过表达音猬因子的毛囊干细胞在毛囊再生中的作用研究

　　脱发是一个造成患者心理困扰、影响社会交流的严重问题，治疗效果不理想[-]。脱发可由各种病理、环境或心理因素引起，最终导致毛囊结构异常或再生障碍[]。近年来关于如何调节毛囊生长的研究取得了一定进展，特别是发现了毛囊干细胞（hair follicle stem cells，HFSCs）[]。HFSCs具有形成克隆、自我更新和多系谱分化的能力，因免疫原性低、分化再生能力强，已用于多种疾病的治疗研究，成为生物医学领域的研究热点[-]。HFSCs可调节毛发生长周期，逆转脱发发生[]。已有实验将人皮内和皮下脂肪组织来源的HFSCs用于治疗雄激素性脱发患者，经过一定治疗周期后发现患者毛发密度显著增加[]。但目前干细胞移植存在的最大问题之一就是移植后干细胞存活率较低。HFSCs的增殖与毛发生长周期息息相关[-]。因此，调控HFSCs的增殖活性有助于提高干细胞移植治疗效果，促进毛囊再生。

　　音猬因子（Sonic hedgehog，Shh）可调节包括毛囊在内的许多组织增殖和发育模式[]。在胚胎发生过程中，Shh调节胚胎发育和成年动物毛囊发育，影响成年毛囊的循环和生长[]。有研究在探究高脂饮食诱导HFSCs命运变化的机制中发现，Shh在肥胖小鼠的HFSCs中显著下降；通过转基因小鼠特异性抑制HFSCs中的Shh信号1周后，小鼠HFSCs开始枯竭，毛囊小型化或丢失，1个月后背部出现明显脱毛[]。Abe等[]发现在毛囊成熟阶段，Shh的缺失选择性降低了毛发发育过程中毛囊内角质形成细胞增殖，从而使上皮细胞向下生长失败，且Shh–/–小鼠的毛囊减少。这些研究均表明Shh对HFSCs的功能至关重要。但Shh在HFSCs中的功能及两者协同对毛囊再生的影响，目前仍不清楚。

　　为提高干细胞移植治疗效果，可对干细胞进行基因修饰、细胞因子预处理等措施[]。基于此，我们通过对HFSCs中的基因进行改造，旨在改善HFSCs的生存和组织再生能力，将改造后的细胞用于脱发治疗，提高干细胞移植的效率和治疗效果。

　　毛囊来自于2021年12月—2022年8月中国人民解放军中部战区总医院皮肤科收治的20例40～50岁女性脱发患者，在获取毛囊术前已告知患者及家属手术风险与术后可能发生的不良反应，患者均知情同意并签署知情同意书。

　　6～8周龄SPF级雌性BALB/c-nu裸鼠25只，体质量（20.88±0.52）g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司。

　　过表达Shh（NM_000193）慢病毒由上海吉凯基因化学技术有限公司合成；实验所需引物由北京擎科生物技术有限公司合成；人MSCs无血清基础培养基（天津灏洋华科生物科技有限公司）；100 U/mL 青、链霉素（石家庄制药集团有限公司）；0.25%胰蛋白酶、无血清细胞冻存液（广州赛国生物科技有限公司）；SYBR Green Master Mix试剂盒、HiScript?ⅡQ RT SuperMix for qPCR逆转录反应试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）；BCA蛋白浓度测定试剂盒、RIPA总蛋白浓度测定裂解液（北京索莱宝科技有限公司）；CD29、CD34、CD71流式抗体（Biolegend公司，美国）；Shh抗体、β-actin抗体（武汉三鹰生物技术有限公司）；细胞角蛋白15（cytokeratin 15，CK15）抗体（Abcam公司，英国）；细胞计数试剂盒8（cell counting kit 8，CCK-8）、细胞周期检测试剂盒（南京凯基生物技术股份有限公司）；浓缩型正常山羊血清（封闭）、荧光（Cy3）标记羊抗兔IgG（武汉博士德生物工程有限公司）；DAPI（上海碧云天生物技术有限公司）。

　　超净工作台（苏州集团安泰空气技术有限公司）；CO2恒温箱（SANYO公司，日本）；冷冻高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；流式细胞仪（BD Biosciences公司，美国）；Light Cycle96实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）仪（上海罗氏集团）；WD-9413B凝胶成像分析仪（北京六一生物科技有限公司）；生物显微镜、荧光显微镜汞灯（Olympus公司，日本）；酶标仪（上海天能科技有限公司）；病理切片机（RM 2016轮转式切片机；Leica公司，德国）；JK-6生物组织摊烤片机、JT-12J电脑生物组织脱水机（武汉俊杰电子有限公司）。

　　从20例脱发患者头皮正常区和脱发区分别随机拔取1个毛囊，得到40个毛囊样本。从两区毛囊中获取原代HFSCs并传代，得到正常组（H1组）和脱发组（H2组）HFSCs。具体方法：用75%乙醇消毒拟取样部位头皮，选取毛囊结构完整的毛发，在含100 U/mL青、链霉素的PBS中浸泡5 min；剪取毛囊中间段，接种于10 cm2培养皿底面上，添加5 mL 100 U/mL青、链霉素溶液的人MSCs无血清基础培养基重悬于培养皿中，于37℃、5%CO2孵箱中培养。当毛囊贴壁时，继续添加5 mL培养基，此后每隔3 d换液1次，直至周围有细胞爬出时换液；然后每隔3 d换液1次，待细胞融合至80%时传代。

　　取两组第4代生长良好的HFSCs，0.25%胰蛋白酶消化后添加相同体积新鲜培养基重悬细胞，制备密度为5×105个/mL的细胞悬液，分装至15 mL离心管中（500 μL/管）；以离心半径13.5 cm、1 500 r/min离心2 min，弃上清。加入约1 mL预冷后PBS进行细胞重悬，取300 μL细胞悬液平均分配至3个新的15 mL离心管内（10 μL/管）。按照抗体使用说明书，依次往3个离心管中添加 CD29、CD71、CD34流式抗体各5 μL，避光培养30 min；加入1 mL预冷后PBS冲洗未结合的抗体后，同上法离心2 min，弃上清。将300 μL预冷后PBS分别添加至3个离心管中，充分混匀后将细胞悬液依次转入3个新的流式管中，上机检测。

　　分别取两组第4、7、10代细胞，以Trizol法提取细胞总mRNA，紫外分光光度计鉴定并定量。利用HiScript?ⅡQ RT SuperMix for qPCR逆转录反应试剂盒将总RNA逆转录为cDNA。RT-qPCR反应按SYBR Green Master Mix试剂盒说明书进行。以β-actin为内参，用2–??Ct法计算Shh mRNA相对表达量。引物序列（5′→3′）：Shh正义TTCCCTTCATACCTTCCG，反义TAGTCCTCGTCTCCTCGC，产物长度166 bp；β-actin正义CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC，反义TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT，产物长度240 bp。

　　分别取两组第4、7、10代细胞，加入4℃预冷PBS洗涤细胞3次，随后加入适量RIPA裂解缓冲液于冰上裂解10 min；4℃以离心半径13.5 cm、12 000 r/min离心10 min后收集上清液，按照BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书进行蛋白浓度定量。取蛋白样本加入5×蛋白上样缓冲液，沸水中水浴10 min使其变性后，行SDS-PAGE电泳，电泳后转膜，5%脱脂奶粉室温下封闭2 h，分别加入一抗Shh（1∶600）及内参GAPDH（1∶4 000）4℃过夜，再用TBST洗膜3次后加入辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗（1∶10 000），室温下振荡孵育2 h；再次洗膜3次后加入ECL试剂显色，放入凝胶成像仪中曝光成像，成像结束后采用Image-Pro Plus软件分析胶片灰度值，以与内参β-actin比值作为Shh蛋白相对表达量。

　　分别取两组第7代细胞，经0.25%胰蛋白酶消化后，制备密度为5×103个/mL的细胞悬液。待细胞贴壁融合约50%后，将细胞悬液加入10 cm2培养皿，添加培养基使皿中总体积为10 mL。从–80℃冰箱中取出Shh慢病毒溶液置于冰上融化，以预实验确定的最佳感染复数100转染细胞，得到过表达Shh 的正常组（H1-HFSCShh组）和脱发组（H2-HFSCShh组）；同时使用Shh阴性慢病毒和培养基转染细胞，得到正常空载组（H1-HFSCNC组）和脱发空载组（H2-HFSCNC组）作为对照。然后于细胞培养箱中进行培养，24 h后更换新鲜培养基继续培养。

　　病毒转染72 h后，取各组细胞采用荧光显微镜观察，若观察到绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）表达，即为Shh慢病毒携带的荧光，根据以下公式计算病毒感染率：病毒感染率=荧光细胞数/明视野细胞数×100，病毒感染率达近90%即为转染成功。

　　同1.3方法采用RT-qPCR和Western blot检测各组Shh蛋白和mRNA相对表达量，并与H1组和H2组进行比较。

　　取增殖状态好、在对数生长期的H1-HFSCNC组、H2-HFSCNC组、H1-HFSCShh组和H2-HFSCShh组细胞悬液，以1×104个/mL浓度加入96孔板，每孔100 μL。将其移入恒温细胞培养箱中过夜（将100 μL无菌1×PBS添加至细胞周围孔内），每组设3个复孔。于细胞接种后24、48、72、96 h分别加入10 μL CCK-8溶液，37℃培养4 h后酶标仪检测450 nm处吸光度（A）值。

　　取处于生长期的H1-HFSCNC组、H2-HFSCNC组、H1-HFSCShh组和H2-HFSCShh组细胞，用胰蛋白酶消化，制备浓度为3×105个/mL的细胞悬液；4℃以离心半径13.5 cm、1 500 r/min离心2 min，用预冷1×PBS重悬细胞冲洗2次，同上法离心吸弃上清液后用100 μL预冷1×PBS重悬细胞，然后缓慢加入预冷80%乙醇700 μL，4℃固定4 h以上；同上法离心2 min后重复预冷1×PBS润洗2次；加入100 μL RNase（50 μg/mL）溶液，37℃孵育30 min；加入400 μL碘化丙啶（50 μg/mL），4℃避光染色30 min后上机检测。比较各组G0/G1期、S期和G2/M期的细胞比例，按以下公式计算增殖指数：增殖指数=（S+G2/M）/（G0/G1+S+G2/M）×100%。

　　消化收集4组（H1-HFSCNC组、H2-HFSCNC组、H1-HFSCShh组和H2-HFSCShh组）细胞，以无菌生理盐水洗涤2次，再以无菌生理盐水重悬制成浓度为4×106个/mL的细胞悬液。裸鼠适应性饲养1周后，根据注射溶液不同分为实验组（H1-HFSCNC组、H2-HFSCNC组、H1-HFSCShh组和H2-HFSCShh组）和对照组（生理盐水组），每组5只。实验组取200 μL对应细胞悬液于裸鼠背部皮内单点注射，每周注射2次，对照组同法注射等量生理盐水，共注射5周。每周观察裸鼠背部注射部位毛发生长情况，5周后处死裸鼠，取注射部位皮肤组织进行观测。

　　各组取100 mg皮肤组织置于培养皿中，手术剪剪成3 mm×3 mm左右小块，加入0.5～1.0 mL RIPA裂解缓冲液，于低温下玻璃匀浆器手动匀浆；取组织匀浆液转移至1.5 mL预冷的离心管，4℃以离心半径13.5 cm、12 000 r/min离心5 min后收集上清液；将上清液转移至新的预冷离心管中，按照BCA蛋白浓度测定试剂盒方法测定蛋白浓度，同1.3.2方法检测Shh蛋白相对表达量。

　　将各组组织标本石蜡包埋后行5 μm厚切片，取部分切片常规行HE染色，光镜下观察并计数各组毛囊数量。

　　将上述部分标本切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化后，蒸馏水清洗3～5次，用浓缩型正常山羊血清封闭液处理20 min，分别加入一抗（CD71、CK15，稀释比例为1∶200）4℃孵育过夜；次日，1×PBS清洗3次后，加入与一抗对应种属的荧光二抗37℃反应30 min；PBS清洗3次，滴入DAPI复染，PBS清洗后用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，于荧光显微镜下观察各组HFSCs表面阳性标志物CD71和CK15的荧光强度差异，应用Image-Pro Plus 6.0软件进行CD71、CK15荧光强度定量检测。

　　采用Graphpad Prism 9.0软件进行数据分析并统计作图。计量资料行正态性检验，均符合正态分布，数据以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Tukey检验；检验水准α=0.05。

　　光镜观察示，培养72 h后可见梭形样细胞从毛囊组织中向外爬出，早期原代细胞呈圆形、梭形、三角形等；经3次传代后，细胞多为长梭形且贴壁速度快，H1组和H2组细胞形态无明显差别。见。流式细胞仪检测示第4代细胞表面CD29和CD71呈高表达，接近100%， CD34基本不表达，提示培养细胞为HFSCs。见。

　　RT-qPCR和Western blot检测示，H1组和H2组细胞中Shh蛋白及mRNA相对表达量随代次增加呈逐渐下降趋势，各代次间两两比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见。

　　将Shh慢病毒和阴性慢病毒转染HFSCs 72 h后，荧光显微镜下均观察到绿色荧光出现。H1-HFSCNC组、H1-HFSCShh组、H2-HFSCNC组和H2-HFSCShh组病毒感染率分别为85.65%±2.07%、87.16%±2.90%、85.31%±2.38%、82.80%±2.82%；提示目的基因在细胞内表达情况良好，可用于后续实验。见。

　　RT-qPCR和Western blot检测示，H1-HFSCShh组和H2-HFSCShh组中Shh蛋白及mRNA相对表达量均显著高于对应的H1-HFSCNC组、H2-HFSCNC组及H1组、H2组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见。表明已成功构建稳定过表达Shh的HFSCs细胞株，慢病毒转染后达到了靶向调控Shh目的基因及蛋白的作用。

　　随细胞接种时间延长，各组A值均呈逐渐增加趋势。接种48 h后，H1-HFSCShh组和H2-HFSCShh组的增殖斜率分别显著高于对应的H1-HFSCNC组和H2-HFSCNC组，H1-HFSCShh组显著高于H2-HFSCShh组，H1-HFSCNC组亦显著高于H2-HFSCNC组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见。

　　在S期和G2/M期，H1-HFSCShh组和H2-HFSCShh组细胞周期百分比显著高于对应的H1-HFSCNC组和H2-HFSCNC组，H1-HFSCShh组显著高于H2-HFSCShh组，H1-HFSCNC组亦显著高于H2-HFSCNC组；各组在G0/G1期的细胞比例与S期和G2/M期相反；以上差异均有统计学意义（P<0.05）。

　　H1-HFSCShh组和H2-HFSCShh组细胞增殖指数显著高于对应的H1-HFSCNC组和H2-HFSCNC组，H1-HFSCShh组显著高于H2-HFSCShh组，H1-HFSCNC组亦显著高于H2-HFSCNC组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见。

　　H1-HFSCShh组Shh蛋白相对表达量显著高于H1-HFSCNC组和对照组，H2-HFSCShh组显著高于H2-HFSCNC组和对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见。

　　各实验组裸鼠背部皮肤组织内毛囊数量均显著多于对照组，H1-HFSCShh组和H2-HFSCShh组分别多于对应的H1-HFSCNC组和H2-HFSCNC组，H1-HFSCShh组显著多于H2-HFSCShh组，H1-HFSCNC组亦显著多于H2-HFSCNC组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见。

　　各实验组CD71和CK15的荧光强度均显著高于对照组，H1-HFSCShh组和H2-HFSCShh组高于对应的H1-HFSCNC组和H2-HFSCNC组，H1-HFSCShh组显著高于H2-HFSCShh组，H1-HFSCNC组亦显著高于H2-HFSCNC组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见。

　　HFSCs已被证实在毛发生长周期及毛囊再生中发挥着重要作用[-]。Shh通路是组织发育、体内平衡和修复中最重要的信号转导通路之一，它在胚胎发生过程中调节各种器官的形态发生，对促进表皮发育和修复以及毛囊发育有着重要作用[]。本研究中，我们成功分离人HFSCs，发现其Shh mRNA和蛋白表达水平随体外培养时间延长而逐渐下调；用过表达Shh的慢病毒转染HFSCs后，Shh在HFSCs内稳定表达，且经过转染后的HFSCs增殖活性升高。此外，裸鼠经细胞移植后，各实验组皮肤毛囊数量较对照组增多，HFSCs标记物表达水平也较对照组升高。上述结果表明，HFSCs对毛囊再生具有促进作用，过表达Shh的HFSCs能持续稳定地分泌和表达Shh，并结合干细胞和Shh的优势共同促进毛囊再生。本研究为脱发的干细胞疗法提供了一种新的治疗思路和选择。

　　HFSCs是较易获取的多能干细胞之一，能够快速增殖并分化成表皮细胞、毛囊细胞、内皮细胞和角质形成细胞等[]。相关研究已显示在机体的整个生命过程中，其通过静止和激活之间的循环来促进毛囊产生，在毛发生长的开始阶段，HFSCs经历短暂的活化以增殖，在毛发周期的剩余阶段又迅速恢复至静止状态[]。由于细胞表面缺乏Ⅰ类主要组织相容性复合体和免疫细胞，HFSCs未显示出免疫排斥反应，这也使其成为细胞疗法的通用供体[]。本次研究中，我们成功分离并鉴定了人HFSCs，为后续实验提供了可靠的数据支持。

　　利用基因工程技术改造细胞是目前再生医学中较为新颖的疗法，对许多全身性疾病都有治疗效果[-]。但在干细胞疗法中，通过重复传代培养收获的干细胞往往会失去增殖和多能分化的能力，从而影响治疗效果[]。因此改善细胞增殖稳态和维持干细胞群是开发新的脱发疗法的重要步骤。已知Shh通路对毛囊发育和毛发生长周期起到调节作用[]。本研究中，我们通过Western blot和RT-qPCR检测了正常组和脱发组第4、7、10代HFSCs中Shh蛋白和mRNA表达水平，发现二者表达水平随体外培养时间延长呈逐渐下降趋势，分析Shh表达可能与HFSCs的活性和增殖能力相关。因此我们采用Shh慢病毒转染方法建立了过表达Shh的HFSCs，结果显示病毒转染72 h后，Shh蛋白和mRNA表达水平均显著升高，提示本次研究已成功构建稳定过表达Shh的HFSCs细胞株。接着通过细胞增殖实验检测了转染后的细胞增殖能力，结果显示过表达Shh后HFSCs的增殖活性均较阴性对照组升高，且正常组细胞转染前后的增殖活性均高于脱发组细胞，这也说明了HFSCs的增殖分化受其周围微环境的影响，毛囊周围的信号会影响HFSCs活性[]。

　　毛囊作为一种多功能皮肤附属物，在组织稳态中起着至关重要的作用，可提供物理屏障以抵御外部伤害、促进体温调节和传递触觉[]。就人类而言，毛发会极大地影响一个人的外表和社会交流，各种破坏因素，如衰老、遗传、炎症和生理压力，会导致过度脱发，无论性别或年龄如何[]。目前已对脱发的治疗进行了许多研究，市场上只有口服非那雄胺和外用米诺地尔两种治疗药物获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准，但副作用较大，疗效存在较大个体差异、用药时间长，患者难以持续用药，因此对脱发疾病的治疗存在巨大需求[-]。近年来，再生医学和毛发组织工程领域的显著进步，为脱发的干细胞疗法带来了新希望。我们利用裸鼠模型进行体内研究，将转染前后的人HFSCs移植到裸鼠体内，小鼠背部的毛囊与人类类似，也具备毛囊生长周期，由于鼠的性别和品种，毛囊周期的精确同步化时间略有差别，但它身体的毛发大部分都是同步的[-]。裸鼠先天没有胸腺，存在免疫缺陷，是适宜于移植异种来源细胞的鼠的品种。在细胞移植5周后，背部组织Western blot结果显示Shh蛋白也有稳定表达；毛囊HE染色结果示，各实验组裸鼠背部毛囊数量均较对照组明显增加，免疫荧光染色示HFSCs标记物荧光强度亦较对照组明显升高，进一步表明过表达Shh可促进HFSCs的存活，进而促进毛囊再生。

　　本实验存在一定局限性：① HFSCs的存活时间较短，若提取时间过长，可能存在细菌污染和细胞活力下降问题；② 分离培养的HFSCs如何将浓度提纯至最大程度，降低外源性因素的干扰，也是一个关键问题；③ 由于人与鼠属不同，其毛囊也有差异，因此针对鼠类动物进行的实验并不能很好地用于人体临床治疗，未来仍需要在此问题上继续深入探索。

　　综上述，本研究表明HFSCs具有促进毛囊再生的潜力，过表达Shh后HFSCs的增殖活性显著升高，能持续稳定地分泌和表达Shh，并结合干细胞和Shh的优势共同促进毛囊再生，提高了细胞移植治疗效果，为干细胞治疗脱发提供一种新的治疗思路和选择。未来将进一步研究促进毛囊再生的分子靶点，为临床治疗脱发提供更多新途径。

　　利益冲突　在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突；经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道

　　伦理声明　研究方案经中国人民解放军中部战区总医院伦理委员会（［2022］032-01）及中国人民解放军中部战区总医院动物实验伦理委员会批准 ［中总动（福）第2022208号］；实验动物使用许可证号：SYXK（鄂）2018-0045

　　作者贡献声明　杨莹莹：研究实施、数据收集整理及统计分析、文章撰写；王刚：研究设计、数据收集整理及统计分析、行政支持；杨前：研究实施；刁波：研究设计、行政及经费支持