.图9b示出了与脑内(ic)、静脉内(iv)或两者的组合(ic+iv)治疗的小鼠相比，未经治疗的wst/wst(无效)小鼠中的重量减轻。26.图9c示出了与脑内(ic)、静脉内(iv)或两者的组合(ic+iv)治疗的小鼠相比，未经治疗的wst/wst(无效)小鼠中的转棒仪测试。27.图9d示出了与脑内(ic)、静脉内(iv)或两者的组合(ic+iv)治疗的小鼠相比，未经治疗的wst/wst(无效)小鼠中的倒置网格测试。28.图9e示出了与脑内(ic)、静脉内(iv)或两者的组合(ic+iv)治疗的小鼠相比，未经治疗的wst/wst(无效)小鼠中的eef1a2表达。比例尺，125μm。29.图9f示出了与脑内(ic)、静脉内(iv)或两者的组合(ic+iv)治疗的小鼠相比，未经治疗的wst/wst(无效)小鼠中的eef1a2表达。30.图10a-10k示出了以2e1011 vg/动物施用的aav9载体的比较，包括图2(“v1”)、图3(“v2”)、图4(“v3”)和图6(“v4”)中所示的载体基因组。31.图10a示出了fbs治疗的野生型、wst/wst、脑室内治疗的wst/wst动物用v1、v2、v3和v4基因疗法治疗的kaplan-meier存活图。32.图10b示出了小鼠的重量(数据均值±s.e.m.)。每天称重动物直到出生后35岁，此后每周称重，直到定时处死点p60或人道终点15％的重量减轻。33.图10c示出了在第p15天通过倒置网格进行的肌肉力量评估。34.图10d示出了在第p15天通过转棒进行的肌肉力量评估。35.图10e示出了在第p23天通过倒置网格进行的肌肉力量评估。36.图10f示出了在第p23天通过转棒进行的肌肉力量评估。37.图10g示出了以野生型fbs(调配物缓冲溶液)为生理参考通过自由浮动免疫组化学对整个脑的eef1a2的代表性免疫染色(每组n＝4-5，比例尺250μm)。38.图10h示出了在共表达eef1a2的神经元(neun标志物)皮质脑区中的代表性免疫组织荧光(每组n＝4.5，200μm)。39.图10i示出了脑中eef1a2的代表性免疫印迹，其中定量示出了eef1a2在整个脑中的表达，与v4载体相比，所有基因疗法载体在中脑、小脑和后脑区域中的表达更高(数据均值±s.e.m.、双向anova)。40.图10j示出了前脑中的人eef1a2转录本表达的qpcr，其示出v1载体的最高mrna表达(数据均值±s.e.m.、双向anova)。41.图10k示出了皮层中的人eef1a2皮层表达的qpcr，其示出v1载体的最高mrna表达(数据均值±s.e.m.、双向anova)。42.图11a-11c43.图11a示出了fbs治疗的野生型、fbs治疗的d252h/+、敲除(d252h-/-)、脑室内v3基因疗法治疗的d252h-/-的kaplan-meier存活图(野生型fbs，n＝12，d252h/+fbs，n＝5，d252h-/-fbs，n＝4和2x 1011vg/幼崽，v3治疗，n＝5)。44.图11b示出了体重随时间的变化(数据均值±s.e.m.、单向anova和邓尼特多重比较)。45.图11c示出了通过转棒进行的运动评估(数据均值±s.e.m.、双向anova和邓尼特多重比较)。46.图12a示出了接受v3高剂量的del22ex3(2x 1011vg/幼崽，n＝5)、接受v3低剂量的del22ex3(2x 1010vg/幼崽，n＝5)、接受调配物缓冲溶液的del22ex3对照(n＝3)和接受调配物缓冲溶液的野生型对照(n＝6)的kaplan-meier存活图。47.图12b示出了体重随时间的变化(数据均值±s.e.m.)。48.图12c示出了通过握力测压p22-25进行的运动评估(数据均值±s.e.m.)49.图12d示出了p23处的握力测压(数据均值±s.e.m.、双向anova和tukey多重比较)。50.图12e示出了通过转棒仪p22-25进行的运动评估(数据均值±s.e.m.)51.图12f示出了p24处的转棒仪数据(数据均值±s.e.m.、双向anova和tukey多重比较)。52.图12g示出了来自p21-25的神经学评分。具体实施方式53.小节标题仅是为了组织目的并且不应该被解释为将所描述的主题限于特定方面或实施例。54.除非另外定义，否则本文所使用的所有技术术语和科学术语的含义与本发明涉及的领域的普通技术人员通常理解的含义相同。虽然类似于或等同于本文所描述的那些方法和材料的方法和材料可以用于本发明的实践中，但是下面描述了合适的方法和材料。本文所提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献通过引用以其全部内容明确地并入。在发生冲突的情况下，应以本说明书(包含定义)为准。另外，本文所描述的材料、方法和实例仅是说明性的，而非限制性的。55.本文提及的所有出版物和专利均通过引用以其全文并入本文，就如同每个单独的出版物或专利被明确地且单独地指出通过引用并入一样。在冲突的情况下，以本技术(包含本文中的任何定义)为准。然而，对本文所引用的任何参考文献、文章、出版物、专利、专利出版物和专利申请的提及不被视为并且不应当被视为对其构成有效的现有技术或形成世界上任何国家的公知常识的一部分的承认或任何形式暗示。56.在本说明书中，任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应当理解为包含所述范围内的任何整数的值，以及在适当时其分数(如整数的十分之一和百分之一)，除非另有说明。当紧接在一个数字或数值之前时，术语“约”意指所述数字或数值的范围为加或减10％。应当理解，如本文所使用的，术语“一个/种(a和an)”是指所列举的组分中的“一个或多个”，除非另有说明。替代方案(例如，“或”)的使用应理解为意指替代方案中的任一者、两者或其任何组合。术语“和/或”应理解为意指替代方案中的一者或两者。如本文所使用的，术语“包含”和“包括”同义地使用。57.如本文所使用的，术语“同一性”和“相同”相对于多肽或多核苷酸序列是指“查询”序列与“受试者”序列的比对，如提供blast算法生成的比对中精确匹配残基的百分比。除非另有说明，否则跨受试者序列的全长计算同一性。因此，如果当查询序列与受试者序列比对时，受试者序列中的残基的至少x％(向下四舍五入)作为精确匹配与查询序列中的对应残基比对，则查询序列“与受试者序列具有至少x％的同一性”。当受试者序列具有可变位置(例如，表示为x的残基)时，与查询序列中的任何残基的比对被计算为匹配。58.如本文所使用的，“aav载体”或“raav载体”是指包括一种或多种所关注的多核苷酸(或转基因)的重组载体，所关注的多核苷酸侧接aav末端重复序列(itr)。当存在于已被对rep和cap基因产物进行编码和表达的质粒转染的宿主细胞中时，这种aav载体可以被复制并包装成感染性病毒颗粒。可替代地，可以使用已经被稳定地工程化以表达rep和cap基因的宿主细胞将aav载体包装成感染性颗粒。59.如本文所使用的，“aav病毒粒子”或“aav病毒颗粒”或“aav载体颗粒”是指由至少一种aav衣壳蛋白和衣壳化的多核苷酸aav载体构成的病毒颗粒。如本文所使用的，如果所述颗粒包括异源多核苷酸(即，除野生型aav基因组以外的多核苷酸，如待递送给哺乳动物细胞的转基因)，则其通常被称为“aav载体颗粒”或简单地称为“aav载体”。因此，aav载体颗粒的产生必然包含产生aav载体，如此aav载体颗粒内含有载体。60.如本文所使用的，“启动子”是指能够促进从真核细胞中的多核苷酸起始rna转录的多核苷酸序列。61.如本文所使用的，“载体基因组”是指由载体(例如，raav病毒粒子)包装的多核苷酸序列，包含侧接序列(在aav中，反向末端重复序列)。术语“表达盒”和“多核苷酸盒”是指侧接itr序列之间的载体基因组的部分。“表达盒”意味着载体基因组包括编码与驱动表达的元件(例如，启动子)可操作地连接的基因产物的至少一个基因。62.如本文所使用的，术语“有需要的患者”或“有需要的受试者”是指有疾病、病症或病状风险或患有疾病、病症或病状的患者或受试者，所述疾病、病症或病状适于用本文公开的重组基因疗法载体或基因编辑系统治疗或改善。例如，有需要的患者或受试者可以是被诊断患有与中枢神经系统相关的病症。受试者可能具有eef1a2基因突变或eef1a2基因的全部或部分缺失，或基因调控序列缺失，这些导致eef1a2蛋白表达异常。“受试者”和“患者”在本文中可互换使用。通过本文所描述的方法治疗的受试者可以是成人或儿童。受试者可能年龄不等。63.如本文所使用的，术语“变体”或“功能变体”可互换地是指与保留亲本蛋白的一种或多种期望活性的亲本蛋白相比具有一个或多个氨基酸取代、插入或缺失的蛋白质。64.如本文所使用的，“遗传破坏”是指基因中的部分或完全功能丧失或异常活动。例如，受试者可能遭受eef1a2基因表达或功能的遗传破坏，该基因在受试者的至少某些细胞(例如，神经元)中降低表达或导致eef1a2蛋白功能丧失或异常。65.如本文所使用的，“治疗”是指改善疾病或病症的一种或多种症状。术语“预防”是指延迟或中断疾病或病症的一种或多种症状的发作，或减缓eef1a2相关神经系统疾病或病症的进展。66.eef1a2蛋白或多核苷酸67.本公开考虑了与伸长因子1-α2(eef1a2)蛋白相关的组合物和使用方法。已知eef1a2中的各种突变(如图1所示)与神经系统病症有关，包含癫痫、智力残疾和/或自闭症。已经观察到遗传突变和新生突变。在一些情况下，杂合错义突变足以引起疾病。68.eef1a2的多肽序列如下：69.mgkekthinivvighvdsgkstttghliykcggidkrtiekfekeaaemgkgsfkyawvldklkaerergitidislwkfettkyyitiidapghrdfiknmitgtsqadcavlivaagvgefeagiskngqtrehallaytlgvkqlivgvnkmdstepaysekrydeivkevsayikkigynpatvpfvpisgwhgdnmlepspnmpwfkgwkverkegnasgvsllealdtilpptrptdkplrlplqdvykiggigtvpvgrvetgilrpgmvvtfapvnittevksvemhhealsealpgdnvgfnvknvsvkdirrgnvcgdsksdppqeaaqftsqviilnhpgqisagyspvidchtahiackfaelkekidrrsgkklednpkslksgdaaivemvpgkpmcvesfsqypplgrfavrdmrqtvavgviknvekksggagkvtksaqkaqkagk70.(seq id no:1)。71.在一些实施例中，eef1a2蛋白包括与seq id no:1至少75％、80％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。72.在一些实施例中，本公开提供了一种重组腺相关病毒(raav)病毒粒子，其包括衣壳和载体基因组，其中所述载体基因组包括与启动子操作性地连接的编码eef1a2蛋白或其功能变体的多核苷酸序列。在一些实施例中，本公开提供了一种重组腺相关病毒(raav)病毒粒子，其包括衣壳和载体基因组，其中所述载体基因组包括与启动子操作性地连接的编码eef1a2蛋白的多核苷酸序列。编码eef1a2蛋白的多核苷酸可以包括与以下序列至少75％、80％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列：73.atgggcaaggagaagacccacatcaacatcgtggtcatcggccacgtggactccggaaagtccaccaccacgggccacctcatctacaaatgcggaggtattgacaaaaggaccattgagaagttcgagaaggaggcggctgagatggggaagggatccttcaagtatgcctgggtgctggacaagctgaaggcggagcgtgagcgcggcatcaccatcgacatctccctctggaagttcgagaccaccaagtactacatcaccatcatcgatgcccccggccaccgcgacttcatcaagaacatgatcacgggtacatcccaggcggactgcgcagtgctgatcgtggcggcgggcgtgggcgagttcgaggcgggcatctccaagaatgggcagacgcgggagcatgccctgctggcctacacgctgggtgtgaagcagctcatcgtgggcgtgaacaaaatggactccacagagccggcctacagcgagaagcgctacgacgagatcgtcaaggaagtcagcgcctacatcaagaagatcggctacaacccggccaccgtgccctttgtgcccatctccggctggcacggtgacaacatgctggagccctcccccaacatgccgtggttcaagggctggaaggtggagcgtaaggagggcaacgcaagcggcgtgtccctgctggaggccctggacaccatcctgccccccacgcgccccacggacaagcccctgcgcctgccgctgcaggacgtgtacaagattggcggcattggcacggtgcccgtgggccgggtggagaccggcatcctgcggccgggcatggtggtgacctttgcgccagtgaacatcaccactgaggtgaagtcagtggagatgcaccacgaggctctgagcgaagctctgcccggcgacaacgtcggcttcaatgtgaagaacgtgtcggtgaaggacatccggcggggcaacgtgtgtggggacagcaagtctgacccgccgcaggaggctgctcagttcacctcccaggtcatcatcctgaaccacccggggcagattagcgccggctactccccggtcatcgactgccacacagcccacatcgcctgcaagtttgcggagctgaaggagaagattgaccggcgctctggcaagaagctggaggacaaccccaagtccctgaagtctggagacgcggccatcgtggagatggtgccgggaaagcccatgtgtgtggagagcttctcccagtacccgcctctcggccgcttcgccgtgcgcgacatgaggcagacggtggccgtaggcgtcatcaagaacgtggagaagaagagcggcggcgccggcaaggtcaccaagtcggcgcagaaggcgcagaaggcgggcaag74.(seq id no:2)。75.编码eef1a2蛋白的多核苷酸序列可以是经密码子优化的。76.编码eef1a2蛋白的多核苷酸可以包括与以下序列至少75％、80％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列：atgggtaaagaaaaaacacatattaatatagtagtaatcggtcatgttgactctggaaaatctactactacaggacatttgatttataaatgtggaggaattgataaaagaacaatagaaaaatttgaaaaagaagctgctgaaatgggtaaaggtagttttaaatatgcttgggttttggataaattgaaagctgaaagagaaagaggaattacaattgatatttctttgtggaaatttgaaactacaaaatattatataacaataatagatgctcctggacatagagattttattaaaaatatgattacaggaacttctcaagcagattgtgctgttttgatagtagcagcaggagttggtgaattcgaagcaggcatttctaaaaatggacaaactagagaacatgctttgttggcttatacattgggcgtaaaacaattgattgtaggagttaataaaatggattctactgaacctgcatattctgaaaaaagatatgatgaaatagtaaaagaagtttctgcttatattaaaaaaattggttataatcctgctacagttccatttgttcctatttctggatggcatggagataatatgttggaacctagtcctaatatgccttggtttaaaggatggaaagttgaaaggaaagaaggaaatgcatcaggagtctccttgttggaagctttggatacaatcttgcctccaacaagacctacagataaacctttgagattgcctcttcaagatgtatataaaataggaggaataggaacagtgccagttggaagagtagaaacaggtatattgagacctggaatggttgtaacatttgcaccagttaatataactactgaagtaaaatctgttgaaatgcatcatgaagctttgtctgaagctcttcctggagataatgtaggatttaatgttaaaaatgtaagtgtaaaagatataagaagaggaaatgtatgtggtgatagtaaatcagatccacctcaagaagcagctcaatttacatcacaagtaataatattgaatcatcctggacaaatttctgcaggatattcaccagtaatagattgtcatacagcacatatagcttgtaaatttgctgaattgaaagaaaaaattgatagaagaagtggaaaaaaacttgaagataatcctaaatcattgaaatcaggagatgcagctattgtagaaatggtacctggaaaaccaatgtgtgtagaatctttttctcaatatccacctctcggaagatttgctgttagagatatgagacaaacagttgcagtaggagttattaaaaatgtagaaaaaaaaagcggaggtgcaggaaaggttacaaaatccgcacaaaaagctcaaaaagctggtaaataa77.(seq id no:4)。78.编码eef1a2蛋白的多核苷酸可以包括与以下序列至少75％、80％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列：79.atgggcaaagaaaaaacacatataaacattgtcgttatcggacacgttgattctggtaaaagtacaacaaccggtcacttgatatacaaatgcgggggtatagacaaacgcactattgaaaagttcgagaaagaagctgcggagatgggcaaaggctcattcaagtacgcgtgggtactcgataagttgaaagctgaacgcgagaggggaatcaccatagacatctcactttggaaattcgagacaaccaagtattacataactattatagatgccccaggccacagggatttcattaaaaatatgataaccggcacatctcaagccgattgcgccgtactcatcgtcgccgctggtgtgggtgagttcgaggcaggtatttctaaaaatggccagacacgcgaacatgctcttctggcttatacactcggggttaaacagctcatagtaggagtgaataagatggactccactgaacccgcctattcagagaagcgctatgacgaaattgtaaaggaggtctcagcatatattaaaaaaattggctataacccagccacggtgccattcgtcccgattagtggatggcatggtgacaatatgctggaaccaagtcccaatatgccttggtttaagggttggaaagtagagcggaaagagggtaatgcttccggcgtgtcattgctggaggcgcttgacacgatactcccacccacaaggccaactgataagccactccgattgcccttgcaggacgtgtacaagattgggggaattgggactgtgcccgtcgggcgcgtggagacgggcatcctcagacctgggatggtagtcacttttgcccccgtcaacataacgactgaagttaaatcagtggaaatgcatcacgaagctttgagtgaggcgcttcccggagataacgttggatttaatgtcaaaaatgtctccgttaaagatataagaagaggaaacgtctgcggtgactcaaagtcagacccaccacaggaggctgctcaatttacgagtcaagtaataattctgaatcaccctgggcaaataagtgcgggatactctccagtcatcgattgtcacaccgcccatattgcatgtaagttcgcagaacttaaggaaaagatcgaccgaagaagcggaaaaaaattggaagataatccgaaaagtttgaaaagcggtgacgcggcgattgtagagatggtccctggcaaaccgatgtgtgtggagtctttcagtcaatatccaccactcggtcgctttgccgtgcgggatatgcgacagaccgttgctgtcggcgtaataaaaaacgtcgaaaaaaagagcggtggggctggaaaagttacaaaatccgctcaaaaggcacagaaggcgggcaagtga80.(seq id no:5)。81.编码eef1a2蛋白的多核苷酸可以包括与以下序列至少75％、80％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列：82.atgggtaaagaaaagacccacattaacatagtagtaatcggtcatgttgactctgggaaaagcactactaccggacatttgatctataaatgtgggggcatcgacaaaagaacgatagagaagtttgagaaggaggcggcggagatgggtaaaggtagttttaagtacgcttgggttttggacaaattgaaagccgagcgcgagcgcggcattaccattgacatttctctctggaaattcgaaactacgaagtattatataacaataatagacgcccccggccatcgggactttattaaaaacatgattacaggaactagccaagcagattgtgctgtgctgatagtagcggcaggggtcggggagttcgaagcaggcatctctaaaaatggacaaactcgagagcacgccttgttggcttataccttgggcgtaaagcagctgatcgtaggagttaataaaatggattccactgaacccgcatatagcgaaaagcgatatgacgaaatagtaaaggaagtctcagcttatatcaagaaaatcggttacaatcctgcgacggttccattcgttcctatctccgggtggcacggcgataatatgcttgagcccagtcccaatatgccctggttcaaggggtggaaggttgagaggaaggaaggcaatgcatcaggcgtcagcttgttggaagctctcgacaccatcctgccgcccacgaggcccacagacaaaccgttgcgactgcctcttcaagatgtatacaaaataggcgggataggaaccgtgccggttggacgagtagagacgggtatactgcggcccggaatggtcgtgacgtttgcacccgtgaatataactactgaggtgaagagcgtcgagatgcaccatgaagcgctgagtgaagctctccctggcgataacgtagggttcaacgtgaaaaacgtaagtgtaaaggatataaggcgcggaaatgtatgtggtgacagtaaaagcgacccgccgcaagaggcggcgcaattcacatcacaggtaataatattgaatcaccccggccaaatttccgcaggctactcaccagtcatagattgccacaccgcccacatagcttgtaagttcgctgagttgaaagagaagattgatagacgaagtgggaagaaacttgaagacaatccgaagtccctgaagtccggtgacgcagcgattgtagaaatggtaccgggcaagccaatgtgtgtagagtctttcagccagtacccaccactggggcggttcgcggtgcgagacatgaggcaaacggttgcggtcggcgtcattaaaaatgtcgaaaaaaagagtggcggtgcaggtaaggtcacaaaaagcgcacaaaaggcccagaaagccggtaagtga83.(seq id no:6)。84.编码eef1a2蛋白的多核苷酸可以包括与以下序列至少75％、80％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列：85.atgggaaaggaaaaaactcacataaacattgtcgtcatcggtcacgtagacagtggcaaatcaacgaccactggacatctcatctataagtgtggcggtattgacaaacgcactatcgagaaattcgaaaaggaggctgctgagatgggcaaaggctctttcaagtacgcatgggtcctggataagctgaaagcggagcgagagagagggatcaccatcgatatatctctgtggaaatttgaaaccaccaagtactacatcacaattattgatgccccaggtcatagggattttatcaagaacatgatcaccgggacaagccaagccgactgcgcagttctcatagtggcggctggagtaggggagtttgaagcagggatatctaagaatggacagacccgcgagcacgccttgctggcctacaccctgggagtgaagcagctcatagttggcgtcaataagatggacagcaccgaacccgcctacagtgagaagaggtatgacgagattgtgaaggaggtttctgcttacattaaaaagattggctataacccagctactgtcccattcgttccaatcagcggctggcacggtgataacatgctggagcctagtcccaacatgccgtggttcaaggggtggaaggttgaacgcaaggaggggaatgcctcaggcgtttccctgctggaggccctcgatacaatactccccccgacccggcctacagataaaccgctgcgactgcctcttcaggacgtgtataaaatcgggggaatcggcacagtgcccgtgggcagggtagagactggcatcttgcggcctggaatggtagtcacctttgccccggttaatatcacaacggaggtgaaatctgtggagatgcatcacgaagcactgagcgaggctctgcctggtgacaacgtgggatttaacgtcaaaaacgtgtcagtcaaggacatccgccgcggtaacgtttgcggagattctaagtccgatcccccccaggaggcagcccaatttacctcccaagtgatcattctgaatcacccaggccaaatttccgccgggtattcccctgtgattgactgtcacacagcacacatcgcatgcaaattcgccgaactcaaggagaaaattgatcggagaagcggtaaaaaactggaggacaacccaaagtccctcaagtctggggatgccgccatcgtggagatggtaccaggcaaacctatgtgcgtggaaagttttagccagtaccctccactgggtcgctttgctgttcgggatatgcggcagacagtagcggttggggtcataaaaaacgtcgagaaaaagagcggaggagctgggaaagttaccaaatccgcacagaaggcacaaaaagccggaaaatga86.(seq id no:7)。87.编码eef1a2蛋白的多核苷酸可以包括与以下序列至少75％、80％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列：88.atgggcaaagagaaaacacatattaacattgttgttatcgggcacgttgatagcggcaagtccactaccactggccatctgatttacaagtgcggcggaatcgataaacgaactattgaaaagttcgaaaaagaagccgccgagatgggaaagggctcctttaaatacgcttgggtcctcgataaactcaaagcagaacgggagagaggaatcaccatcgatatatccttgtggaagttcgaaactacaaaatattacattaccatcattgatgcgcctgggcaccgcgacttcattaagaacatgattactggcacctctcaagccgactgcgcagtgttgatcgtagccgcaggcgtcggggagttcgaagctgggatcagcaagaacgggcagactagggaacacgctctgctcgcatatactcttggcgtgaaacagttgatcgttggcgtgaacaagatggattcaactgagcctgcctattctgagaaacgatacgacgagattgtgaaagaggtttcagcttacatcaagaaaattgggtataatcccgcaacagttcccttcgtgcccatctctgggtggcacggcgacaacatgctcgaaccatccccaaatatgccatggttcaagggatggaaggtggagcgcaaagaaggcaacgcctccggagtgtctctgctcgaggccctggacaccattctgcccccaacacgacccactgataagcctctgagactgccactgcaagacgtttacaaaattgggggaattggaaccgtgcctgtgggtcgggtggaaaccggaatcctcagacccggcatggtggtcaccttcgcaccagtgaatataacgacagaggtcaaatctgtggagatgcaccatgaggcattgagcgaggcactcccaggagacaacgtgggtttcaacgtgaaaaatgtctcagttaaggacatccgacgcggcaacgtgtgcggagatagcaaatctgaccccccccaggaggccgctcaattcacaagtcaggttatcatccttaatcaccctggccaaatatctgcaggctacagccccgtgatcgattgtcacacagctcatatcgcctgtaaatttgctgaactcaaagaaaagattgaccgcagatcaggaaaaaagctggaggacaaccctaaaagtctgaagtccggcgacgctgccatcgtggagatggtccctgggaaacccatgtgcgtggagtccttttctcagtacccccctctgggacgattcgccgtgcgcgacatgagacagactgtcgccgtgggcgtcattaaaaatgtggaaaaaaaatcaggaggtgcagggaaagtgacaaagagtgcccagaaagcacagaaggctggcaagtga89.(seq id no:8)。90.任选地，编码载体基因组的多核苷酸序列可以包括kozak序列，包含但不限于gccaccatgg(seq id no:10)。kozak序列可以与编码eef1a2蛋白或其功能变体的多核苷酸序列重叠。例如，载体基因组可以包括与以下序列至少75％、80％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列(kozak带有下划线)：91.gccaccatgggcaaggagaagacccacatcaacatcgtggtcatcggccacgtggactccggaaagtccaccaccacgggccacctcatctacaaatgcggaggtattgacaaaaggaccattgagaagttcgagaaggaggcggctgagatggggaagggatccttcaagtatgcctgggtgctggacaagctgaaggcggagcgtgagcgcggcatcaccatcgacatctccctctggaagttcgagaccaccaagtactacatcaccatcatcgatgcccccggccaccgcgacttcatcaagaacatgatcacgggtacatcccaggcggactgcgcagtgctgatcgtggcggcgggcgtgggcgagttcgaggcgggcatctccaagaatgggcagacgcgggagcatgccctgctggcctacacgctgggtgtgaagcagctcatcgtgggcgtgaacaaaatggactccacagagccggcctacagcgagaagcgctacgacgagatcgtcaaggaagtcagcgcctacatcaagaagatcggctacaacccggccaccgtgccctttgtgcccatctccggctggcacggtgacaacatgctggagccctcccccaacatgccgtggttcaagggctggaaggtggagcgtaaggagggcaacgcaagcggcgtgtccctgctggaggccctggacaccatcctgccccccacgcgccccacggacaagcccctgcgcctgccgctgcaggacgtgtacaagattggcggcattggcacggtgcccgtgggccgggtggagaccggcatcctgcggccgggcatggtggtgacctttgcgccagtgaacatcaccactgaggtgaagtcagtggagatgcaccacgaggctctgagcgaagctctgcccggcgacaacgtcggcttcaatgtgaagaacgtgtcggtgaaggacatccggcggggcaacgtgtgtggggacagcaagtctgacccgccgcaggaggctgctcagttcacctcccaggtcatcatcctgaaccacccggggcagattagcgccggctactccccggtcatcgactgccacacagcccacatcgcctgcaagtttgcggagctgaaggagaagattgaccggcgctctggcaagaagctggaggacaaccccaagtccctgaagtctggagacgcggccatcgtggagatggtgccgggaaagcccatgtgtgtggagagcttctcccagtacccgcctctcggccgcttcgccgtgcgcgacatgaggcagacggtggccgtaggcgtcatcaagaacgtggagaagaagagcggcggcgccggcaaggtcaccaagtcggcgcagaaggcgcagaaggcgggcaag92.(seq id no:9)。93.在一些实施例中，所述kozak序列是替代的kozak序列，其包括以下任一项或由以下任一项组成：94.(gcc)gccrccaugg(seq id no:11)；95.agnnaugn；96.annaugg；97.accaugg；98.gacaccaugg(seq id no:12)。99.在一些实施例中，载体基因组不包括kozak序列。100.载体基因组101.本公开的aav病毒粒子包括载体基因组。载体基因组可以包括表达盒(或用于不需要多核苷酸序列的表达的基因编辑应用的多核苷酸盒)。可以使用任何合适的反向末端重复序列(itr)。itr可以来自与衣壳相同的血清型或不同的血清型(例如，可以使用aav2 itr)。102.在一些实施例中，5'itr包括与以下序列至少75％、80％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列：103.cctgcaggcagctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcct104.(seq id no:18)105.在一些实施例中，5'itr包括与以下序列至少75％、80％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列：106.gcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttccttgtagttaatgattaacccgccatgctacttatctacgta107.(seq id no:19)108.在一些实施例中，5'itr包括与以下序列至少75％、80％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列：109.ctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttccttgtagttaatgattaacccgccatgctacttatctacgta110.(seq id no:20)111.在一些实施例中，3'itr包括与以下序列至少75％、80％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列：112.aggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagctgcctgcagg113.(seq id no:21)114.在一些实施例中，3'itr包括与以下序列至少75％、80％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列：115.tacgtagataagtagcatggcgggttaatcattaactacaaggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgc116.(seq id no:63)117.在一些实施例中，载体基因组包括与以下序列例如至少75％、80％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的一个或多个填充序列：118.gcggcaattcagtcgataactataacggtcctaaggtagcgatttaaatacgcgctctcttaaggtagccccgggacgcgtcaattgactacaaaccgagtatctgcagagggccctgcgtatg(seq id no:22)；119.cttctgaggcggaaagaaccagatcctctcttaaggtagcatcgagatttaaattagggataacagggtaatggcgcgggccgc(seq id no:23)；或120.gttacccaggctggagtgcagtggcacatttctgctcactgcaacctcctcctccctgggttc(seq id no:24)。121.启动子122.在一些实施例中，编码eef1a2蛋白或其功能变体的多核苷酸序列与启动子可操作地连接。123.本公开考虑了各种启动子的用途。可用于本公开的实施例中的启动子包含但不限于巨细胞病毒(cmv)启动子、磷酸甘油酸激酶(pgk)启动子或包括cmv增强子和鸡β-肌动蛋白启动子和兔β-珠蛋白基因(cag)的部分的启动子序列。在一些情况下，启动子可以是合成启动子。schlabach等人《美国国家科学院院刊(pnas usa.)》107(6):2538–43(2010)提供了示例性合成启动子。在一些实施例中，启动子包括与以下序列至少75％、80％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列：124.acttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgg125.(seq id no:14)126.在一些实施例中，编码eef1a2蛋白或其功能变体的多核苷酸序列与诱导型启动子操作性地连接。诱导型启动子可以被配置成响应于药剂的添加或累积或响应于药剂的去除、降解或稀释而使多核苷酸序列被转录表达或不被转录表达。所述药剂可以是药物。所述药剂可以是四环素或其衍生物中的一种，包含但不限于多西环素(doxycycline)。在一些情况下，诱导型启动子是tet-on启动子、tet-off启动子、化学调节启动子、物理调节启动子(即，响应于光的存在或不存在或响应于低温或高温的启动子)。诱导型启动子包含重金属离子诱导型启动子(如小鼠乳腺肿瘤病毒(mmtv)启动子或各种生长激素启动子)以及在存在t7 rna聚合酶的情况下具有活性的来自t7噬菌体的启动子。所述诱导型启动子的列表是非限制性的。127.在一些情况下，启动子是组织特异性启动子，如能够在神经元中比在非神经元细胞中更大程度地驱动表达的启动子。在一些实施例中，组织特异性启动子选自任何各种神经元特异性启动子，包含但不限于：hsyn1(人突触蛋白)、ina(α-丝联蛋白)、nes(巢蛋白)、th(酪氨酸羟化酶)、foxa2(叉头盒a2)、camkii(钙调蛋白依赖性蛋白激酶ii)和nse(神经元特异性烯醇化酶)。在一些情况下，启动子是普遍存在的启动子。“普遍存在的启动子”是指在实验或临床条件下非组织特异性的启动子。在一些情况下，普遍存在的启动子是以下中的任一种：cmv、cag、ubc、pgk、ef1-α、gapdh、sv40、hbv、鸡β-肌动蛋白和人β-肌动蛋白启动子。128.在一些实施例中，所述启动子序列选自表3。在一些实施例中，启动子包括与seq id no:3、14、16-17和25-30中任一者至少75％、80％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列。129.表3130.启动子seq id no:人β-肌动蛋白(huba)25鸡β-肌动蛋白(cba)26巨细胞病毒(cmv)16巨细胞病毒(cmv)(第二个版本)17cag启动子14人ef1-α(ef1-α)27人突触蛋白1(syn)，短版本28人突触蛋白1(syn)，具有3'延伸3人突触蛋白1(syn)，具有5'延伸29人camkiia(camkiia)30esyn启动子64131.在优选的实施例中，载体基因组包括与seq id no:3至少75％、80％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列。132.启动子的另外的说明性实例是来自猿猴病毒40的sv40晚期启动子、杆状病毒多面体增强子/启动子元件、单纯性疱疹病毒胸苷激酶(hsv tk)、来自巨细胞病毒(cmv)的立即早期启动子和包含ltr元件的各种逆转录病毒启动子。各种各样的其它启动子是已知的，并且在本领域中通常是可获得的，并且许多这种启动子的序列可在如基因库数据库等序列数据库中获得。133.其它调节元件134.在一些情况下，本公开的载体进一步包括选自由以下组成的组的一种或多种调节元件：增强子、内含子、poly-a信号、2a肽编码序列、土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(wpre)和乙型肝炎转录后调节元件(hpre)。135.在一些实施例中，载体包括cmv增强子。136.在某些实施例中，载体包括一种或多种增强子。在特定实施例中，增强子是cmv增强子序列、gapdh增强子序列、β-肌动蛋白增强子序列或ef1-α增强子序列。前述的序列在本领域中是已知的。例如，cmv立即早期(ie)增强子的序列是：137.acttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattacca138.(seq id no:31)139.在某些实施例中，载体包括一个或多个内含子。在特定实施例中，内含子是兔珠蛋白内含子序列、鸡β-肌动蛋白内含子序列、合成内含子序列或ef1-α内含子序列。140.在某些实施例中，载体包括polya序列。在特定实施例中，polya序列是兔珠蛋白polya序列、人生长激素polya序列、牛生长激素polya序列、pgk polya序列、sv40 polya序列或tk polya序列。在一些实施例中，poly-a信号可以是牛生长激素多腺苷酸化信号(bghpa)。141.在某些实施例中，载体包括一个或多个转录稳定元件。在特定实施例中，转录稳定元件是wpre序列、hpre序列、支架附着区、3'utr或5'utr。在特定实施例中，载体包括5'utr和3'utr两者。142.在一些实施例中，载体包括选自表4的5'非翻译区(utr)。在一些实施例中，载体基因组包括与seq id no:32-40中任一者至少75％、80％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列。143.表4144.5'非翻译区seq id no:人β-肌动蛋白外显子/内含子32鸡β-肌动蛋白外显子/内含子+兔珠蛋白内含子335'utr-syn1 hs34cmv ie外显子35tpl-emlp(腺病毒源性增强子元件)36人ef1-α内含子/外显子37人ef1-α，内含子a385'utr人camkiia39β-珠蛋白内含子40145.在一些实施例中，载体包括选自表5的3'非翻译区。在一些实施例中，载体基因组包括与seq id no:41-49中任一者至少75％、80％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列。146.表5147.3'非翻译区seq id no:wpre(x)(突变的土拨鼠肝炎调节元件–版本1)41wpre(x)(突变的土拨鼠肝炎调节元件–版本2)42wpre(x)(突变的土拨鼠肝炎调节元件–版本3)43caax44ees45hpre46r2v17(hepb源性增强子元件)473'utr(珠蛋白)48wpre(r)49148.在一些实施例中，载体包括选自表6的多腺苷酸化(polya)信号。在一些实施例中，polya信号包括与seq id no:50-54中任一者至少75％、80％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列。149.表6150.多腺苷酸化位点seq id no:兔珠蛋白(pa珠蛋白-oc)50牛生长激素(pagh-bt–版本1)51牛生长激素(pagh-bt–版本2)52牛生长激素(pagh-bt–版本3)53人生长激素(pagh-hs)54151.说明性载体基因组在图2-5中描绘并被提供为seq id no:55-58或65-68。在一些实施例中，载体基因组包括与seq id no:55-58或65-68中任一者具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多核苷酸序列、基本上由其组成或由其组成，任选地具有或不具有小写的itr序列。编码序列带有下划线。替代性载体基因组序列以seq id no:65-68的形式提供。152.v1-载体基因组–3,144bp(图2)(seq id no:55)153.[0154][0155]v2-载体基因组–3,035bp(图3)(seq id no:56)[0156][0157][0158][0159]v3-载体基因组–3,263bp(图4)(seq id no:57)[0160][0161][0162][0163]v4-载体基因组–4,299bp(图5)(seq id no:58)[0164][0165][0166][0167]在一个实施例中，表达盒按5'至3'顺序包括huba启动子、编码eef1a2或其功能变体的多核苷酸序列、wpre(x)和pa珠蛋白-oc。[0168]在一个实施例中，表达盒按5'至3'顺序包括cmv启动子、tpl-emlp增强子、编码eef1a2或其功能变体的多核苷酸序列、wpre(r)和pa珠蛋白-oc。[0169]在一个实施例中，表达盒按5'至3'顺序包括syn启动子、编码eef1a2或其功能变体的多核苷酸序列、wpre(r)、3'utr(珠蛋白)和pagh-bt。[0170]在一个实施例中，表达盒按5'至3'顺序包括cba启动子、编码eef1a2或其功能变体的多核苷酸序列和pagh-bt。[0171]在一个实施例中，表达盒按5'至3'顺序包括ef1α启动子、编码eef1a2或其功能变体的多核苷酸序列和pa珠蛋白-oc。[0172]在一个实施例中，表达盒按5'至3'顺序包括huba启动子、编码eef1a2或其功能变体的多核苷酸序列、r2v17和pagh-bt。[0173]在一个实施例中，表达盒按5'至3'顺序包括syn启动子、编码eef1a2或其功能变体的多核苷酸序列、wpre(x)、3'utr(珠蛋白)和pagh-hs。[0174]在一个实施例中，表达盒按5'至3'顺序包括camkiia启动子、编码eef1a2或其功能变体的多核苷酸序列、wpre(r)和pagh-hs。[0175]在一个实施例中，表达盒按5'至3'顺序包括cmv启动子、tpl-emlp增强子、编码eef1a2或其功能变体的多核苷酸序列、wpre(r)和pagh-hs。[0176]在一个实施例中，表达盒按5'至3'顺序包括huba启动子、编码eef1a2或其功能变体的多核苷酸序列和pagh-hs。[0177]在一个实施例中，表达盒按5'至3'顺序包括cmv启动子、tpl-emlp增强子、编码eef1a2或其功能变体的多核苷酸序列、r2v17、3'utr(珠蛋白)和pagh-bt。[0178]在一个实施例中，表达盒按5'至3'顺序包括ef1α启动子、编码eef1a2或其功能变体的多核苷酸序列、wpre(r)和pagh-bt。[0179]在一个实施例中，表达盒按5'至3'顺序包括syn启动子、编码eef1a2或其功能变体的多核苷酸序列、r2v17和pa珠蛋白-oc。[0180]在一个实施例中，表达盒按5'至3'顺序包括camkiia启动子、编码eef1a2或其功能变体的多核苷酸序列、r2v17和pa珠蛋白-oc。[0181]在一个实施例中，表达盒按5'至3'顺序包括cba启动子、编码eef1a2或其功能变体的多核苷酸序列、wpre(x)、3'utr(珠蛋白)和pagh-hs。[0182]在一个实施例中，表达盒按5'至3'顺序包括cba启动子、编码eef1a2或其功能变体的多核苷酸序列、3'utr(珠蛋白)和pa珠蛋白-oc。[0183]在一个实施例中，表达盒按5'至3'顺序包括camkiia启动子、编码eef1a2或其功能变体的多核苷酸序列、r2v17和pagh-bt。[0184]在一个实施例中，表达盒按5'至3'顺序包括ef1α启动子、编码eef1a2或其功能变体的多核苷酸序列、r2v17、3'utr(珠蛋白)和pagh-hs。[0185]在一个实施例中，表达盒按5'至3'顺序包括cmv启动子、编码eef1a2或其功能变体的多核苷酸序列、r2v17、3'utr(珠蛋白)和pagh-hs。[0186]在一个实施例中，表达盒按5'至3'顺序包括cmv启动子、编码eef1a2或其功能变体的多核苷酸序列和pagh-hs。[0187]在一个实施例中，表达盒按5'至3'顺序包括hsyn启动子、编码eef1a2或其功能变体的多核苷酸序列、wpre(x)和pagh-bt。[0188]在一个实施例中，表达盒按5'至3'顺序包括hsyn启动子、编码eef1a2或其功能变体的多核苷酸序列、wpre(x)和pagh-hs。[0189]在一个实施例中，表达盒按5'至3'顺序包括hsyn启动子、kozak、编码eef1a2或其功能变体的多核苷酸序列、wpre(x)和pagh-hs。[0190]在一个实施例中，表达盒按5'至3'顺序包括cag启动子、编码eef1a2或其功能变体的多核苷酸序列、wpre(x)和pagh-hs。[0191]在一个实施例中，表达盒按5'至3'顺序包括cag启动子、kozak、编码eef1a2或其功能变体的多核苷酸序列、wpre(x)和pagh-hs。[0192]在一个实施例中，表达盒按5'至3'顺序包括hsyn启动子、编码eef1a2或其功能变体的多核苷酸序列、wpre(x)和pagh-bt。[0193]在一个实施例中，表达盒按5'至3'顺序包括hsyn启动子、编码eef1a2或其功能变体的多核苷酸序列和pagh-hs。[0194]在一个实施例中，表达盒按5'至3'顺序包括hsyn启动子、kozak、编码eef1a2或其功能变体的多核苷酸序列和pagh-hs。[0195]在一个实施例中，表达盒按5'至3'顺序包括cag启动子、编码eef1a2或其功能变体的多核苷酸序列和pagh-hs。[0196]在一个实施例中，表达盒按5'至3'顺序包括cag启动子、kozak、编码eef1a2或其功能变体的多核苷酸序列和pagh-hs。[0197]腺相关病毒载体[0198]腺相关病毒(aav)是复制缺陷型细小病毒，其单链dna基因组长度为约4.7kb，包含两个～145个核苷酸的反向末端重复(itr)。存在多种已知的aav变体，当按抗原表位分类时，所述aav变体有时也被称为血清型。aav血清型的基因组的核苷酸序列是已知的。例如，aav-1的完整基因组在genbank登录号nc_002077中提供；aav-2的完整基因组在genbank登录号nc_001401和srivastava等人,《病毒学杂志(j.virol.)》,45:555-564(1983)中提供；aav-3的完整基因组在genbank登录号nc_1829中提供；aav-4的完整基因组在genbank登录号nc_001829中提供；aav-5基因组在genbank登录号af085716中提供；aav-6的完整基因组在genbank登录号nc_00 1862中提供；aav-7和aav-8基因组的至少部分分别在genbank登录号ax753246和ax753249中提供；aav-9基因组在gao等人,《病毒学杂志》,78:6381-6388(2004)中提供；aav-10基因组在《分子疗法》,13(1):67-76(2006)中提供；并且aav-11基因组在《病毒学(virology)》,330(2):375-383(2004)中提供。美国专利9,434,928中提供了aavrh.74基因组的序列，其通过引用并入本文。指导病毒dna复制(rep)、衣壳化/包装和宿主细胞染色体整合的顺式作用序列包含在aav itr中。三个aav启动子(其相对图谱位置命名为p5、p19和p40)驱动编码rep和cap基因的两个aav内部开放阅读框的表达。与单个aav内含子的差异剪接(在核苷酸2107和2227处)偶联的两个rep启动子(p5和p19)引起从rep基因产生四种rep蛋白(rep78、rep68、rep52和rep40)。rep蛋白具有多种酶特性，所述酶特性最终负责复制病毒基因组。cap基因由p40启动子表达，并且其编码三种衣壳蛋白vp1、vp2和vp3。替代性剪接和非共有翻译起始位点负责产生三种相关的衣壳蛋白。单一共有多腺苷酸化位点位于aav基因组的图谱位置95处。aav的生命周期和遗传学在muzyczka,《当前微生物学和免疫学的话题(current topics in microbiology and immunology)》,158:97-129(1992)中评论。[0199]aav具有独特的特征，这使其作为例如在基因疗法中将外源dna递送到细胞的载体具有吸引力。培养中细胞的aav感染是非细胞病变的，并且人类和其它动物的自然感染是沉默的和无症状的。而且，aav感染许多哺乳动物细胞，从而允许体内靶向许多不同组织的可能性。此外，aav转导缓慢分裂和非分裂细胞，并且可以作为转录活性核附加体(染色体外元件)基本上持续这些细胞的寿命。将aav原病毒基因组作为质粒中的克隆dna插入，这使得重组基因组的构建成为可能。此外，由于指导aav复制和基因组衣壳化的信号包含在aav基因组的itr中，因此部分或全部内部约4.3kb的基因组(编码复制和结构衣壳蛋白，rep-cap)可以用外源dna替代。为了产生aav载体，rep蛋白和cap蛋白可以以反式提供。aav的另一个显著特征是其是极其稳定且强健的病毒。它易于承受用于使腺病毒失活的条件(56℃到65℃，持续数小时)，使aav的冷保存不太重要。甚至可以将aav冻干。最后，aav感染的细胞不耐受重复感染。[0200]raav基因组中的aav dna可以来自任何可源自重组病毒的aav变体或血清型，包含但不限于aav变体或血清型aav-1、aav-2、aav-3、aav-4、aav-5、aav-6、aav-7、aav-8、aav-9、aav-10、aav-11、aav-12、aav-13和aavrh10。在例如wo 01/83692中公开了假型raav的产生。还考虑了其它类型的raav变体，例如具有衣壳突变的raav。参见例如marsic等人,《分子疗models.)《基因(genes)》2017年2月8日；还参见美国专利第6,180,613号和美国专利公开第us20120082650a1号，所述两个专利的公开内容通过引用并入本文。在一些实施例中，将raav直接注射到受试者的黑质中。[0207]在一些实施例中，raav病毒粒子是aav2 raav病毒粒子。衣壳可以是aav2衣壳或其功能变体。在一些实施例中，aav2衣壳与参考aav2衣壳(例如，以下序列)具有至少98％、99％或100％的同一性：[0208]maadgylpdwledtlsegirqwwklkpgppppkpaerhkddsrglvlpgykylgpfngldkgepvneadaaalehdkaydrqldsgdnpylkynhadaefqerlkedtsfggnlgravfqakkrvleplglveepvktapgkkrpvehspvepdsssgtgkagqqparkrlnfgqtgdadsvpdpqplgqppaapsglgtntmatgsgapmadnnegadgvgnssgnwhcdstwmgdrvittstrtwalptynnhlykqissqsgasndnhyfgystpwgyfdfnrfhchfsprdwqrlinnnwgfrpkrlnfklfniqvkevtqndgtttiannltstvqvftdseyqlpyvlgsahqgclppfpadvfmvpqygyltlnngsqavgrssfycleyfpsqmlrtgnnftfsytfedvpfhssyahsqsldrlmnplidqylyylsrtntpsgtttqsrlqfsqagasdirdqsrnwlpgpcyrqqrvsktsadnnnseyswtgatkyhlngrdslvnpgpamashkddeekffpqsgvlifgkqgsektnvdiekvmitdeeeirttnpvateqygsvstnlqrgnrqaatadvntqgvlpgmvwqdrdvylqgpiwakiphtdghfhpsplmggfglkhpppqilikntpvpanpsttfsaakfasfitqystgqvsveiewelqkenskrwnpeiqytsnynksvnvdftvdtngvyseprpigtryltrnl[0209](seq id no:59)[0210]在一些实施例中，raav病毒粒子是aav9 raav病毒粒子。衣壳可以是aav9衣壳或其功能变体。在一些实施例中，aav9衣壳与参考aav9衣壳(例如,以下序列)具有至少98％、99％或100％的同一性：[0211]maadgylpdwlednlsegirewwalkpgapqpkanqqhqdnarglvlpgykylgpgngldkgepvnaadaaalehdkaydqqlkagdnpylkynhadaefqerlkedtsfggnlgravfqakkrlleplglveeaaktapgkkrpveqspqepdssagigksgaqpakkrlnfgqtgdtesvpdpqpigeppaapsgvgsltmasgggapvadnnegadgvgsssgnwhcdsqwlgdrvittstrtwalptynnhlykqisnstsggssndnayfgystpwgyfdfnrfhchfsprdwqrlinnnwgfrpkrlnfklfniqvkevtdnngvktiannltstvqvftdsdyqlpyvlgsahegclppfpadvfmipqygyltlndgsqavgrssfycleyfpsqmlrtgnnfqfsyefenvpfhssyahsqsldrlmnplidqylyylsktingsgqnqqtlkfsvagpsnmavqgrnyipgpsyrqqrvsttvtqnnnsefawpgasswalngrnslmnpgpamashkegedrffplsgslifgkqgtgrdnvdadkvmitneeeikttnpvatesygqvatnhqsaqaqaqtgwvqnqgilpgmvwqdrdvylqgpiwakiphtdgnfhpsplmggfgmkhpppqilikntpvpadpptafnkdklnsfitqystgqvsveiewelqkenskrwnpeiqytsnyyksnnvefavntegvyseprpigtryltrnl[0212](seq id no:15)[0213]在一些实施例中，raav病毒粒子是aav-php.b raav病毒粒子或其神经营养性变体，如但不限于国际专利公开号wo 2015/038958 a1和wo 2017/100671 a1中公开的那些。例如，aav衣壳可以包括来自序列tlavpfk(seq id no:61)或kfpvalt(seq id no:62)的至少4个连续氨基酸，例如，插入在编码aav9的氨基酸588和589的序列之间。[0214]衣壳可以是aav-php.b衣壳或其功能变体。在一些实施例中，aav-php.b衣壳与参考aav-php.b衣壳(例如，以下序列)具有至少98％、99％或100％的同一性：[0215]maadgylpdwlednlsegirewwalkpgapqpkanqqhqdnarglvlpgykylgpgngldkgepvnaadaaalehdkaydqqlkagdnpylkynhadaefqerlkedtsfggnlgravfqakkrlleplglveeaaktapgkkrpveqspqepdssagigksgaqpakkrlnfgqtgdtesvpdpqpigeppaapsgvgsltmasgggapvadnnegadgvgsssgnwhcdsqwlgdrvittstrtwalptynnhlykqisnstsggssndnayfgystpwgyfdfnrfhchfsprdwqrlinnnwgfrpkrlnfklfniqvkevtdnngvktiannltstvqvftdsdyqlpyvlgsahegclppfpadvfmipqygyltlndgsqavgrssfycleyfpsqmlrtgnnfqfsyefenvpfhssyahsqsldrlmnplidqylyylsrtingsgqnqqtlkfsvagpsnmavqgrnyipgpsyrqqrvsttvtqnnnsefawpgasswalngrnslmnpgpamashkegedrffplsgslifgkqgtgrdnvdadkvmitneeeikttnpvatesygqvatnhqsaqtlavpfkaqaqtgwvqnqgilpgmvwqdrdvylqgpiwakiphtdgnfhpsplmggfgmkhpppqilikntpvpadpptafnkdklnsfitqystgqvsveiewelqkenskrwnpeiqytsnyyksnnvefavntegvyseprpigtryltrnl[0216](seq id no:60)[0217]本公开的raav病毒粒子中使用的其它aav衣壳包含专利公开号wo 2009/012176 a2和wo 2015/168666 a2中公开的那些。[0218]药物组合物和试剂盒[0219]一方面，本公开提供了药物组合物，其包括本公开的raav病毒粒子和一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。[0220]出于施用的目的，例如通过注射，可以采用如无菌水性溶液等各种溶液。如果需要的话，这种水性溶液可以被缓冲，并且液体稀释剂首先用盐水或葡萄糖进行等渗。作为游离酸的raav溶液(dna含有酸性磷酸酯基团)或药理学上可接受的盐可以在以0.001％或0.01％适当地与表面活性剂(如pluronictm f-68)混合的水中制备。还可以在甘油、液体聚乙二醇、及其混合物中以及在油中制备raav的分散体。在通常的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以预防微生物的生长。在这方面，采用的无菌含水介质都可通过本领域技术人员熟知的标准技术容易地获得。[0221]适于可注射使用的药物形式包含但不限于无菌水溶液或分散体以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。在所有情况下，所述形式是无菌的并且应具有达到易于注射的程度的流动性。其必须在制造和储存条件下稳定，并且必须防止如细菌和真菌等微生物的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水；乙醇；多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)；其合适的混合物和植物油。可以例如通过使用如卵磷脂等包衣、通过在分散液的情况下维持所需的粒度以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等可以带来防止微生物的作用。在许多情况下，将优选的是包含等渗剂，例如糖或氯化钠。可以通过使用延迟吸收剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)延长可注射组合物的吸收。[0222]通过将raav以所需的量根据需要与以上枚举的各种其它成分一起并入适当的溶剂中、然后进行过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。通常，通过将灭菌的活性成分并入到无菌媒剂中来制备分散体，所述无菌媒剂含有基础分散介质以及来自以上枚举的那些的所需其它成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，所述方法从其先前经过无菌过滤的溶液中产生活性成分加上任何另外所期望的成分的粉末。[0223]另一方面，本公开包括试剂盒，其包括本公开的raav病毒粒子和使用说明。[0224]使用方法[0225]一方面，本公开提供了一种增加细胞中的eef1a2活性的方法，所述方法包括使所述细胞与本公开的raav接触。另一方面，本公开提供了一种增加受试者的eef1a2活性的方法，所述方法包括向施用本公开的raav。在一些实施例中，细胞和/或受试者缺乏eef1a2表达水平和/或活性和/或包括eef1a2的功能缺失突变。细胞可以是神经元，例如多巴胺能神经元。[0226]在一些实施例中，所述方法促进神经元在细胞培养物和/或在体内的存活。[0227]治疗方法[0228]另一方面，本公开提供了一种治疗有需要的受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本公开的raav病毒粒子。在一些实施例中，所述疾病或病症是神经系统疾病或病症。在一些实施例中，受试者患有eef1a2表达或功能的遗传破坏。在一些实施例中，所述疾病或病症是eef1a2缺乏症和/或eef1a2相关神经系统疾病(omim#617309、616393、616409)表型谱，如智力残疾、智力迟钝、癫痫性脑病和自闭症谱系障碍。[0229]aav介导的eef1a2蛋白向cns的递送可延长寿命，预防神经元变性，预防或减轻神经行为缺陷、退行性癫痫运动障碍性脑病、癫痫和肌张力障碍。[0230]本发明还考虑了组合疗法。具体考虑了本发明的方法与标准医学治疗(例如，皮质类固醇或局部减压药物)的组合以及与新颖疗法的组合。在一些情况下，可以用类固醇治疗受试者，以防止或减少对施用本文所描述的raav的免疫应答。[0231]治疗有效量的raav载体，例如用于脑室内(icv)或小脑延髓池内(icm)注射的载体，是按脑重量计范围为约1e12 vg/kg至约5e12 vg/kg、或约1e13vg/kg至约5e13 vg/kg、或约1e14 vg/kg至约5e14 vg/kg、或约1e15 vg/kg至约5e15 vg/kg的raav剂量。或按体重计范围为1213-1e14vg/kg的静脉递送剂量。本发明还包括包含这些范围的raav载体的组合物。[0232]例如，在特定实施例中，raav载体的治疗有效量是约1e10vg、约2e10vg、约3e10vg、约4e10vg、约5e10vg、约6e10vg、约7e10vg、约8e10vg、约9e10vg、约1e12vg、约2e12vg、约3e12vg、约4e12vg或约5e12vg的剂量。本发明还包括包含这些剂量的raav载体的组合物。[0233]在一些实施例中，例如在进行icv注射的情况下，raav载体的治疗有效量是在1e10vg/半球至1e13vg/半球、或约1e10vg/半球、约1e11vg/半球、约1e12vg/半球、或约1e13vg/半球范围内的剂量。在一些实施例中，例如在进行icm注射的情况下，raav载体的治疗有效量是在1e10vg总量至1e14vg总量、或约1e10vg总量、约1e11vg总量、约1e12vg总量、约1e13vg总量、或约1e14vg总量范围内的剂量。[0234]在一些实施例中，治疗组合物包括每体积所注射的治疗组合物多于约1e9、1e10或1e11个raav载体基因组。在实施例情况下，治疗组合物包括每ml多于大约1e10、1e11、1e12或1e13个raav载体基因组。在某些实施例中，治疗组合物包括每ml少于约1e14、1e13或1e12个raav载体基因组。[0235]在患者中功能改善的证据、临床益处或疗效可以通过使用uk-who儿科头围、身高和体重百分位数图表分析癫痫发作(肌阵挛性和全身强直阵挛发作)频率降低、脑生长和身体生长的替代标志物来进行评估。使用标准疾病评定量表(如儿童癫痫发作量表和药物日志)测量认知、运动、言语和语言功能。认知和发育评估，包含《peabody运动发育量表(peabody developmental motor scales)》第2版(pdms-2)和《贝利婴儿发育量表(bayley scales of infant development)》第3版，适用于儿童的残疾程度。粗大运动功能测量(gfmf-88)、残疾量表儿科评估(pedi)。这些或类似的量表，以及患者报告的生活质量结果，如3分量表上的护理人员癫痫发作持续时间变化的全局印象(cgicsd)(平均持续时间减少、无变化或增加)、儿科生活质量量表(pedsqltm)和vineland适应性行为量表-第2版，可能证明疾病成分的改善。基线和后治疗脑磁共振成像可能显示髓鞘形成和脑容量的改善。在患有常染色体显性遗传性eef1a2相关神经发育障碍的患者中观察到心脏缺陷，包含心肌病、主动脉缺损和室间隔缺损(kaneko等人,2021；carvill等人,2020；mclachlan等人,2019)。在具有全球发育迟缓、癫痫、生长迟缓、扩张型心肌病和过早死亡的单亲中鉴定出eef1a2的纯合变体(cao等人,2017)。心脏状态的测量可以通过基线心电图和超声心动图监测。[0236]临床益处可以被观察为寿命的增加、满足正常的神经发育里程碑、癫痫发作活动(包含肌阵挛性、阵挛性、全身强直阵挛和/或癫痫性痉挛)的频率或幅度降低、发育中的肌张力减退或运动障碍(如舞蹈手足徐动症、肌张力障碍和/或共济失调)的改善或缺乏。神经保护和/或神经修复作用的证据可能在磁共振成像(mri)上通过表征发育中的髓鞘化程度、胼胝体厚度和皮质和/或小脑萎缩程度而明显。脑电图(eeg)活动的有益变化将通过多灶性放电和/或全身尖峰活动的减少来证明。[0237]在一些实施例中，例如在进行静脉内施用的情况下，raav载体的治疗有效量是按受试者的总体重计在约1e12 vg/kg至1e14 vg/kg范围内的剂量。例如，在特定实施例中，raav载体的治疗有效量是约1e12 vg/kg、约2e12vg/kg、约3e12 vg/kg、约4e12 vg/kg、约5e12 vg/kg、约6e12 vg/kg、约7e12vg/kg、约8e12 vg/kg、约9e12 vg/kg、约1e13 vg/kg、约2e13 vg/kg、约3e13vg/kg、约4e13 vg/kg、约5e13 vg/kg、约6e13 vg/kg、约7e13 vg/kg、约8e13vg/kg、约9e13 vg/kg或约1e14 vg的剂量。心脏获益的证据可能包含超声心动图显示心脏功能稳定。[0238]组合物的施用[0239]可以通过本领域标准的途径施用有效剂量的组合物，包含但不限于全身、局部、直接注射、静脉内、脑、脑脊髓、鞘内、脑池内、壳核内、海马内、纹状体(壳核和/或尾状核)内、皮质内或脑室内施用。在一些情况下，施用包括静脉内、脑、脑脊髓、鞘内、脑池内、壳核内、海马内、纹状体(壳核和/或尾状核)内或脑室内注射。可以通过使用或不使用特伦德伦伯(trendelenburg)倾斜进行鞘内注射来施用。[0240]在一些实施例中，本公开提供了有效剂量的本发明的raav和组合物的局部施用和全身施用。例如，全身施用可以是对循环系统的施用，从而影响整个身体。全身施用包含通过注射、输注或植入进行亲本施用。[0241]具体地，可以通过使用将raav重组载体转运到动物的靶组织中的任何物理方法来完成本发明的raav的施用。施用包含但不限于注射到中枢神经系统(cns)或脑脊髓液(csf)中和/或直接注射到脑中。[0242]在一些实施例中，本公开的方法包括脑室内、小脑延髓池内、鞘内或脑实质内递送。可以使用专用套管、导管、注射器/针头，使用输注泵进行输注。任选地，可以通过mri引导的成像来实现对注射位点的靶向。施用可以包括将有效量的raav病毒粒子或包括raav病毒粒子的药物组合物递送至cns。这些可以例如通过单侧脑室内注射、双侧脑室内注射、采用特伦德伦伯倾斜程序的小脑延髓池内输注、或不采用特伦德伦伯倾斜程序的小脑延髓池内输注、采用特伦德伦伯倾斜程序的鞘内输注或不采用特伦德伦伯倾斜程序的鞘内输注来实现。本公开的组合物可以进一步静脉内施用。[0243]直接递送至cns可以涉及靶向脑室内空间(无论是单侧还是双侧)、特定神经元区或含有神经元靶标的更一般脑区。通过使用多种成像技术(mri、ct、ct与mri合并组合)以及使用任何数量的软件规划程序(例如，隐形系统(stealth system)、clearpoint神经导航系统(clearpoint neuronnavigation system)、博医来(brainlab)、neuroinspire等)，可以实现个体患者的脑室内空间、脑区和/或神经元靶标选择以及随后的aav手术中递送。脑室内空间或脑区靶向和递送可以涉及使用标准立体定向框架(leksell，crw)或使用无框方法，伴随或不伴随手术mri。aav的实际递送可以通过针头或套管注射，内腔内衬或不内衬材料，以防止aav载体的吸附(例如，smartflow套管、mri介入套管)。递送装置以预编程的输注速率和体积与注射器和自动输注或微量输注泵接口连接。注射器/针的组合或仅针可以与立体定向框架直接接口连接。输注可以包含恒定流动速率或变化的加强对流传递速率。[0244]实例[0245]实例1：启动子选择[0246]在野生型新生小鼠中进行生物分布研究以选择启动子以恢复eef1a2在神经元中的表达。与所有其它候选启动子相比，人突触素(hsyn)启动子对神经系统表现出优越的选择性和强烈的神经元表达，如表1所示。令人惊讶的是，与esyn和其它测试的启动子相比，hsyn启动子显示出更大的神经元选择性。[0247]表6[0248]启动子eef1a2转基因的脑细胞嗜性cmv神经元和神经胶质ef1a强神经元增强突触素(esyn)神经元和神经胶质人突触素(hsyn)强神经元[0249]实例2：eef1a2基因敲除小鼠模型的aav9基因疗法挽救[0250]我们已经为受eef1a2基因突变影响的受试者(例如，儿童)开发了一种新的治疗方法。真核翻译伸长因子1α2(eef1a2)对于将氨酰基转移rna递送到核糖体以进行蛋白质合成至关重要。eef1a2基因突变与严重的智力残疾、自闭症和癫痫有关。目前没有有效的治疗方法。eef1a2敲除小鼠模型(废弃小鼠)已得到很好的表征。废弃(wst/wst)小鼠在断奶后表现出步态障碍和震颤，然后在23日龄时出现麻痹和运动神经元变性。使用这种小鼠模型，发明者测试了蛋白质的功能是否可以通过基因疗法恢复。我们使用泛神经元启动子人突触素设计了一种腺相关病毒9(aav9)，来驱动人eef1a2 cdna(hsyn-eef1a2)的表达。包含了egfp标记基因以跟踪构建体在体内的表达。免疫荧光(图7)显示了新生儿ic或iv注射aav9-hsyn-eef1a2-t2a-egfp后的神经元靶向。免疫组织化学染色(图8)证实了来自单次注射raav的两种施用途径后cns中广泛表达转基因(对于eef1a2-2a-egfp或单独的egfp标志物)。[0251]基因疗法载体被证明可有效治疗废弃(wst/wst)小鼠。eef1a2-/-敲除小鼠(wst/wst)在注射ic时大多存活(3/4)，并在注射ic和iv时全部存活(图9a)。未经治疗的小鼠死于p23。与wt小鼠相比，ic或ic/iv小鼠同样没有显示重量减轻，而未经治疗的对照小鼠表现出重量减轻，从而导致p23死亡(图9b)。转棒仪和倒置网格分析表明，在治疗后的性能没有下降(图9c和图9d)。双向anova和邓尼特多重比较测试的结果都很显著。[0252]在野生型、ic和组合治疗(图9e和图9f)中，在整个脑中观察到eef1a2表达。eef1a2表达存在于野生型、ic和组合治疗组的脊髓组织中。然而，在未经治疗的废弃组和iv治疗组中没有表达(f)。[0253]实例3：eef1a2d252h或eef1a2g70s或eef1a2e122k小鼠模型的aav9基因疗法挽救[0254]对图2-5和图6所示的载体设计的功效以及各种密码子优化进行比较，以鉴定出具有优越功效的载体。实验在小鼠模型中进行，这些模型概括了在人类(d252h，g70s和或e122k)和/或具有严重神经退行性表型(del.22.ex3)的小鼠模型中发现的三种突变。在新生小鼠和成人发育的后期阶段进行实验，以确认编码eef1a2的aav载体可以挽救存活期、重量减轻和行为表型。对神经行为测试的有益影响的评估包含对旋转圆柱体(转棒仪)的性能、附着在悬挂电线表面的能力(电线悬挂测试)、脚部故障测试、倒置网格行为、握力和在开放场地中的行为，包含观察正常的探索活动或异常行为(例如“抽搐行为”)。可以获得一系列测试的集体神经评分，以评估注射aav9-eef1a2的小鼠相对于未经治疗的对照的神经行为功能，其包含后肢扣紧、步态、后凸和沿壁架行走的能力的分析。del.22.ex3(或其它脑电图(eeg)异常的小鼠品系)小鼠癫痫发作频率和脑电图的改变延长了寿命，这揭示了减轻cns中异常电活动的有益作用。生化和组织学分析证实，载体设计对cns内eef1a2表达水平和分布具有卓越的功效。组织分析包含通过蛋白质印迹和elisa检测新鲜组织中的mrna、dna、载体拷贝数和转基因蛋白表达，以及通过免疫标记检测cns固定切片中的mrna、dna、载体拷贝数和转基因蛋白表达。[0255]实例4：在eef1a2不足的wst/wst小鼠模型中，aav9介导的人eef1a2蛋白向中枢神经系统的递送的影响[0256]eef1a2相关病症的一个主要模型是废弃小鼠模型，其中eef1a2基因的第一外显子和所有启动子元件的自发缺失导致eef1a2无效(wst/wst)。在未经治疗的动物中，31％的wst/wst小鼠在p20-22之间死亡，并且存活的wst/wst小鼠表现出重量衰减、震颤随后重量减轻，其余的在第24天全部死亡。未经治疗的动物也可能表现出握力受损和转棒性能受损，动物在最长的发育性震颤、进行性瘫痪和重量减轻中幸存下来。我们的wst/wst集群中的动物看起来更严重，衰退更剧烈，死亡更早。通过p23处的倒置网格掉棒潜伏期，我们已经观察到握力受损。由于wst/wst动物只能存活到p24，我们没有观察到转棒性能的恶化，以显著区分wst/wst与野生型动物。[0257]材料和方法[0258]动物福利[0259]所有动物实验均按照英国内政部和1986年的动物(科学程序)法案进行，并在伦敦大学学院伦理审查委员会的指导方针内进行。本研究中使用的wst/wst eef1a2无效小鼠模型之前已经描述过(chambers d等人《美国科学院院报(pnas)》95:4463-8(1998).)。对杂合小鼠进行时间交配以产生混合基因型窝。使用引物在p0对幼崽进行基因分型(引物eef1a2 mut f 5'accagtggtttcacctgctc 3'、eef1a2 common r 5'cactgtgggggctctggttt 3'、eef1a2 wt f 5'cagagcttcactcagtctg 3')。[0260]aav9-eef1a2载体或对照品的施用是通过在p0处双侧脑室内注射到新生纯合wst/wst或wt同窝幼崽进行的，并随访动物至人道终点(重量减轻≥15％)或定时处死点p60。如前所述，脑室内注射被定向到p0-1小鼠的侧脑室(newbery hj等人《神经病理学与实验神经病学杂志(j neuropathol exp neurol)》64:295-303(2005))。将33号针(汉密尔顿)垂直插入注射部位至3mm深度，并在5秒内将5μl载体施用到侧心室中。幼崽被迅速送回母鼠。基因疗法治疗的wst/wst小鼠的组大小为6，7个窝中14-16个对照同窝。[0261]行为研究[0262]定期对小鼠进行称重并评估其总体幸福感的变化和达到人道终点。在p23处进行行为测试转棒仪和倒置网格测试。所有行为测试均由对动物治疗组不知情的研究人员进行。将小鼠放置在转棒仪(harvard )上，从4-40r.p.m.连续加速，持续最多5分钟。记录小鼠从棒上掉下来的时间，在每天的测试中对每只动物进行3次试验(掉棒潜伏期)。倒置网格测试涉及将小鼠放在不锈钢网格(41x25cm)上，该网格放置在30cm高架塑料透明盒上。记录从倒置网格的掉棒潜伏期，最长为5分钟。在测试的每一天，对每只小鼠重复3次倒置网格测试。[0263]小鼠组织的组织学和免疫组织化学分析[0264]使用pbs通过末端经心灌注剔除小鼠。将收集的组织(脑和内脏器官)减半，以允许不同的处理技术。将用于免疫组织化学的脑在4％ pfa中后固定48小时，并转移到30％蔗糖溶液中，在4℃下进行冷冻保护直至切片。将脑封固在冷冻切片机(hm430)上，厚度为40μm，处于任一冠状面。进行基于自由浮动的免疫组化分析，以240μm的间隔选择脑切片进行全脑免疫组织化学。简而言之，将自由漂浮的切片在室温下在15％正常山羊血清(vector)-tris缓冲盐水中用0.1％triton-x(tbs-t)封闭1小时，并在初级抗体抗兔eef1a2中在10％正常山羊血清-tbs-t中在4℃下温育过夜。第二天将切片与各自的物种特异性二级抗体(vector)一起在室温下温育1小时，在tbs中洗涤，然后与vectatain亲和素-生物素溶液(vector)一起温育。将反应用3,3'-二氨基联苯胺(dab)可视化。使用冰冷的1x tbs停止dab反应，并在封固到双涂层糊化载玻片上之前清洗切片。将封固的切片风干并在100％乙醇中脱水10分钟，并用脱水溶液(histocleartm，national)脱水30分钟，然后用封固剂(dpx，vwr)覆盖以进行盖玻封片。[0265]对于免疫荧光，将脑切片在15％山羊血清中封闭30分钟，然后在4℃下与初级抗体(兔eef1a2 1:1000和小鼠neun 1:1000 milipore)一起在10％正态山羊血清tbs-t 0.3％中温育过夜。将切片在1xtbs中洗涤，并与分别用alexa 488和alexa 594(均来自稀释在10％正常山羊血清中)标记的物种特异性二级抗体一起在室温下温育2小时。将nv4ei用dapi(sigma)染色2分钟。将脑切片封固在双涂层载玻片上，并使用fluromount gtm(thermofisher)进行盖玻封片。[0266]光学显微镜和荧光成像均使用徕卡dm 4000与徕卡dfc420相机系统联动进行。使用徕卡tcs sp5 aobs共聚焦显微镜捕获共聚焦图像。使用image j软件(美国国立卫生研究院)分析图像。[0267]免疫印迹[0268]在补充有蛋白酶抑制剂的冰冷的0.32m蔗糖中，使用组织裂解器从小鼠脑组织中提取蛋白质，并在4度下离心15分钟。使用pierce bca蛋白质测定试剂盒(thermo )测量蛋白质浓度：用laemmli缓冲液(bio-rad )和二硫苏糖醇(dtt)使10μg蛋白质变性。使用mini-protean tgxtm免染色凝胶(bio-rad )分离蛋白质，并将其转移到trans-blot turbo转印膜(bio-rad )上。在室温下在封闭缓冲液中封闭1小时后，将膜与初级抗体兔eef1a2(1:1000)和小鼠gapdh(ab 1:10,000)一起在4℃下温育过夜。然后将膜与二级starbrighttmblue 520山羊抗兔igg(1:3000)和starbrighttm blue 700山羊抗小鼠igg(1:3000)一起孵育。将免疫反应蛋白用chemidoc mp(bio-rad )可视化。上样n＝4-5个生物重复[0269]qrt-pcr mrna转录本表达分析[0270]按照制造商的说明，用rneasytm迷你试剂盒从脑匀浆中提取rna(前脑，皮层每组n＝4-5个生物重复)，并在omega fluostartm上定量。使用dnase i纯化试剂盒从总rna(1μg)中去除污染dna，然后使用高容量cdna逆转录试剂盒(applied )进行逆转录。然后使用10ng的dna或合成的cdna进行多重heef1a2和mgapdh rt-qpcr(eef1a2__fwd1：atcgtgggcgtgaacaaa，eef1a2_rev1：ggttgtagccgatcttcttgat，eef1a2_探针：atcgtcaaggaagtcagcgcctac和小鼠gapdh，针对：acggcaaattcaacggcac，rev：tagtggggtctcgctcctgg，探针：ttgtcatcaacgggaagcccatca luna taqmantm预混液在quantstudiotm实时荧光定量pcr系统(applied)中。将gapdh作为内源性对照，计算相对倍数变化。[0271]统计学分析[0272]使用graphpad prismtm版本8对每个实验进行量身定制的统计分析。体内实验设计和样品量采用nc3r指导和功效计算进行设计。对于大多数动物实验分析，单向或双向anova是用bonferroni或tukey多重比较进行的。[0273]结果[0274]图10a-10k示出了以2e1011vg/动物施用的aav9载体的比较，包括图2(“v1”；seq id no:55)、图3(“v2”；seq id no:56)、图4(“v3”；seq id no:57)和图6(“v4”；seq id no:58)中所示的载体基因组。[0275]图10a fbs治疗的野生型、wst/wst、脑室内治疗的wst/wst动物用v1、v2、v3和v4基因疗法治疗的kaplan-meier存活图(2x1011vg/幼崽，所有基因疗法治疗组，n＝6，野生型fbs，n＝14，wst/wst fbs＝17)。所有基因疗法治疗的动物均显示出显著的寿命延长(平均延长v1＝4.4天，p＝0.001，v2＝3.8天，p＝0.0014，v3 10.7天，p《0.0001，v4＝4.4天，p＝0.001，对数秩曼特尔-考克斯检验(logrank mantel-cox test))。图10b小鼠的重量(数据均值±s.e.m.)。每天称重动物直到出生后35岁，此后每周称重，直到定时处死点p60或人道终点15％的重量减轻。图10c、图10d、图10e和图10f通过倒置网格测试和转棒进行的肌肉力量评估(每组n＝4-7，每只动物在15和23日龄时一式三份地进行测试)。这些测试在转棒上观察到wst/wst和野生型fbs对照组之间没有显著差异。与wt相比，在p23处观察到wst/wst fbs动物的握力显著降低，并且基因疗法载体对这些行为结果没有影响(数据均值±s.e.m.、双向anova)。图10g以野生型fbs为生理参考通过自由浮动免疫组织化学对整个脑的eef1a2的代表性免疫染色(每组n＝4-5，比例尺250μm)。所有注射v1-4的wst/wst动物在整个脑中表达eef1a2，其中v3观察到的最暗的染色和最高的表达。图10h在共表达eef1a2的神经元(neun标志物)皮质脑区中的代表性免疫组织荧光(每组n＝4.5，200μm)。与野生型相比，所有指标均表现出更高的神经元表达谱。通过荧光强度观察到的最高表达是v3显示贯穿所有皮质层的表达。所有图像均以恒定的成像设置捕获。在v2和v4中观察到皮质层4和5中更离散的表达。图10i脑中eef1a2的代表性免疫印迹，其中定量示出了eef1a2在整个脑中的表达，与v4载体相比，所有基因疗法载体在中脑、小脑和后脑区域中的表达更高(数据均值±s.e.m.、双向anova)。图10j前脑中的人eef1a2转录本表达的qpcr，其示出v1载体的最高mrna表达(数据均值±s.e.m.、双向anova)。图10k前脑中的人eef1a2皮层表达的qpcr，其示出v1载体的最高mrna表达(数据均值±s.e.m.、双向anova)。[0276]结论[0277]这些实验表明，所有四种载体都能够在具有eef1a2基因纯合无效突变(在小鼠中称为wst)的小鼠模型中恢复eef1a2的表达。令人惊讶的是，载体v1、v2和v3能够有效且显著地将wst/wst小鼠的存活期延长超过p23。(图10a)。此外，该实验出人意料地表明，eef1a2转基因在脑中的表达，特别是前脑(图10j)和皮层(图10k)，在v3中大于v1、v2或v4。不受理论约束，似乎与包含5'utr(seq id no:34)和/或3'utr(seq id no:48)在内的预期相反，在治疗上增加基因表达，从而延长存活期。[0278]实例5：在患有eef1a2疾病的d252h小鼠模型中，aav9介导的人eef1a2蛋白向中枢神经系统的递送的影响[0279]eef1a2中的杂合新生突变，编码组织特异性翻译伸长因子eef1a2，已被证明可引起神经发育障碍，通常包含严重的癫痫和智力残疾。大约有50种不同的错义突变被鉴定出来，但没有明显的功能丧失突变，尽管已知大的杂合缺失与生命相容。在相同的遗传背景下，携带引起错义d252h突变的疾病的敲入eef1a2小鼠模型比无效纯合子受到更严重的影响，其显示为重量减轻、神经评分增加和p23死亡。错义突变杂合的小鼠没有表现出行为异常，但在体重和运动功能方面确实存在性别特异性缺陷，握力短暂受损。这种d252h新型小鼠的表型与del22ex3无效小鼠模型一起支持了d252h突变导致功能增益(davies,faith cj等人《人类分子遗传学(human molecular genetics)》(2020))。该实例描述了杂合和纯合d252h小鼠的基因疗法研究。[0280]材料和方法[0281]在发育过程中监测经治疗小鼠和未经治疗小鼠的存活期和重量。在p18-24日龄之间也进行了行为测试。[0282]动物福利[0283]所有动物实验均按照英国内政部和1986年的动物(科学程序)法案进行，并在伦敦大学学院伦理审查委员会的指导方针内进行。将杂合d252heef1a2敲入小鼠进行时间交配以产生混合基因型窝。在p0处将幼崽使用引物5"-3"aggctaccccttaggcaggt、tgaacaaatggtaggtgggagg进行基因分型。pcr扩增后，将样品通过hin1ii(赛默飞世尔公司(thermo fisher))进行限制性酶切。[0284]测试品和控制品的施用[0285]通过向新生纯合敲入小鼠(d252h-/-)单侧脑室内注射1.8x1011vg/幼崽的剂量来实现5μl的v3载体或调配物缓冲液(fb)制品的施用。使用以下文献中划定的注射部位坐标，通过33号汉密尔顿针(fisher 英国拉夫堡)对野生型和杂合d252h施用测试或fb对照制品：kim等人kim,j.y.等人《可视实验杂志(j vis exp)》91:51863(2014)。lambdoid缝合线在新生幼崽中是可鉴定的，并且预期的注射部位是从lambdoid缝合线到眼睛的2/5，位于矢状缝合线约0.8mm-1mm的外侧，介于λ和前囟之间。注射后，幼崽被送回母鼠。[0286]体重[0287]从p1-p32收集个体动物体重，此后每周一次。重量减轻≥15％将达到安乐死的人道终点标准。[0288]行为测试[0289]所有行为测试测定均由对动物治疗组不知情的研究人员进行。转棒测试：从p18-24进行转棒仪训练/测试。将小鼠放置在转棒仪(哈佛仪器公司(harvard apparatus))上，从4-40r.p.m.连续加速，持续最多2分钟。记录小鼠从棒上掉下来的时间，在每天的测试中对每只动物进行3次试验(掉棒潜伏期)。倒置网格测试：倒置网格测试涉及将小鼠放在不锈钢网格(41x25cm)上，该网格放置在30cm高架塑料透明盒上。记录从倒置网格的掉棒潜伏期，最长为2分钟。在测试的每一天，对每只小鼠重复3次倒置网格测试。[0290]结果[0291]图11a-11c示出了未经治疗的d252h-/-小鼠的表型。图11a：fbs治疗的野生型、敲除(d252h-/-)，脑室内v3基因疗法治疗的d252h-/-的kaplan-meier存活图(2x1011vg/幼崽，v3治疗的＝2，v4治疗的＝1，野生型fbs，n＝5，d252h-/-fbs＝3。图11b小鼠体重(数据均值±s.e.m.)。图11c通过转棒仪进行的运动评估(数据均值±s.e.m.、双向anova和邓尼特多重比较)。[0292]结论[0293]这些实验表明，与未经治疗的d252h-/-对照相比，aav9介导的eef1a2在具有v3的d252h-/-小鼠中的表达可以增加存活期。此外，尽管d252h-/-纯合小鼠的转棒性能始终较差，但在d252h-/-v3治疗的小鼠中，随着时间的推移一直观察到改善的趋势。在先验定义的长期安全性/耐受性研究中，对d252h/+杂合小鼠脑室内施用v3后，eef1a2的过表达似乎对存活期或功能结果测量没有有害影响。在纯合和杂合d252h小鼠中进行的分析将进一步表征aav9介导的eef1a2过表达在eef1a2缺陷模型中的长期影响。[0294]实例6：在患有eef1a2疾病的del22ex3小鼠模型中，aav9介导的人eef1a2蛋白向中枢神经系统的递送的影响[0295]生成了crispr/cas9生成的del.22.ex.3eef1a2小鼠模型以敲除eef1a2表达(davies,faith cj等人《人类分子遗传学》2020)。由crispr/cas9诱变产生的eef1a2外显子3内的22个碱基对缺失导致无效突变。这些del22ex3小鼠呈现严重的表型，使得小鼠在疾病发作后(～21-25天)存活时间不长，患有早发性运动神经元变性伴瘫痪，伴有致命性癫痫发作的其它临床相对症状。该实例描述了纯合del22ex3 eef1a2无效小鼠的基因疗法研究。[0296]材料和方法[0297]在发育过程中监测经治疗小鼠和未经治疗小鼠的存活期和体重。在p21-25日龄的关键窗口之间也进行了行为测试。[0298]动物福利[0299]所有动物实验均按照英国内政部和1986年的动物(科学程序)法案进行，并在伦敦大学学院伦理审查委员会的指导方针内进行。将杂合del22ex3小鼠进行时间交配以产生混合基因型窝。在p0处将幼崽使用引物5"-3"5'-tgagttgtgcctctaccctt-3'和5'-tacaggcacatcccaggtgt-3'进行基因分型。[0300]测试品和控制品的施用[0301]以2x1011vg/幼崽(v3高剂量)或2x1010vg/幼崽(v3低剂量)的剂量向新生纯合del22ex3小鼠(del22ex3)幼崽施用10μl(每个半球5μl，双侧)v3载体或调配物缓冲液(fbs)的脑室内注射。使用以下文献中划定的注射部位坐标，通过33号汉密尔顿针(fisher 英国拉夫堡)向野生型和纯合del22ex3小鼠施用调配物缓冲溶液(fbs，5μl双侧)作为对照：kim等人kim,j.y.等人《可视实验杂志》91:51863(2014)。lambdoid缝合线在新生幼崽中是可鉴定的，并且预期的注射部位是从lambdoid缝合线到眼睛的2/5，位于矢状缝合线约0.8mm-1mm的外侧，介于λ和前囟之间。注射后，幼崽被送回母鼠。[0302]体重[0303]每天从p1-p30收集个体动物体重，此后每周一次。重量减轻≥15％被用作安乐死的人道终点标准。[0304]行为测试[0305]转棒仪训练和测试发生在p21-25日(p21被认为是训练日)。所有行为测定均由对动物治疗组不知情的研究人员进行。将小鼠放置在转棒仪(哈佛仪器公司(harvard apparatus))上，从4-40r.p.m.连续加速，持续最多2分钟。记录小鼠从棒上掉下来的时间，在每天的测试中对每只动物进行3次试验(掉棒潜伏期)。[0306]使用握力计测量p21-25之间的肢体肌肉力量(p21被认为是训练日)。一式三份地测量所有四肢或前肢的握力，每次测试之间休息1分钟，让小鼠休息。对于每次测试，小鼠被握住被尾巴的底部并降低到网格上，直到它用前爪或所有四只爪子抓住。[0307]神经评分[0308]壁架测试：将每只小鼠放在空笼子的壁架上并允许其自由探索。观察小鼠沿着笼子的边缘行走并将自己放进笼子里，并相应地评分：0＝自信的行走和良好的着陆，1＝行走时的绊倒和摇摆，2＝绊倒和摇晃，从壁架滑倒但恢复；3＝无法沿壁架行走[0309]后肢扣紧测试：抓住小鼠尾巴底部附近并悬浮在空中10秒。观察后肢的位置并评分如下：0＝后肢始终向外指向远离腹部，1＝后肢在超过50％的悬挂时间内略微向身体拉动，2＝后肢在超过50％的悬挂时间内向下指向腹部，3＝后肢在超过50％的悬挂时间内完全缩回并接触腹部。[0310]步态测试：将动物放在平坦的表面上，头部背对研究者，然后从后面观察它走路时的行为，其行为评分如下：0＝小鼠正常移动，四肢支撑体重，腹部不接触地面，双后肢均匀参与，1＝观察到轻微震颤，骨盆略微抬高或轻微蹒跚，2＝严重震颤，骨盆凸起或明显的蹒跚，3＝运动脱节，骨盆凸起和严重蹒跚。小鼠可能根本移动不了多少。[0311]脊柱后凸测试：将小鼠放在平坦的表面上，并在行走时从侧面观察，其评分如下：0＝行走时容易伸直脊椎，1