用于植入的中脑多巴胺（DA）神经元的制作方法

　　

　　本申请是申请日为2012年12月2日、申请号为201280066145.0、发明名称为“用于植入的中脑多巴胺(da)神经元”的专利申请的分案申请。

　　政府许可权利

　　本发明部分地在来自美国国立卫生研究所(unitedstatesnationalinstituteofhealth，nih)和国立神经病学和中风研究所(nationalinstituteofneurologicaldisordersandstroke，ninds)的nih/ninds资助金ns052671和nih/ninds资助金p50ns047085政府资助下作出。因此，美国政府对于本发明具有某些权利。

　　发明领域

　　本发明涉及干细胞生物学领域，具体地，涉及多能或多潜能干细胞的谱系特异性分化，上述多能或多潜能干细胞可以包括，但不限于，除了非胚胎人诱导的多能干细胞(hipsc)以外还有的人胚胎干细胞(hesc)、成体干细胞、来自患有疾病的患者的干细胞或者任何能够进行谱系特异性分化的其它干细胞。具体描述了以下方法：引导hesc和/或hipsc谱系特异性分化成底板中脑祖细胞，然后使用新的培养条件进一步分化成大量的中脑结局foxa2+lmx1a+th+多巴胺(da)神经元。使用本发明的方法产生的中脑结局foxa2+lmx1a+th+多巴胺(da)神经元进一步预期用于多种用途，其包括，但不限于，在体外药物发现检测中的用途、神经学研究、以及作为患者多巴胺神经元的疾病逆转或损伤或缺乏的治疗剂。而且，提供了从人多能干细胞分化中脑结局foxa2+lmx1a+th+多巴胺(da)神经元用于疾病建模特别是帕金森氏病的组合物和方法。此外，真正的da神经元富含标记物，例如cd142和a9型神经元细胞。

　　背景技术：

　　保留分化成许多种特化细胞类型的能力的细胞群体可用于形成大量的谱系特异性分化细胞群体。这些保留进一步分化成特化细胞的能力的细胞群体含有多能细胞。多能细胞可以来源自胚胎和/或非胚胎成体干细胞。

　　这些谱系特异性分化的细胞群体预期应用于具有导致特定细胞群体功能丧失的疾病的患者的细胞置换疗法中。除其直接治疗价值以外，谱系特异性分化细胞还是许多种用途的有价值的研究工具，其包括筛选检测，以鉴定、确认和测试功能特异性，或用于测试治疗分子的输送，以治疗细胞谱系特异性疾病。

　　之前使用胚胎干细胞和成体干细胞作为神经退行性疾病的治疗剂和模型系统。有关胚胎干细胞和成体干细胞定向分化的研究和技术发展已经在中枢神经系统(cns)疾病领域中进行，例如，用于亨廷顿氏舞蹈病、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病和多发性硬化。但是，这些研究的结果表明，这些细胞用于体内使患者恢复神经功能的能力几乎没有，而且常常导致患者中不期望的肿瘤生长。

　　因此，对于获得能够既用于研究且用作治疗导致具有特定功能的细胞丧失的疾病的治疗剂的细胞群体的组合物和方法存在有需求。

　　技术实现要素：

　　本发明涉及干细胞生物学领域，具体地，涉及多能或多潜能干细胞的谱系特异性分化，上述多能或多潜能干细胞可以包括，但不限于，除了非胚胎人诱导的多能干细胞(hipsc)以外还有的人胚胎干细胞(hesc)、成体干细胞、来自患有疾病的患者的干细胞或者任何能够进行谱系特异性分化的其它干细胞。

　　具体描述了以下方法：引导hesc和/或hipsc谱系特异性分化成底板中脑祖细胞，然后使用新的培养条件进一步分化成中脑结局foxa2+lmx1a+th+多巴胺(da)神经元的大群体。使用本发明的方法产生的中脑结局foxa2+lmx1a+th+多巴胺(da)神经元进一步预期用于多种用途，其包括，但不限于，在体外药物发现检测中的用途、神经学研究、以及作为患者多巴胺神经元的疾病逆转或损伤或缺乏的治疗剂。而且，提供了从人多能干细胞分化中脑结局foxa2+lmx1a+th+多巴胺(da)神经元用于疾病建模特别是帕金森氏病的组合物和方法。此外，真正的da神经元富含标记物，例如cd142和a9型神经元细胞。

　　一种试剂盒，其包括第一信号传导抑制剂、第二信号传导抑制剂和第三信号传导抑制剂，其中所述第一抑制剂能够降低转化生长因子β(tgfβ)/activin-nodal(活化素-结节蛋白)信号传导，所述第二抑制剂能够降低smad(smallmothersagainstdecapentaplegic)信号传导，并且所述第三抑制剂能够降低用于活化wingless(wnt)信号传导的糖原合成酶激酶3β(gsk3β)。在一实施方式中，所述第一抑制剂是ldn-193189。在其他实施方式中，所述第一抑制剂选自ldn-193189、其衍生物及其混合物。在一实施方式中，所述第二抑制剂是sb431542。在其他实施方式中，所述第二抑制剂选自sb431542、其衍生物及其混合物。在一实施方式中，所述第三抑制剂是chir99021。在其他实施方式中，所述第三抑制剂选自chir99021、其衍生物及其混合物。在一实施方式中，所述试剂盒进一步包括音猬因子(sonichedgehog，shh)信号传导的激活剂和成纤维细胞生长因子(fgf)8受体家族信号传导的激活剂。在一实施方式中，所述试剂盒进一步包括脑源性神经营养因子(bdnf)、抗坏血酸(aa)、胶质细胞系源性神经营养因子、二丁酰camp和β3型转化生长因子。在一实施方式中，所述试剂盒进一步包括选自抗酪氨酸羟化酶(th)、抗叉头框蛋白a2(anti-forkheadboxproteina2，foxa2)和抗lim同源盒转录因子1α(lmx1a)的抗体。在一实施方式中，所述试剂盒进一步包括选自干细胞、胚胎干细胞、诱导的多能干细胞和工程细胞的细胞。在一实施方式中，所述试剂盒进一步包括用于分化祖细胞和中脑结局foxa2/lmx1a+多巴胺(da)神经元的说明书。在一实施方式中，所述试剂盒进一步包括从患有帕金森氏病(pd)的患者获取细胞的说明书。

　　一种组合物，其包括与第一信号传导抑制剂和第二信号传导抑制剂接触的细胞群体，其中大于40％的所述细胞群体对于叉头框蛋白a2(foxa2)是阳性的，其中所述细胞群体预先与第一信号传导抑制剂、第三信号传导抑制剂和音猬因子(shh)信号传导激活剂接触，其中所述第一抑制剂能够降低转化生长因子β(tgfβ)/activin-nodal信号传导，所述第二抑制剂能够降低用于活化wingless(wnt)信号传导的糖原合成酶激酶3β(gsk3β)信号传导，并且所述第三抑制剂能够降低smad(smallmothersagainstdecapentaplegic)信号传导。在一实施方式中，所述第一抑制剂是选自ldn-193189、其衍生物及其混合物的小分子。在一实施方式中，所述第二抑制剂选自chir99021及其衍生物。在一实施方式中，所述第三抑制剂选自sb431542、其衍生物及其混合物。在一实施方式中，所述音猬因子(shh)信号传导激活剂选自音猬因子(shh)c25ii和平滑(smo)受体小分子激动剂，其中所述激动剂是purmorphamine。在一些实施方式中，所述细胞群体进一步预先与成纤维细胞生长因子8(fgf8)接触。在一实施方式中，包括所述细胞群体的所述大多数细胞是叉头框蛋白a2(foxa2)+lim+同源盒转录因子1+,α(lmx1a),+ngn2+和ddc+底板中脑祖细胞。在一实施方式中，所述细胞群体选自啮齿类动物细胞、灵长类动物细胞和人细胞。在一实施方式中，所述细胞源自帕金森氏病(pd)患者细胞。在一实施方式中，所述细胞群体对于叉头框蛋白a2(foxa2)是至少50％阳性的。在一实施方式中，所述细胞群体对于叉头框蛋白a2是至少60％阳性的。在一实施方式中，所述细胞群体对于叉头框蛋白a2是至少70％阳性的。在一实施方式中，所述细胞群体对于叉头框蛋白a2是至少80％阳性的。在一实施方式中，所述细胞群体对于叉头框蛋白a2是至少90％阳性的。在一实施方式中，所述细胞群体对于叉头框蛋白a2是至少95％至多100％阳性的。

　　一种组合物，其包括体外细胞群体，其中包括所述细胞群体的大多数细胞是酪氨酸羟化酶(th)+叉头框蛋白a2(foxa2)+lim同源盒转录因子1+,α(lmx1a)+底板中脑多巴胺(da)神经元。在一实施方式中，所述大于40％的所述底板中脑多巴胺(da)神经元是酪氨酸羟化酶阳性的(th+)。在一实施方式中，所述细胞群体是至少50％酪氨酸羟化酶阳性的。在一实施方式中，所述细胞群体是至少60％酪氨酸羟化酶阳性的。在一实施方式中，所述细胞群体是至少70％酪氨酸羟化酶阳性的。在一实施方式中，所述细胞群体是至少80％酪氨酸羟化酶阳性的。在一实施方式中，所述细胞群体是至少90％酪氨酸羟化酶阳性的。在一实施方式中，所述细胞群体是至少95％至多100％酪氨酸羟化酶阳性的。在一些实施方式中，所述细胞群体包括大多数中脑结局foxa2/lmx1a+多巴胺(da)神经元。在一实施方式中，所述底板中脑多巴胺(da)神经元对于选自以下的标记物是阳性的：核受体nurr1(nr4a2)、神经元特异性iii类β-微管蛋白(tuj1)、ttf3、配对样同源域3(pitx3)、achaete-scute复合物(ascl)、早期b细胞因子1(ebf-1)、早期b细胞因子3(ebf-3)和转甲状腺素蛋白(ttr)。在一实施方式中，所述中脑结局foxa2/lmx1a+多巴胺(da)神经元群体对于选自da、3,4-二羟基-苯乙酸(dopac)和高香草酸(hva)的分子是阳性的。在一实施方式中，所述标记物选自蛋白质和核酸。在一些实施方式中，所述中脑结局foxa2/lmx1a+多巴胺(da)神经元群体能够在选自帕金森病(pd)患者的患者中体内植入。在一实施方式中，所述中脑结局foxa2/lmx1a+多巴胺(da)神经元能够体内植入，并提供多巴胺(da)神经元功能。

　　在一些实施方式中，本发明提供一种组合物，其包括与ldn-193189和chir99021接触的细胞群体，其中大于40％的所述细胞群体对于叉头框蛋白a2(foxa2)是阳性的，并且其中所述细胞群体预先与ldn-193189、sb431542、音猬因子(shh)信号传导激活剂和chir99021接触。在一实施方式中，所述音猬因子(shh)信号传导激活剂选自音猬因子(shh)c25ii和purmorphamine。在一实施方式中，所述大于10％的所述细胞群体对于叉头框蛋白a2(foxa2)和lim同源盒转录因子1,α(lmx1a)是双阳性的。在一实施方式中，所述大多数的所述细胞群体是底板中脑祖细胞群体。在一实施方式中，所述细胞群体预先与成纤维细胞生长因子8(fgf8)接触。在一实施方式中，所述细胞群体选自啮齿类动物细胞、灵长类动物细胞和人细胞。在一实施方式中，所述人细胞是来自具有帕金森氏病(pd)神经系统症状的患者的细胞。在一实施方式中，所述细胞群体源自诱导的多能干细胞(ipsc)。在一实施方式中，大于10％的所述细胞群体选自对于叉头框蛋白a2(foxa2)/lim同源盒转录因子1,α(lmx1a)是双阳性的，以及对于叉头框蛋白a2(foxa2)/orthodenticle同源盒2(otx2)是双阳性的。

　　在一实施方式中，本发明提供一种诱导细胞定向分化成底板中脑祖细胞群体的方法，其包括，a)提供：i)细胞群体，其中所述细胞群体选自非胚胎干细胞、胚胎干细胞、诱导的非胚胎多能细胞和工程多能细胞；和ii)第一信号传导抑制剂、第二信号传导抑制剂、音猬因子(shh)信号传导激活剂和第三信号传导抑制剂，其中所述第一抑制剂能够降低转化生长因子β(tgfβ)/activin-nodal信号传导，所述第二抑制剂能够降低smad(smallmothersagainstdecapentaplegic)信号传导，并且所述第三抑制剂能够降低用于活化wingless(wnt)信号传导的糖原合成酶激酶3β(gsk3β)信号传导；b)使所述细胞群体与所述第一抑制剂和所述第二抑制剂接触，c)在使所述细胞群体与所述第一抑制剂和所述第二抑制剂接触之后，在使底板中脑祖细胞群体分化的条件下，进一步使所述细胞与所述音猬因子(shh)信号传导激活剂接触；和d)在使所述细胞群体与所述音猬因子(shh)信号传导激活剂接触之后，进一步使所述细胞与所述第三抑制剂接触，以使所述细胞群体分化成底板中脑祖细胞群体。在一实施方式中，与所述第一抑制剂和所述第二抑制剂的所述接触在能够产生分化的底板中脑祖细胞群体的条件下进行。在一实施方式中，与所述第一抑制剂和所述第二抑制剂的所述接触在将细胞体外铺布的1小时内发生。在一实施方式中，与所述第一抑制剂和所述第二抑制剂的所述接触在将细胞体外铺布的48小时内发生。在一实施方式中，与所述第一抑制剂和所述第二抑制剂的所述接触在将细胞体外铺布的62小时内发生。在一实施方式中，所述细胞与所述音猬因子(shh)信号传导激活剂的所述接触在能够产生分化的底板中脑祖细胞群体的条件下进行。在一实施方式中，在使所述细胞群体与所述第一抑制剂和所述第二抑制剂接触之后，所述细胞与所述音猬因子(shh)信号传导激活剂的所述接触为至少24小时且至多36小时。在一实施方式中，所述细胞与所述音猬因子(shh)信号传导激活剂的所述接触为至多144小时。在一实施方式中，所述细胞与所述第三抑制剂的所述接触在能够产生分化的底板中脑祖细胞群体的条件下进行。在一实施方式中，在使所述细胞群体与所述音猬因子(shh)信号传导激活剂接触之后，所述细胞与所述第三抑制剂的所述接触为至少24小时，至多36小时。在一实施方式中，所述细胞与所述第三抑制剂的所述接触为至多192小时。在一实施方式中，在使所述细胞与所述第一抑制剂和所述第二抑制剂接触之后至少第11天，所述细胞群体分化成所述底板中脑祖细胞。在一实施方式中，所述第一抑制剂是sb431542。在一实施方式中，所述第二抑制剂是ldn-193189。在一实施方式中，所述第三抑制剂是chir99021。在一实施方式中，所述音猬因子(shh)信号传导激活剂选自音猬因子(shh)c25ii和purmorphamine。在一实施方式中，所述方法进一步提供成纤维细胞生长因子8(fgf8)，并在能够产生分化的底板中脑祖细胞群体的条件下使细胞群体与所述fgf8接触。在一实施方式中，在使所述细胞群体与所述第一抑制剂和所述第二抑制剂接触之后，所述细胞与所述fgf8的所述接触为至少24小时，至多36小时。在一实施方式中，所述细胞与所述fgf8的所述接触为至多144小时。在一实施方式中，所述底板中脑祖细胞群体包括大于40％的叉头框蛋白a2(foxa2)+细胞。在一实施方式中，所述底板中脑祖细胞群体包括大于40％的叉头框蛋白a2(foxa2)+lim同源盒转录因子1,α(lmx1a)+细胞。在一实施方式中，所述方法进一步包括步骤e)使所述底板中脑祖细胞群体与神经元成熟培养基接触，所述培养基包括n2培养基、脑源性神经营养因子(bdnf)、抗坏血酸(aa)、胶质细胞系源性神经营养因子、二丁酰camp(dbcamp)和β3型转化生长因子，用于使底板中脑祖细胞分化成底板中脑多巴胺(da)神经元。在一实施方式中，所述方法进一步包括步骤e)使所述底板中脑祖细胞群体与具有b27补充物的神经元成熟培养基接触，用于使底板中脑祖细胞分化成底板中脑多巴胺(da)神经元。在一实施方式中，使与具有b27补充物的神经基础(neurobasal)培养基接触的所述细胞与脑源性神经营养因子(bdnf)、抗坏血酸(aa)、胶质细胞系源性神经营养因子、二丁酰camp(dbcamp)和β3型转化生长因子接触，用于使底板中脑祖细胞分化成底板中脑多巴胺(da)神经元。在一实施方式中，所述底板中脑多巴胺(da)神经元为叉头框蛋白a2(foxa2)+lim同源盒转录因子1,α(lmx1a)+、核受体相关1蛋白(nurr1)+以及酪氨酸羟化酶(th)+。在一实施方式中，大于40％的所述底板中脑多巴胺(da)神经元为酪氨酸羟化酶(th)+。在一实施方式中，在使所述细胞群体与所述第一抑制剂和所述第二抑制剂接触之后至少第25天，分化出所述底板中脑多巴胺(da)神经元群体。在一实施方式中，所述底板中脑多巴胺(da)神经元对于鉴定一种分子的标记物是阳性的。在一实施方式中，所述标记物选自酪氨酸羟化酶(th)、叉头框蛋白a2(foxa2)、lim同源盒转录因子1、多巴胺、3,4-二羟基-苯乙酸(dopac)和高香草酸(hva),α，核受体nurr1(nr4a2)、神经元特异性iii类β-微管蛋白(tuj1)、ttf3、配对样同源域3(pitx3)、achaete-scute复合物(ascl)、早期b细胞因子1(ebf-1)、早期b细胞因子3(ebf-3)、转甲状腺素蛋白(ttr)、突触蛋白、多巴胺转运蛋白(dat)和g蛋白偶联的内向整流钾通道(kir3.2/girk2)。在一实施方式中，所述分子选自蛋白质和核酸。在一实施方式中，所述分子使用选自抗体、pcr引物、核酸序列的标记物和酶检测来鉴定。在一实施方式中，所述底板中脑多巴胺(da)神经元能够体内植入到具有帕金森氏病(pd)的患者中，用于提供多巴胺(da)神经元功能。在一实施方式中，所述方法进一步包括，提供对产生多巴胺的神经元有需求的患者，其中所述患者表现出至少一种神经系统症状，以及将底板中脑多巴胺(da)神经元移植到所述患者中用于提供多巴胺(da)神经元功能的步骤。在一实施方式中，所述神经系统症状选自震颤、运动徐缓(活动极为缓慢)、屈曲位、姿势不稳和僵直。在一实施方式中，所述患者表现出至少一种所述神经系统症状的减少。在一实施方式中，所述细胞选自啮齿类动物细胞、灵长类动物细胞和人细胞。在一实施方式中，所述人细胞是来自具有帕金森氏病(pd)神经系统症状的患者的细胞。

　　在一实施方式中，本发明提供一种用于治疗性处理的体内植入方法，其包括，a)提供：i)底板中脑多巴胺(da)神经元群体，其中大于40％的所述群体表达酪氨酸羟化酶(th)；和ii)受试者，其中所述受试者表现出至少一种神经系统症状；和b)在允许体内植入的条件下将所述底板中脑多巴胺(da)神经元移植到所述受试者中，用于提供多巴胺(da)神经元功能。在一实施方式中，所述神经系统症状选自震颤、运动徐缓(活动极为缓慢)、屈曲位、姿势不稳和僵直。在一实施方式中，所述受试者表现出至少一种所述神经系统症状的减少。在一实施方式中，所述底板中脑多巴胺(da)神经元群体源自根据本发明的方法处理的底板中脑祖细胞群体。在一实施方式中，所述底板中脑多巴胺(da)神经元群体源自根据进一步包括使底板中脑祖细胞群体与神经元成熟培养基接触的步骤的方法处理的底板中脑祖细胞群体，所述培养基包括n2培养基、脑源性神经营养因子(bdnf)、抗坏血酸(aa)、胶质细胞系源性神经营养因子、二丁酰camp和β3型转化生长因子，用于使底板中脑祖细胞分化成底板中脑多巴胺(da)神经元。在一实施方式中，所述底板中脑祖细胞群体源自根据本发明的方法处理的细胞群体。在一实施方式中，所述底板中脑祖细胞群体源自根据诱导细胞定向分化成底板中脑祖细胞群体的方法处理的细胞群体，所述方法包括：提供：i)细胞群体，其中所述细胞群体选自非胚胎干细胞、胚胎干细胞、诱导的非胚胎多能细胞和工程多能细胞；和ii)第一信号传导抑制剂、第二信号传导抑制剂、音猬因子(shh)信号传导激活剂和第三信号传导抑制剂，其中所述第一抑制剂能够降低转化生长因子β(tgfβ)/activin-nodal信号传导，所述第二抑制剂能够降低smad(smallmothersagainstdecapentaplegic)信号传导，并且所述第三抑制剂能够降低用于活化wingless(wnt)信号传导的糖原合成酶激酶3β(gsk3β)信号传导；b)使所述细胞群体与所述第一抑制剂和所述第二抑制剂接触，c)在使所述细胞群体与所述第一抑制剂和所述第二抑制剂接触之后，在使底板中脑祖细胞群体分化的条件下，进一步使所述细胞与所述音猬因子(shh)信号传导激活剂接触；和d)在使所述细胞群体与所述音猬因子(shh)信号传导激活剂接触之后，进一步使所述细胞与所述第三抑制剂接触，以使所述细胞群体分化成底板中脑祖细胞群体。在一实施方式中，所述底板中脑多巴胺(da)神经元群体源自选自动物、灵长类动物和人的细胞群体。在一实施方式中，所述人细胞是来自具有帕金森氏病(pd)症状的患者的细胞。

　　在一实施方式中，本发明提供一种组合物，其包括与ldn-193189和chir99021接触的细胞群体，其中大于40％的所述细胞群体对于叉头框蛋白a2(foxa2)是阳性的，并且其中所述细胞群体预先与ldn-193189、sb431542、音猬因子(shh)信号传导激活剂和chir99021接触，其中所述音猬因子(shh)信号传导激活剂选自音猬因子(shh)c25ii和purmorphamine。在一实施方式中，所述细胞群体对于叉头框蛋白a2(foxa2)是至少50％阳性的。在一实施方式中，所述细胞群体对于叉头框蛋白a2是至少60％阳性的。在一实施方式中，所述细胞群体对于叉头框蛋白a2是至少70％阳性的。在一实施方式中，所述细胞群体对于叉头框蛋白a2是至少80％阳性的。在一实施方式中，所述细胞群体对于叉头框蛋白a2是至少90％阳性的。在一实施方式中，所述细胞群体对于叉头框蛋白a2是至少95％至多100％阳性的。在一实施方式中，大于10％的所述细胞群体选自对于叉头框蛋白a2(foxa2)/lim同源盒转录因子1,α(lmx1a)是双阳性的，以及对于叉头框蛋白a2(foxa2)/orthodenticle同源盒2(otx2)是双阳性的。在一实施方式中，所述细胞群体是至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、至少95％至多100％阳性的。在一实施方式中，至少20％的所述细胞群体对于选自nurr1+、cd142、dcsm1、cd63和cd99的标记物是阳性的。在一些实施方式中，所述细胞群体是至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、至少95％至多100％阳性的。在一些实施方式中，所述细胞群体是至少50％、60％、70％、80％、90％、至少95％至多100％阳性的。在一实施方式中，所述细胞群体选自啮齿类动物细胞、灵长类动物细胞、人细胞和来自具有帕金森氏病(pd)神经系统症状的患者的人细胞。

　　在一实施方式中，本发明提供一种诱导细胞定向分化成底板中脑祖细胞群体的方法，其包括，a)提供：i)细胞群体，其中所述细胞群体选自非胚胎干细胞、胚胎干细胞、诱导的非胚胎多能细胞和工程多能细胞；和ii)第一信号传导抑制剂、第二信号传导抑制剂、音猬因子(shh)信号传导激活剂和第三信号传导抑制剂，其中所述第一抑制剂是sb431542，所述第二抑制剂是ldn-193189，所述音猬因子(shh)信号传导激活剂选自音猬因子(shh)c25ii和purmorphamine，并且所述第三抑制剂是chir99021；b)使所述细胞群体与所述第一抑制剂和所述第二抑制剂接触，其中与所述第一抑制剂和所述第二抑制剂的所述接触在能够产生分化的底板中脑祖细胞群体的条件下进行，使得与所述第一抑制剂和所述第二抑制剂的所述接触在将细胞体外铺布的48小时内发生，c)在使所述细胞群体与所述第一抑制剂和所述第二抑制剂接触之后，在使底板中脑祖细胞群体分化的条件下，进一步使所述细胞与所述音猬因子(shh)信号传导激活剂接触；和d)在使所述细胞群体与所述音猬因子(shh)信号传导激活剂接触之后，进一步使所述细胞与所述第三抑制剂接触，以使所述细胞群体分化成底板中脑祖细胞群体。在一实施方式中，所述细胞与所述音猬因子(shh)信号传导激活剂的接触在能够产生分化的底板中脑祖细胞群体的条件下进行，使得在使所述细胞群体与所述第一抑制剂和所述第二抑制剂接触之后，所述细胞与所述音猬因子(shh)信号传导激活剂的所述接触为至少24小时且至多36小时。在一实施方式中，所述细胞与所述第三抑制剂的接触在能够产生分化的底板中脑祖细胞群体的条件下进行，使得在使所述细胞群体与所述音猬因子(shh)信号传导激活剂接触之后，所述细胞与所述第三抑制剂的接触为至少24小时且至多36小时。在一实施方式中，底板中脑祖细胞群体包括大于40％的叉头框蛋白a2(foxa2)+lim同源盒转录因子1+,α(lmx1a)+细胞。在一实施方式中，该方法进一步包括步骤e)使所述底板中脑祖细胞群体与神经元成熟培养基接触，所述培养基包括n2培养基、脑源性神经营养因子(bdnf)、抗坏血酸(aa)、胶质细胞系源性神经营养因子、二丁酰camp和β3型转化生长因子，用于使底板中脑祖细胞分化成底板中脑多巴胺(da)神经元。在一实施方式中，所述底板中脑多巴胺(da)神经元对于选自叉头框蛋白a2(foxa2)/lim同源盒转录因子1α(lmx1a)/酪氨酸羟化酶(th)；叉头框蛋白a2/lim同源盒转录因子1α/酪氨酸羟化酶/cd142；叉头框蛋白a2/lim同源盒转录因子1α/酪氨酸羟化酶/核受体相关1蛋白(nurr1)；叉头框蛋白a2/lim同源盒转录因子1α/酪氨酸羟化酶/cd142/核受体相关1蛋白和酪氨酸羟化酶/α-突触核蛋白的标记物组是阳性的。在一实施方式中，所述方法进一步包括步骤f)将用于cd142表达的所述底板中脑多巴胺(da)神经元分选成对于cd142至少80％阳性的细胞群体。在一实施方式中，所述底板中脑多巴胺(da)神经元对于鉴定一种分子的标记物是阳性的，所述标记物选自：酪氨酸羟化酶(th)、叉头框蛋白a2(foxa2)、lim同源盒转录因子1、多巴胺、3,4-二羟基-苯乙酸(dopac)和高香草酸(hva),α,核受体nurr1(nr4a2)、神经元特异性iii类β-微管蛋白(tuj1)、ttf3、配对样同源域3(pitx3)、achaete-scute复合物(ascl)、早期b细胞因子1(ebf-1)、早期b细胞因子3(ebf-3)、转甲状腺素蛋白(ttr)、突触蛋白、多巴胺转运蛋白(dat)和g蛋白偶联的内向整流钾通道(kir3.2/girk2)、cd142、dcsm1、cd63和cd99。在一实施方式中，该方法进一步包括，提供对产生多巴胺的神经元有需求的患者，以及在e)之后的步骤，通过移植用于提供多巴胺(da)神经元功能的所述底板中脑多巴胺(da)神经元治疗所述患者。在一实施方式中，所述患者包括至少一种选自震颤、运动徐缓(活动极为缓慢)、屈曲位、姿势不稳和僵直的神经系统症状。在一实施方式中，观察到所述患者具有至少一种选自震颤、运动徐缓(活动极为缓慢)、屈曲位、姿势不稳和僵直的神经系统症状。在一实施方式中，所述患者表现出至少一种所述神经系统症状的减少。

　　在一实施方式中，本发明提供一种用于治疗性处理的体内植入方法，其包括，a)提供：i)底板中脑多巴胺(da)神经元群体，其中大于40％的所述群体表达酪氨酸羟化酶(th)；和ii)受试者，其中所述受试者表现出至少一种神经系统症状，其中所述神经系统症状选自震颤、运动徐缓(活动极为缓慢)、屈曲位、姿势不稳和僵直；和b)在允许体内植入的条件下将所述底板中脑多巴胺(da)神经元移植到所述受试者中，用于提供多巴胺(da)神经元功能。在一实施方式中，所述受试者表现出至少一种所述神经系统症状的减少。在一实施方式中，所述底板中脑多巴胺(da)神经元群体源自进一步包括以下步骤的细胞群体：将用于cd142表达的所述底板中脑多巴胺(da)神经元分选成对于cd142为至少80％阳性的细胞群体。在一实施方式中，所述底板中脑多巴胺(da)神经元群体源自在以下步骤之后的底板中脑祖细胞群体：将用于cd142表达的所述底板中脑多巴胺(da)神经元分选成对于cd142为至少80％阳性的细胞群体。在一实施方式中，所述底板中脑多巴胺(da)神经元群体源自选自动物、灵长类动物、人和具有帕金森氏病(pd)症状的患者的细胞群体。在一实施方式中，所述底板中脑多巴胺(da)神经元群体源自分离自动物、灵长类动物、人和具有帕金森氏病(pd)症状的患者的细胞群体。

　　定义

　　如本文所用，术语“疾病建模”是指使用实验有机体或体外细胞培养物来模拟由于疾病的原因在人体中观察到的特定病征或症状的过程。在一实施方式中，可以将源自具有导致神经系统疾病例如帕金森氏病(pd)的基因突变的动物模型的多能干细胞培养并分化成神经细胞，用于鉴定与pd有关的神经元的新的特征。在一实施方式中，可以将源自具有导致神经系统疾病例如帕金森氏病(pd)的基因突变的人的人多能干细胞培养并分化成携带有在人类观察到的类似缺陷的神经细胞。

　　如本文所用，术语“帕金森病(parkinsonism)”是指一组均与基底神经节(其是大脑中控制运动的部分)中多巴胺不足有关的疾病。症状包括震颤、运动徐缓(活动极为缓慢)、屈曲位、姿势不稳和僵直。帕金森病的诊断要求存在有这些症状中的至少两种，其中之一必须为震颤或运动徐缓。帕金森病最常见的形式是特发性或典型帕金森氏病(pd)，但是对显著少数的诊断来说，大约为总数的15％，可以存在有帕金森氏叠加综合症(parkinson'splussyndromes，pps)之一。这些综合症也称作非典型帕金森病，其包括皮质基底核退化症(corticobasaldegeneration)、路易体痴呆症(lewybodydementia)、多系统萎缩症(multiplesystematrophy)和进行性核上性麻痹。通常，帕金森氏病牵涉到主要在称作黑质(substantianigra)的大脑区域中在脑中的重要神经细胞的功能障碍和死亡。许多这些重要神经细胞产生多巴胺，当这些神经元相继死亡时，脑中由分化产生的多巴胺的量下降，使人不能正常控制运动。肠也具有在帕金森氏病患者中退化的多巴胺细胞，这可以是作为疾病一部分的胃肠道症状中的重要致病因素。个体经历的症状群因人而异。帕金森氏病的主要运动病征包括以下：手、臂、腿、下颌和面部的震颤、运动徐缓或运动缓慢、肢体和躯干的僵直或僵硬以及姿势不稳或者平衡和协调受损。

　　如本文所用，术语“受试者”是指要成为特定治疗包括任何类型对照的受者的哺乳动物(人和动物(即非人的动物))。通常，术语“受试者”和“患者”在本文中指代人受试者时可互换使用。

　　如本文所用，术语“非人动物”是指所有非人的动物，其包括，但不限于，脊椎动物，例如啮齿类动物、非人灵长类动物、绵羊、牛、反刍动物、兔类动物、猪、山羊、马、犬、猫、鸟类等。

　　如本文所用，术语“多巴胺”是指由传递信息至含有控制运动和协调的神经元的大脑部分的多巴胺神经元所制造的化合物。

　　如本文所用，术语“lsb”是指两种化合物ldn-193189和sb431542的组合，其能够降低或阻断由细胞中转化生长因子β(tgfβ)/activin-nodal信号传导和smad(smallmothersagainstdecapentaplegic)信号传导组成的信号传导。

　　如本文所用，术语“sb431542”是指能够降低或阻断转化生长因子β(tgfβ)/activin-nodal信号传导的分子，其编号为cas301836-41-9，分子式为c22h18n4o3，名称为4-[4-(1,3-苯并二氧戊环-5-基)-5-(2-吡啶基)-1h-咪唑-2-基]-苯酰胺，例如，参见以下结构式：

　　在一示例中，sb431542是stemoleculetm

　　sb431542,stemgent,inc.cambridge,massachusetts,unitedstates。

　　如本文所用，术语“ldn-193189”是指小分子dm-3189，其iupac名称为4-(6-(4-(哌嗪-1-基)苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)喹啉，化学式为c25h22n6。ldn-193189能够作为smad信号传导抑制剂发挥功能。ldn-193189还是高度有效的alk2、alk3和alk6、蛋白质酪氨酸激酶(ptk)的小分子抑制剂，抑制i型tgfβ受体的alk1和alk3家族成员的信号传导，导致多种生物信号传递的抑制，其包括骨形态发生蛋白(bmp)bmp2、bmp4、bmp6、bmp7和活化素细胞因子信号以及随后smad1、smad5和smad8的smad磷酸化(yu等人.(2008)natmed14:1363-1369；cuny等人.(2008)bioorg.med.chem.lett.18:4388-4392，在此将其并入作为参考)。在一示例性实施方式中，ldn-193189是stemoleculetmldn-193189,stemgent,inc.cambridge,massachusetts,unitedstates。

　　如本文所用，术语“糖原合成酶激酶3β抑制剂”或“gsk3β抑制剂”是指抑制糖原合成酶激酶3β酶的化合物，例如，参见doble等人,jcellsci.2003；116:1175-1186，在此将其并入作为参考。出于本发明的目的，gsk3β抑制剂能够激活wnt信号传导通路，参见，例如，cadigan等人,jcellsci.2006；119:395-402；kikuchi等人,cellsignaling.2007；19:659-671，在此将其并入作为参考。

　　如本文所用，术语“chir99021”或“chir”或“氨基嘧啶”或“3-[3-(2-羧乙基)-4-甲基吡咯-2-亚甲基]-2-二氢吲哚酮”是指iupac名称6-(2-(4-(2,4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1h-咪唑-2-基)嘧啶-2-基氨基)乙基氨基)烟腈。chir99021是激活wnt信号传导通路的糖原合成酶激酶3β(gsk3β)的小分子化学抑制剂的一个例子，其为高度选择性的，针对一组相关和不相关的激酶表现出近千倍的选择性，针对人gsk3β的ic50＝6.7nm，针对啮齿动物同源物的ic50值为纳摩尔级。

　　在一示例性实施方式中，chir99021是stemoleculetmchir99021,stemgent,inc.cambridge,massachusetts,unitedstates。

　　如本文所用，术语“purmorphamine”是指一种嘌呤衍生物，例如cas编号：483367-10-8，例如以下结构的一个例子，其激活hedgehog通路，包括通过靶向smoothened。

　　在一示例性实施方式中，purmorphamine是stemoleculetmpurmorphamine,stemgent,inc.cambridge,massachusetts,unitedstates。

　　如本文所用，术语“信号传导”在关联“信号转导蛋白”时是指被与膜受体蛋白结合的配体或一些其他刺激因子激活或者受到另外的影响的蛋白。信号转导蛋白的例子包括smad、wnt复合蛋白，在另一实施方式中wnt复合蛋白包括β-连环蛋白，音猬因子(shh)、notch、转化生长因子β(tgfβ)、activin、nodal、糖原合成酶激酶3β(gsk3β)蛋白和类似物。对于许多细胞表面受体或内部受体蛋白，配体-受体相互作用不与细胞响应直接关联。在产生最终的配体对细胞行为的生理作用之前，配体激活的受体必须首先与细胞内部的其他蛋白相互作用。常常地，若干相互作用的细胞蛋白链的行为在受体激活或抑制之后发生变化。受体激活引起的整套细胞变化被称作信号转导机制或信号传导通路。

　　如本文所用，术语“lsb/s/f8/chir”或“lsb/shh/fgf8/chir”是指除本发明的s(音猬因子激活剂)、f8(fgf8)和chir之外，还使细胞与ldn-193189和sb431542(即lsb)接触。相反地，术语“lsb/s/f8”或“shh/fgf8”或“shh/fgf”是指除s(音猬因子激活剂)、f8(fgf8)之外，还使细胞与ldn-193189和sb431542(即lsb)接触，但没有之前所公开方法中的chir。在类似的缩写中，“ldn/sb”是指使细胞与ldn，ldn-193189和sb，sb431542接触。

　　如本文所用，术语“抑制”或“阻断”是指，当用化合物(即抑制剂)进行处理时，细胞的特定信号传导通路的活性水平与未经该化合物处理或者用对照处理的细胞的所述信号传导通路的活性相比而言降低。

　　如本文所用，术语“激活”是指，当用化合物(即激活剂)进行处理时，细胞的特定信号传导通路的活性水平与未经该化合物处理或者用对照处理的细胞的所述信号传导通路的活性相比而言增加。如果这样的抑制或激活导致干细胞的定向分化，特定信号传导通路的任何水平的抑制或激活均视作是本发明的实施方式。

　　如本文所用，术语“smamothersagainstdecapentaplegic”或“smallmothersagainstdecapentaplegic”或“smad”是指信号传导分子。

　　如本文所用，术语“wnt”或“wingless”在关联配体时是指一组能够与wnt受体例如frizzled和lrpderailed/ryk受体家族中的受体相互作用的分泌蛋白(即人中的int1(integration1))。

　　如本文所用，术语“wnt”或“wingless”在关联信号传导通路时是指由wnt家族配体和wnt家族受体例如frizzled和lrpderailed/ryk受体组成的信号传导通路，其由β-连环蛋白介导或不由其介导。出于本文所述的目的，优选的wnt信号传导通路包括β-连环蛋白介导，即wnt/β-连环蛋白。

　　如本文所用，“典型通路”或“经典激活”在关联wnt时是指多种wnt下游信号通路中的一种，例如，在典型通路中，与其受体结合的wnt配体的主要作用是通过对β-连环蛋白降解复合物的抑制对细胞质β-连环蛋白进行稳定化。其他wnt通路是非典型的。

　　作为一个例子，小分子chir影响典型的wnt信号传导下游通路。

　　如本文所用，术语“音猬因子(shh或shh)”是指哺乳动物信号传导通路家族中至少三种蛋白中的一种蛋白，其一称作刺猬因子(hedgehog)，另一个是沙漠刺猬因子(deserthedgehog，dhh)，而第三种是印度刺猬因子(indianhedgehog，ihh)。shh通过与跨膜分子patched(ptc)和smoothened(smo)相互作用而与至少两种跨膜蛋白相互作用。shh通常与pct结合，其然后使得smo作为信号转导物被激活。在不存在shh的情况下，ptc通常抑制smo，这进而又激活转录阻遏物，使得某些基因的转录不会发生。当存在shh并且与ptc结合时，ptc不会干扰smo发挥作用。smo不受抑制时，某些蛋白能够进入细胞核，并起到转录因子的作用，使得某些基因得以激活(参见，gilbert,2000developmentalbiology(sunderland,massachusetts:sinauerassociates,inc.,publishers))。

　　如本文所用，术语“激活剂”或“激活”是指用于激活导致本发明的细胞定向分化的分子的小分子、肽、蛋白质和化合物。示例性的激活剂包括但不限于：chir、音猬因子(shh)c25ii、小分子smoothened激动剂purmorphamine、成纤维细胞生长因子(fgf)等。

　　如本文所用，术语“音猬因子(shh)信号传导激活剂”是指任何激活shh信号传导通路的分子或化合物，其包括与pct或smoothened激动剂等结合的分子或化合物。这些化合物的例子为蛋白质音猬因子(shh)c25ii和小分子smoothened激动剂purmorphamine。

　　如本文所用，术语“音猬因子(shh)c25ii”是指全长鼠科音猬因子蛋白的能够与shh受体结合用于激活shh的重组n-端片段，一个例子为r和d系统目录编号：464-sh-025/cf。

　　如本文所用，术语“信号”是指控制细胞结构和功能变化的内部和外部因素。它们在性质上是化学的或物理的。

　　如本文所用，术语“配体”是指与受体(r)结合的分子和蛋白质，其例子包括但不限于转化生长因子-β、活化素、结节蛋白、骨形态发生蛋白(bmp)等。

　　如本文所用，术语“抑制剂”或“信号传导抑制剂”在关联于抑制信号传导分子或信号传导分子的通路时，例如smad信号传导抑制剂、糖原合成酶激酶3β(gsk3β)抑制剂，是指干扰(即，降低或抑制或消除或阻断)分子或通路的信号传导功能的化合物或分子(例如，小分子、肽、肽模拟物(peptidomimetic)、天然化合物、蛋白质、sirna、反义核酸、适体或抗体)。换言之，抑制剂是任何改变指定蛋白质(信号传导分子，任何与指定信号传导分子有关的分子，指定缔合分子，例如糖原合成激酶3β(gsk3β))(例如，包括但不限于，本文所述的信号传导分子)任意活性的化合物或分子，例如，经由直接接触smad信号传导、接触smadmrna、导致smad构象变化、降低smad蛋白水平或者干扰smad与信号传导配对物(例如，包括本文所述者)的相互作用以及影响smad目标基因(例如，本文所述者)的表达。抑制剂还包括通过拦截上游信号传导分子而间接调节smad生物活性的分子。因此，在一实施方式中，本发明的抑制剂诱导(改变)或变更从缺省(default)到非缺省的细胞类型的分化，例如，本发明的一个包括ldn/sb、chir和shh激活剂(其可以抑制糖原合成酶激酶3β)的方法使祖细胞分化成非缺省的神经祖细胞。在优选的实施方式中，本发明的抑制剂“变更”或“降低”或“阻断”缺省信号传导，以便引导细胞向非缺省细胞类型分化，例如本文所述用于分化本发明的底板中脑祖细胞和中脑结局foxa2/lmx1a+多巴胺(da)神经元。因此，本发明的抑制剂是以有助于起始细胞群体(第0天)分化成底板中脑祖细胞的方式改变信号分子活性的天然化合物或小分子。当祖细胞与抑制剂接触时，这些小分子可以有助于进一步分化成本发明的中脑结局foxa2/lmx1a+多巴胺(da)神经元。除了与指定信号传导分子上游的分子结合并对其产生影响，其进而导致指定分子的抑制所诱导的抑制以外，抑制剂还就竞争抑制(以排斥或降低与另一已知结合化合物的结合的方式与活性位点结合)和变构抑制(以干扰化合物与蛋白质活性位点的结合的方式改变蛋白质构象，以此方式与蛋白质结合)方面加以描述。在一些情形中，抑制剂称作“直接抑制剂”，这是指通过与信号传导目标实际接触来抑制信号传导目标或信号传导目标通路；例如，γ分泌酶的直接抑制剂是与γ分泌酶蛋白结合的dapt分子。

　　如本文所用，术语“衍生物”是指具有类似核心结构的化合物。

　　如本文所用，术语“底板中脑祖细胞”在关联位于中脑中的体内细胞(包括在中脑神经元的胚胎发育期间)时，是指可以分化成产生多巴胺的细胞的细胞。在一些实施方式中，“底板中脑祖细胞”是指用于在体外人工产生培养细胞的培养中的细胞，所培养的细胞在与体内细胞表达的标记物比较时表达重叠或相同的标记物集合，即，底板标记物foxa2和顶板标记物lmx1a、otx2、ngn2和ddc共表达，例如，本文所述的定向分化起始之后大约第11天在本发明的培养细胞中。优选地，底板中脑祖细胞是“foxa2+lmx1a+”或“foxa2/lmx1a+”。在一些实施方式中，分化的祖细胞群体中数目低的细胞为foxa2/lmx1a/th+。

　　如本文所用，术语“源自底板的da神经元”或“真正的中脑da神经元”或“中脑结局foxa2+lmx1a+多巴胺(da)神经元”或“底板中脑多巴胺(da)神经元”或“可植入的中脑da神经元”或“mda神经元”或“foxa2+lmx1a+th+”或“foxa2/lmx1a/th”或“foxa2+lmx1a+nurr1+th+”或“foxa2/lmx1a/nurr1/th”是指通过本文所述的方法得到的可植入的中脑da神经元群体，典型地是在定向分化起始之后大约或到第25天。在优选的实施方式中，“真正的中脑da神经元”是foxa2+/lmx1a+/nurr1+/th+。这些神经元在小鼠和灵长类动物中的移植实验之后标记为“可植入”，显示出这些神经元逆转帕金森样神经系统病况的能力，来自神经过度增长和畸胎瘤形成的干扰更少。本发明的中脑结局foxa2/lmx1a+多巴胺(da)神经元在保持植入能力的同时在体外保持数月。

　　如本文所用，用于获得底板中脑祖细胞和中脑结局foxa2/lmx1a+多巴胺(da)神经元的细胞获自许多种来源，其包括胚胎和非胚胎来源，例如hesc和非胚胎hipsc、成体干细胞、疾病干细胞(即分离自帕金森氏病患者的分离的多能细胞和工程来源干细胞)、癌症干细胞、人或哺乳动物多能细胞等。

　　如本文所用，术语“干细胞”是指具有在培养物中无限期分裂并产生特化细胞的能力的细胞。干细胞可以获自动物和患者，包括人；例如，人干细胞是指人的干细胞。干细胞可以获自许多种来源，其包括胚胎和非胚胎，例如，脐带细胞，来自儿童的细胞和来自成人的细胞。出于本发明的目的，成人干细胞通常是指并非最初获自胎儿的细胞，换言之，来自婴儿的细胞、脱落的脐带、脱落的胎盘细胞、来自儿童的细胞、来自成人的细胞等。

　　如本文所用，术语“脐带血干细胞”是指自出生时的脐带收集的干细胞，其具有至少产生身体中(造血的)全部血细胞的能力。

　　如本文所用，术语“体(成人)干细胞”是指在许多器官和分化组织中发现的相对罕见的未分化细胞，其自我更新(在实验室中)和分化的能力有限。这些细胞在其分化能力方面不同，但其通常限于来源器官的细胞类型。

　　如本文所用，术语“体细胞”是指身体中除了配子(卵子或精子)以外的任何细胞；有时称作“成人”细胞。

　　如本文所用，术语“神经谱系细胞”是指在发育过程中或者在成人中有助于神经系统(中枢和外周)或神经嵴细胞命运(fate)的细胞。神经系统包括脑、脊髓和外周神经系统。神经嵴细胞命运包括颅、躯干、迷走神经、骶骨和心脏，产生中外胚层、头软骨、颅骨、胸腺、牙齿、黑色素细胞、虹膜色素细胞、脑神经节、背根神经节、交感/副交感神经节、内分泌细胞、肠道神经系统和心脏的部分。

　　如本文所用，术语“成人干细胞”是指成体干细胞，例如，“造血干细胞”是指婴儿、儿童和成人中的干细胞，其产生所有红血球和白血球和血小板。

　　如本文所用，术语“胚胎干细胞”是指原始的(未分化)细胞，其源自若干种来源之一，包括但不限于胚胎植入前阶段的胚胎、人工产生即通过体外授精产生的胚胎等，其能够在不分化的情况下在培养物中分裂很长时间，已知具有发育成三个原胚层——外胚层、中胚层和内胚层的细胞和或组织的能力。

　　如本文所用，术语“内胚层”是指源自囊胚内细胞团的细胞层；其具有形成肺、其他呼吸结构和消化器官的能力，或者通常“在体内”形成“肠”，在体外形成许多种细胞类型。

　　如本文所用，术语“胚胎干细胞系”是指已经在使得在不分化的情况下增殖的体外条件下培养至多数天、数月至数年的胚胎干细胞群体，例如，人wa-09细胞系中的细胞。

　　如本文所用，术语“人胚胎干细胞”或“hesc”是指源自早期人胚胎的直至且包括胚囊阶段的多能干细胞类型，且能够在不分化的情况下在培养物中分裂很长时间，已知发育成具有三个原胚层——外胚层、中胚层和内胚层的细胞和组织。

　　如本文所用，术语“诱导的多能干细胞”或“ipsc”是指与胚胎干细胞类似的多能干细胞类型，借此对成体(成人)细胞进行重编，以通过强制表达对于保持胚胎干细胞(esc)的“干性(stemness)”来说重要的因子来进入类似胚胎干细胞的状态。小鼠ipsc在2006年报道(takahashi和yamanaka)，人ipsc在2007年末报道(takahashi等人，以及yu等人)。小鼠ipsc证明了多能干细胞的重要特征，包括表达干细胞标记物、形成含有来自所有三个胚层的细胞的肿瘤以及在发育极早期注入小鼠胚胎中时能够促成许多不同组织的能力。人ipsc也表达干细胞标记物，并且能够产生所有三个胚层特征性的细胞。与胚胎干细胞不同，ipsc通过将某些胚胎基因(例如，oct4、sox2和klf4转基因)(参见，例如，takahashi和yamanaka,cell126,663-676(2006)，在此将其引入作为参考)引入到成体细胞中而人工形成，例如来自诱导的细胞c14、c72等的细胞系。ipsc的另一例子是成人皮肤细胞或成纤维细胞，其使用克隆到质粒中的基因(oct4、sox2、nanog、lin28和klf4)转化，参见，例如，yu等人,sciencedoi:10.1126/science.1172482，在此将其并入作为参考。

　　如本文所用，术语“全能的”是指能够形成所有的身体细胞类型以及所有的形成胚胎外组织例如胎盘的细胞类型的能力。

　　如本文所用，术语“多能力的”(multipotent)是指能够发育成一种以上身体细胞类型的能力。

　　如本文所用，术语“多能的”(pluripotent)是指细胞具有形成至少两种但常常为许多种不同身体细胞类型的能力。多能细胞在注入到免疫抑制的小鼠中之后常常形成畸胎瘤。

　　如本文所用，术语“多能干细胞”是指该细胞取决于环境因素，即形态发生素、生长因子、信号传导分子激活剂或抑制剂等发育成至少两种不同细胞类型的能力。在一些实施方式中，多能干细胞是指细胞发育成有机体的三个发育胚层包括内胚层、中胚层和外胚层中的任意一种的能力。

　　如本文所用，术语“特化细胞”是指在多细胞有机体中发挥特定功能的细胞类型。例如，特化细胞的集合，例如神经元，一起工作形成系统，例如神经系统。

　　如本文所用，术语“神经外胚层”是指在发育早期或者在多能干细胞分化期间发现的细胞或细胞命运，其可以形成神经谱系细胞。

　　如本文所用，术语“细胞增殖的标记物”是指与快速循环细胞有关的分子的表达，其通常在成熟的慢循环或不循环细胞中是不存在的，即，旺盛分裂vs循环时间延长的细胞或不循环的细胞。这类标记物的例子包括细胞增殖的ki67标记物(gerdes等人,intjcancer31:13-20(1983)，并入本文以作参考)和有丝分裂g2/m-期的含磷-组蛋白h3标记物(hendzel等人,chromosoma106:348-360(1997)，并入本文以作参考)。

　　如本文所用，术语“增殖”是指细胞数目的增加。

　　如本文所用，术语“分化”是指其中未特化的胚胎细胞获得特化细胞例如特定类型的神经元、脑细胞、心脏、肝或肌肉细胞的特征的过程。分化由细胞基因与细胞外的物理和化学条件之间的相互作用控制，通常通过涉及嵌在细胞表面中的蛋白质的信号传导通路而控制。

　　如本文所用，术语“分化”就分化细胞系统中的细胞而言使用时，是指细胞从一种细胞类型(例如，多潜能、全能或多能可分化细胞)分化成另一细胞类型例如目标分化的细胞的过程。

　　如本文所用，术语“细胞分化”是指较少特化的细胞(即干细胞)发育或成熟为具有更为明确的形式和功能的路径(例如，ipsc发展成神经嵴祖先，至神经元谱系细胞，至底板中脑祖细胞，至本发明的中脑结局foxa2/lmx1a+多巴胺(da)神经元)。

　　如本文所用，术语“未分化的”是指细胞尚未发育成特化细胞类型的细胞。

　　如本文所用，术语“缺省”(default)或“被动”(passive)在关联细胞分化路径时是指如下路径：其中较少特化的细胞在不用某些化合物处理即在不与至少一种形态发生素接触的正常细胞培养条件下，在培养中成为某个分化的细胞类型。换言之，当细胞不与能够改变分化细胞类型的分子(即形态发生素)接触时，例如，培养物用单独的lsb处理，但不用shh激活剂或wnt激活剂处理以产生本发明的叉头框蛋白a2(foxa2)+细胞，此时产生缺省细胞，取代带之的是导致标记物hes5、pax6、lhx2和emx2的表达。相反，“非缺省”在关联细胞时是指导致与缺省细胞不同的细胞类型的分化细胞类型，即，非缺省细胞是由非缺省条件产生的分化细胞类型，例如本发明的细胞，包括本发明的叉头框蛋白a2(foxa2)+神经元细胞、底板中脑祖细胞和中脑结局foxa2/lmx1a+多巴胺(da)神经元等。缺省细胞还可以是在没有随后的形态发生化合物的情况下使细胞已与形态发生素接触以形成非缺省细胞之后的缺省细胞，例如，随后成为缺省细胞的非缺省底板中脑祖细胞因为缺乏与形态发生素例如chir接触而不是中脑结局foxa2/lmx1a+多巴胺(da)神经元。

　　如本文所用，术语“形态发生素”是指影响细胞的分化，即至少部分地决定细胞命运的化合物。形态发生素还可以影响细胞分化成为非缺省细胞的类型。

　　如本文所用，术语“定向分化”是指对干细胞培养条件的操纵，以诱导分化成为特定(例如，所需的)细胞类型，例如本发明的底板中脑祖细胞和中脑结局foxa2/lmx1a+多巴胺(da)神经元。在一实施方式中，术语“定向分化”在关联细胞时是指使用小分子、生长因子蛋白质和其他生长条件来促进细胞从多能状态转变为更加成熟或特化的细胞结局(例如，中枢神经系统细胞、神经细胞、底板中脑祖细胞和本发明的中脑结局foxa2/lmx1a+多巴胺(da)神经元等)。在一优选的实施方式中，定向分化的开始是在第0天使细胞与ldn/sb接触。经历本文所述定向分化的细胞导致形成本发明的底板中脑祖细胞和中脑结局foxa2/lmx1a+(da)神经元的非缺省细胞类型。

　　如本文所用，术语“诱导分化”在关联细胞时是指将缺省细胞类型(基因型和/或表型)改变成非缺省细胞类型(基因型和/或表型)。因此，“诱导干细胞分化”是指诱导细胞分裂成具有与干细胞不同的特性的子代细胞，例如基因型(即，基因表达变化，如通过基因分析例如微阵列所确定)和/或表型(即，蛋白表达变化，例如叉头框蛋白a2(foxa2)或一组蛋白，例如叉头框蛋白a2(foxa2)和lim同源盒转录因子1,α(lmxia)阳性(+)而对于pax6阴性(-))。

　　如本文所用，术语“命运”在关联细胞例如“细胞命运确定”时，通常是指具有遗传确定谱系的细胞，其子代细胞能够取决于体内或体外的培养环境而成为许多种细胞类型或少数特定的细胞类型。换言之，细胞预定的命运通过其环境来确定，以预定为特定的分化路径，使得细胞成为一种细胞类型而不是其他细胞类型，例如，干细胞的子代细胞的“神经命运”是成为神经细胞，而不是肌肉细胞或皮肤细胞。

　　如本文所用，术语“神经突突起生长”(neuriteoutgrowth)或“神经突起生长”是指细胞质自细胞延伸、膜封闭的突出的观察结果。

　　相反地，“神经过度生长”是指不需要的、不受约束的神经生长，即，不受控制的神经元生长，植入位置处移植细胞不受控制的生长。如本文所用，术语“畸胎瘤”是指来自从移植的细胞生长的任意组织类型的非癌肿瘤。

　　如本文所用，术语“畸胎瘤形成”是指许多种组织类型由于移植细胞的生长而不需要地生长为非癌肿瘤。

　　如本文所用，术语“多巴胺神经元”或“多巴胺能神经元”通常是指能够表达多巴胺的细胞。“中脑多巴胺神经元”或“mda”是指前脑结构中的推定多巴胺表达细胞和前脑结构中的多巴胺表达细胞。

　　如本文所用，术语“神经干细胞”是指在成人神经组织中发现的干细胞，其可以产生神经元和神经胶质(支持)细胞。神经胶质细胞的例子包括星形胶质细胞和少突胶质细胞。

　　如本文所用，术语“底板”或“fp”或“fp”是指神经管在体内沿着整个腹中线延伸的区域，也描述为神经管的不成对腹纵向区，或者称作神经管信号传导中心。换言之，神经管分为不同的区域，其中与中线最接近的腹细胞构成底板。作为进一步鉴定细胞的例子，鸡中脑fp可以基于基因表达、诱导模式和功能划分为中间(mfp)和侧面(lfp)区域。底板细胞在体内在发育胚胎的若干区域中发现，例如，中脑中、后脑中等的底板细胞。在体内，中脑区中的底板细胞预期产生与分化自其他区域中的底板细胞的细胞不同的细胞。中脑区中一个主要的底板标记物为foxa2。

　　如本文所用，术语“顶板”是指与中线最接近的背细胞。一种顶板标记物为lmx1a。在胚胎发育期间，底板和顶板细胞位于cns的不同位置处(腹部vs背部)，其诱导具有完全相反的模式需求。

　　如本文所用，术语“中脑”是指发育中的脊椎动物脑在前脑(前部)和后脑(后部)之间的区域。中脑区域产生许多脑区域，包括但不限于网状结构，其为被盖的一部分，是脑干的影响运动功能的区域，cmscerebri，其由连接大脑半球与小脑的神经纤维组成，以及称作黑质的大的有色核。发育的中脑的独特特征是底板标记物foxa2和顶板标记物lmx1a的共表达。

　　如本文所用，术语“神经元”是指神经细胞，其是神经系统主要的功能单元。神经元由细胞体及其突起轴突以及一个或多个树突组成。神经元通过在突触处释放神经递质向其他神经元或细胞传递信息。

　　如本文所用，术语“细胞培养”是指人工培养基中的体外细胞生长，用于研究或医学治疗。

　　如本文所用，术语“培养基”是指在培养器皿例如陪替氏平皿、多孔板等中覆盖细胞的液体，其含有营养物，以滋养和支持细胞。培养物也可以包括加入的生长因子，以诱导细胞中所需的变化。

　　如本文所用，术语“神经元成熟培养基”或“bagct”培养基是指包括n2培养基的培养基，其进一步包括脑源性神经营养因子(bdnf)、抗坏血酸(aa)、胶质细胞系源性神经营养因子、二丁酰camp和β3型转化生长因子，用于分化中脑结局foxa2/lmx1a+多巴胺(da)神经元。

　　如本文所用，术语“饲养层”是指共培养中使用的维持多能干细胞的细胞。对于人胚胎干细胞培养，典型的饲养层包括小鼠胚胎成纤维细胞(mef)或人胚胎成纤维细胞，其已经过处理，以防止它们在培养中分裂。

　　如本文所用，术语“传代”在关联细胞培养时是指如下过程：其中在一轮细胞生长和增殖之后将细胞分离，洗涤，并接种到新的培养器皿中。培养的细胞系经过的传代数是其年龄和预期稳定性的指征。

　　如本文所用，术语“表达”在涉及基因或蛋白质时是指产生mrna或蛋白质，其可以使用检测例如微阵列检测、抗体染色检测等观察。

　　如本文所用，术语“配对盒基因6”或“pax6”是指非缺省神经祖细胞的标记物。

　　如本文所用，术语“tuj1”或“神经元特异性iii类β-微管蛋白”在关联本发明的细胞分化时是指早期神经人细胞分化的标记物，例如神经祖细胞，其发现表达于pns和cns的神经元中。

　　如本文所用，术语“同型二聚体”在关联smad分子时是指至少两个例如通过二硫键连接在一起的smad分子。

　　如本文所用，术语使细胞与本发明的化合物“接触”是指将化合物置于将使其接触细胞的位置，以便产生(获得)“接触”的细胞。接触可以使用任何适当的方法进行。例如，在一实施方式中，接触是通过将化合物加入至细胞试管中。接触也可以通过将化合物加入到细胞培养物中实现。

　　如本文所用，术语“贴壁细胞”是指在体外生长的细胞，其中细胞附着于培养器皿的底部或侧边，贴壁细胞可以经由细胞外基质分子等与器皿接触，并需要使用酶将该细胞与培养皿/容器分离，即胰蛋白酶、分散酶等。“贴壁细胞”与悬浮培养中的细胞相反，悬浮培养中的细胞不附着，并且不需要使用酶将细胞从培养器皿中移除。

　　如本文所用，术语“标记物”或“细胞标记物”是指鉴定特定细胞或细胞类型的基因或蛋白质。细胞标记物可以不限于一种标记物，标记物可以指标记物“图谱”，使得指定的一组标记物可以从其他细胞或细胞类型中鉴定出细胞或细胞类型。例如，本发明的中脑结局foxa2/lmx1a+多巴胺(da)神经元表达一种或多种标记物，其将底板中脑祖细胞区分于前体较少分化的细胞，即，叉头框蛋白a2(foxa2)阳性和lim同源盒转录因子1,α(lmx1a)阳性vs.hes5+和pax6+细胞，例如，如图1e和1f中的示例性基因表达图谱所示。

　　如本文所用，术语“阳性”在涉及细胞时(包括“阳性细胞”)是指表达标记物的细胞，例如，当使用抗体染色(检测)系统时，对于该标记物“染色”的抗体，或者以在对照或比较细胞之上的可检测的定量和/或定性的量，通过报道分子即连接在双链核酸序列上的荧光分子而测量的与标记物核酸序列杂交的核酸序列。例如，对于标记物例如叉头框蛋白a2(foxa2)等阳性的细胞是指，当在测定例如分别在基因阵列或抗体测定中检测时表达foxa2mrna和/或蛋白质的细胞。这样的阳性细胞可以称作foxa2+。当细胞对于一种以上的标记物为阳性时，例如，当使用foxa2/lmx1a+表示法时，细胞或细胞群体的大多数对于foxa2和lmx1a二者是阳性的。

　　如本文所用，术语“阴性”在涉及细胞或细胞群体时(包括“阴性细胞”)是指细胞或细胞群体不存在可检测的标记物信号或者对照群体水平的信号。例如，在与叉头框蛋白a2(foxa2)抗体检测法或包括foxa2mrna检测的基因阵列等接触以后未被染色的细胞是foxa2-的，或者对于foxa2为阴性。

　　如本文所用，术语“报道子基因”或“报道子构建体”是指包括编码以下蛋白的核酸的基因构建体：该蛋白易于检出或易于检测，如着色蛋白、荧光蛋白例如gfp，或酶，如β-半乳糖苷酶(lacz基因)。

　　如本文所用，术语“gfp”是指在细胞中表达时能够产生荧光蛋白的任何绿色荧光蛋白dna序列，其通常用作目标基因表达的指示标记物。gfp的例子包括分离自腔肠动物例如太平洋水母aequoriavictoria的gfp序列及其合成序列衍生物，例如“egfp”。

　　术语“样品”以其最宽泛的意义使用。在一种意义上，其可以指细胞或组织。在另一意义上，其是要包括获自任何来源的标本或培养物，包括流体、固体和组织。环境样品包括环境材料，例如表面物质、土壤、水和工业样品。这些例子不应理解成限制适用于本发明的样品类型。

　　如本文所用，术语“提纯的”、“提纯”、“纯化”“分离的”、“使分离”、“分离”以及语法上的等同物是指样品中至少一种污染物的量减少。例如，将所需的细胞类型提纯至少10％，优选至少30％，更优选至少50％，再更优选至少75％，最优选至少90％，对应于不需要的细胞类型的量的降低，例如，本发明的定向分化导致所需的本发明的分化底板中脑祖细胞或中脑结局foxa2/lmx1a+多巴胺(da)神经元的纯度增加。换言之，“纯化”及其等同物是指机械地例如通过流式细胞仪细胞分选或通过定向分化从样品中除去某些细胞(例如，不需要的细胞)。例如，对于本发明的叉头框蛋白a2(foxa2)+lim同源盒转录因子1,α(lmx1a)+祖细胞的提纯群体的分化，通过流式细胞仪将混合的细胞群体分选成双阳性叉头框蛋白a2(foxa2)+lim同源盒转录因子1,α(lmx1a)+细胞，从而通过除去污染的pax6神经元细胞对祖细胞进行提纯；通过使用特定的细胞培养方法，包括本发明的组合物和方法，中脑结局foxa2/lmx1a+多巴胺(da)神经元也从非多巴胺(da)(缺省细胞)中提纯或“选择”。非中脑结局foxa2/lmx1a+多巴胺(da)神经元细胞的除去或选择导致样品中所需中脑结局foxa2/lmx1a+多巴胺(da)神经元的百分含量增加。因此，细胞类型的提纯导致“富集”，即，样品中所需细胞即中脑结局foxa2/lmx1a+多巴胺(da)神经元的量增加。

　　如本文所用，术语“天然出现的”在应用于物体(例如细胞、组织等)和/或化合物(例如蛋白质、氨基酸序列、核酸序列、密码子等)时，是指物品和/或化合物是自然界发现的。例如，天然出现的细胞是指细胞存在于有机体中，其可以从天然来源分离出，例如胚胎细胞，其中细胞没有在实验室中人为有意修饰。

　　如本文所用，术语“体外”是指人工环境，以及人工环境内发生的过程或反应。体外环境的例子有，但不限于，试管和细胞培养物。

　　如本文所用，术语“体内”是指天然环境(例如，动物或细胞)，以及天然环境内发生的过程或反应，例如胚胎发育、细胞分化、形成神经管等。

　　术语“源自”或“建立自”或“分化自”在关联本文公开的任意细胞时是指，使用任何操纵方式，例如，但不限于，单细胞分离、体内培养、处理和/或诱变，从细胞系、组织(例如，分离的胚胎)或流体中的母体细胞获得(例如，分离，提纯等)的细胞。细胞可以来源自其他细胞，使用，例如化学处理、辐射、诱导新的蛋白表达，例如，通过用病毒感染、用dna序列转染、用形态发生素接触(处理)等，以及对培养的母体细胞中所含有的任意细胞类型的选择(例如，通过连续培养)。衍生的细胞可以通过对生长因子、细胞因子的响应，对细胞因子处理的选择进展，粘着性，缺乏粘着性，分选过程等从混合群体中选择。

　　如本文所用，术语“细胞”是指单个细胞以及细胞群体(即多于一个)。群体可以是包括一种细胞类型的单纯群体，例如神经元细胞群体或未分化的胚胎细胞群体。另外可选地，群体可以包括多于一种的细胞类型，例如混合细胞群体。无意于限制群体中细胞的数目；例如，在一实施方式中，混合细胞群体可以包括至少一种分化细胞。在本发明中，对细胞群体可以包括的细胞类型的数目没有限定。

　　如本文所用，术语“高度富集的群体”是指细胞群体，例如培养皿中的所表达标记物的百分含量或者量高于对照群体的细胞群体，例如，与用单独的lsb处理相比较，与lsb接触的细胞培养物在第1天用purmorphamine处理并在第3天用chir处理，导致高度富集的底板中脑祖细胞群体。在其他例子中，富集群体是将表达一种或多种标记物的细胞从不表达所需标记物的细胞中分选或分离而产生的群体，例如，cd142富集的群体、a9富集的群体等。

　　术语“细胞生物学”或“细胞的生物学”是指对活细胞的研究，例如，细胞的解剖学和功能，例如，细胞的生理特性、结构、细胞器以及其与环境的相互作用、其生命周期、分裂和死亡。

　　术语“关注的核苷酸序列”是指任何如下的核苷酸序列(例如，rna或dna)，其操纵可以出于任意原因(例如，治疗疾病、赋予改进的品质、在宿主细胞中表达所关注的蛋白质、表达核酶等)被本领域普通技术人员视作是需要的。这些核苷酸序列包括但不限于，结构基因(报道子基因、选择标记物基因、致癌基因、药物抗性基因、生长因子等)的编码基因，以及不编码mrna或蛋白质产物的非编码调节序列(例如，启动子序列、聚腺苷酸化序列、终止序列、增强子序列等)。

　　如本文所用，术语“关注的蛋白”是指由关注的核酸编码的蛋白。

　　术语“基因”是指包括产生多肽或前驱体(例如，胰岛素原)所必需的编码序列的核酸(例如，dna或rna)序列。多肽可以由全长编码序列编码，或者由编码序列的任意部分编码，只要保留全长或所保留片段的所需活性或功能特性(例如，酶活性、配体结合、信号转导等)即可。该术语还涵盖结构基因的编码区，并包括在任一端上位置与5’端和3’端上的编码区相邻且距离为大约1kb或更大的序列，使得基因对应于全长mrna的长度。位于编码区5’且存在于mrna上的序列称作5’非翻译序列。位于编码区3’或下游且存在于mrna上的序列称作3’非翻译序列。术语“基因”包括基因的cdna和基因组形式。基因组形式或基因克隆含有被称作“内含子”或“间插区”或“间插序列”的非编码序列打断的编码区。内含子是转录成核rna(hnrna)的基因片段；内含子可以含有调节元件，例如增强子。内含子从核或初级转录物中除去或“剪接出”；因此，内含子在信使rna(mrna)转录物中不存在。mrna在翻译过程中发挥作用，以指定新生多肽中的氨基酸序列或顺序。

　　如本文所用，术语“基因表达”是指通过基因的“转录”(即，经由rna聚合酶的酶作用)将基因中编码的遗传信息转化成rna(例如mrna、rrna、trna或snrna)以及对于编码蛋白的基因还通过mrna的“翻译”转化成蛋白的过程。基因表达可以在该过程中的许多阶段加以调节。“上调”或“激活”是指增加基因表达产物(即rna或蛋白质)的产生的调节，而“下调”或“阻抑”是指降低产生的调节。参与上调或下调的分子(例如，转录因子)常常分别称作“激活剂”和“阻抑剂”。

　　如本文所用，术语“核酸分子编码”、“dna序列编码”、“dna编码”、“rna序列编码”和“rna编码”是指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸沿着脱氧核糖核酸或核糖核酸的链的顺序或序列。这些脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的顺序决定了氨基酸沿着多肽(蛋白质)链的顺序。由此，dna或rna编码了氨基酸序列。

　　术语“分离的”在涉及核酸使用时，如在“分离的寡核苷酸”或“分离的多核苷酸”中，是指核酸序列从起天然来源中通常缔合的至少一种组分或污染物中鉴定并分离出。分离的核酸存在的形式或场景使得其不同于天然发现的形式。相反，非分离的核酸作为核酸例如dna和rna以其天然存在的状态存在。例如，指定的dna序列(例如，基因)在宿主细胞染色体中接近于相邻的基因发现；rna序列，例如编码特定蛋白质的特定mrna序列，在细胞中发现是与许多种编码多种蛋白质的其他mrna的混合物。然而，例如，分离的编码指定蛋白的核酸包括，在常规表达指定蛋白的细胞中这样的核酸，其中核酸在染色体中的位置不同于在天然细胞中，或者与天然发现的相比在侧翼有不同的核酸序列。分离的核酸、寡核苷酸或多核苷酸可以单链或双链的形式存在。如果分离的核酸、寡核苷酸或多核苷酸要用于表达蛋白，寡核苷酸或多核苷酸将最少含有正义链或编码链(即，寡核苷酸或多核苷酸可以是单链的)，但可以含有正义链和反义链二者(即，寡核苷酸或多核苷酸可以是双链的)。

　　如本文所使用，术语“试剂盒”是指任何用于递送材料的递送系统。在细胞分化的上下文中，试剂盒可以指用于使干细胞接触的材料的组合，这样的递送系统包括如下的系统，其使得人们可以对反应试剂和/或支持材料(例如，缓冲剂、进行细胞分化的书面说明书等)进行存储、运输或将其在适当的容器(例如，管等)中从一处递送至另一处(例如，化合物、蛋白质、检测试剂(例如与酪氨酸羟化酶(th)、叉头框蛋白a2(foxa2)、lim同源盒转录因子1,α(lmx1a)等结合的抗体等)等等。例如，试剂盒包括含有以下材料的一个或多个附件(例如，盒子，或袋子、试管、eppendorf离心管、毛细管、多孔板等)：用于抑制信号传导通路的相关反应试剂，例如，用于降低转化生长因子β(tgfβ)/activin-nodal信号传导的抑制剂，例如sb431542(或sb431542替代物)等，用于降低smad信号传导的抑制剂ldn-193189(或ldn-193189替代物)等，用于降低糖原合成酶激酶3β(gsk3β)的抑制剂，例如，用于激活wingless(wnt或wnts)信号传导，也称作wnt信号传导激活剂(wnt激动剂)，例如chir99021(或chir99021替代物)等和类似物，音猬因子(shh)信号传导激活剂(例如smoothened(smo)受体小分子激动剂)，例如，音猬因子(shh)c25ii分子、purmorphamine和类似物，具有成纤维细胞生长因子8(fgf8)活性的分子，例如成纤维细胞生长因子8(fgf8)等，以及神经成熟分子，例如，脑源性神经营养因子(bdnf)、抗坏血酸(aa)、胶质细胞系源性神经营养因子、二丁酰camp和β3型转化生长因子，包括能够代替这些组分和/或支持材料的分子。试剂盒中的试剂在一实施方式中可以是在溶液中，或者是冷冻的，或者可以是冻干的。试剂盒中的试剂在一实施方式中可以是在单独的容器中，或者作为特定的组合提供，例如以下组合：lsb(ldn-193189与sb431542)，音猬因子(shh)c25ii分子与purmorphamine，音猬因子(shh)c25ii分子与purmorphamine与chir99021或者purmorphamine与chir99021、神经成熟分子和类似物。

　　附图说明

　　图1显示了示例性的人es细胞衍生的中脑底板前体取决于chir990221加入的诱导和神经原性转化，a)在分化第11天时对于foxa2(红色)、nestin(绿色，上面的小图)、lmx1a(绿色，中间的小图)和otx2(绿色，下面的小图)表达的免疫细胞化学分析。b、c)对(a)中所示数据的量化。数据来自三组分别进行三次的独立实验(平均值±sem)。单个标记物的显著性水平通过相比较于仅用lsb处理来表示：anova；dunnett检验：***p<0.001；**p<0.01；p<0.05)。d)用于三种处理条件的培养条件的示意性图示。e、f)所选择的差异表达的基因在第11天的列表，其将lsb/s/f8/chir条件与lsb(e)或lsb/s/f8(f)进行比较。g、h)中脑da前体身份(g)、前脑和腹侧非da前体身份(h)特征性的所选择标记物的时序基因表达分析。标尺对应于50μm。

　　图2显示了lsb/s/f8/chir处理中的中脑da神经元命运相比于lsb/s/f8(腹侧/下丘脑)和lsb(背部前脑)命运的示例性免疫细胞化学和分子学分析，a)第25天时对于foxa2(蓝色)结合tuj1(红色)/lmx1a(绿色)(上面的小图)和nurr1(红色)/th(绿色)(下面的小图)表达的免疫细胞化学分析，b)对lsb/s/f8/chir处理过的培养物的定量共表达分析。数据来自三组分别进行三次的独立实验(平均值±sem)。c、d)全局基因表达分析在第25天进行(对于所有三种条件均为三份样品)。最为差异表达的基因的选择列表，在lsb/s/f8/chir条件下第13天与第25天进行比较(c)，以及将lsb/s/f8/chir处理与lsb(d，左边的小图)和lsb/s/f8(d，右边的小图)进行比较。e)对于关键中脑da神经元标记物的标准化分化基因表达分析。单个标记物的显著性水平通过相比较于仅用lsb处理来表示：anova；dunnett检验：***p<0.001；**p<0.01；p<0.05)。标尺对应于50μm。

　　图3-1和3-2显示了底板衍生的相比于菊形团(rosette)衍生的中脑da神经元的示例性体外成熟、表征和功能评价。图3-1：显示了示例性的：a)th(红色)，结合有lmx1a(绿色，左边的小图)、foxa2(蓝色，左边的小图)和nurr1(绿色，右边的小图)的分化第50天的免疫细胞化学分析。b)菊形团衍生的与底板衍生的(lsb/s/f8/chir)培养物中全部细胞当中th+、foxa2+、lmx1+和nurr1+细胞的定量。c)底板和菊形团衍生的da神经元培养物中第50天时5-羟色胺+(5-ht)和gaba+神经元亚型的定量。d，e)用于测量da和代谢物的hplc分析。d)底板衍生的培养物样品中对da的电化学检测的代表性色谱图。e)底板与菊形团衍生的培养物之间da、dopac和hva水平的比较。f)底板衍生的培养物(第80天)中对th(红色)和突触蛋白(绿色)的免疫细胞化学分析。g-i)da神经元分化第80天的底板培养物的电生理学分析。斑块神经元(g)和对应的记录(h)的相衬图像(phasecontrastimage)。i)显示da神经元身份的膜电位震荡特征的功率分析(2至大约5hz)。单个标记物(小图b、c、e)的显著性水平表示为fp-与菊形团-衍生的培养物的比较：学生t检验：***p<0.001；**p<0.01；p<0.05。标尺在(a)中对应于50μm，在(f，上面的小图)中对应于20μm，在(f，下面的小图)中对应于5μm，在(g)中对应于20μm。j：mda神经元在体外(d65)的成熟。th阳性神经元仍表达foxa2并沿着mda神经元典型的长纤维延伸，以及k：通过hplc进行的da释放测量：d65老龄th+神经元在体外是有功能的。图3-2：显示了示例性的对通过本文所述的基于底板的中脑da神经元方案产生的细胞的总结，a)相比于过去的策略(例如，perrier,a.l.等人.derivationofmidbraindopamineneuronsfromhumanembryonicstemcells.procnatlacadsciusa101,12543-8(2004))，本文所述的新的方案基于产生lmx1a/foxa2阳性中脑底板(左边的小图)，然后是神经元转化(中间的小图)和da神经元成熟(右边的小图)。成熟底板产生的da神经元细胞保留了foxa2/lmx1a的表达。

　　图4显示了示例性的小鼠、大鼠和猴pd模型宿主脑中底板衍生的人da神经元的体内存活和功能。a-d)底板衍生的da神经元移植到6-ohda损伤的成年小鼠(nod-scidil2rgc空白株(nullstrain))中，a)移植后4.5月的th表达和移植物形态学，b)人特异性标记物(hncam，蓝色)、th(绿色)和foxa2(红色)的表达，c)底板衍生的移植物中foxa2+、th+和双标记细胞的定量(平均值±sem，移植后4.5月，n＝4)，d)底板衍生的(蓝色)与菊形团衍生的(绿色)移植物中安非他明(amphetamine)诱导的旋转分析。标尺在(a)中对应于500μm，在(b)中对应于100μm，在(4c)中对应于40μm。e-p)将底板衍生的da神经元移植到6-ohda损伤的成年大鼠中。th(绿色)和人特异性标记物(红色)hna共表达的免疫组织化学分析。e)和hncam(4f)。g)总(hna+)细胞、th+细胞和共表达foxa2的th+细胞的数目的立体学定量。平均移植物体积为2.6+/-0.6mm3。h-j)显示th(绿色)与中脑特异性转录因子foxa2、pitx3和nurr1(红色)的共表达的高功率图像，k-m)用底板衍生的da神经元移植物治疗的动物与假治疗(sham-treated)的动物的行为学分析，k)安非他明诱导的旋转不对称性。l)台阶试验(steppingtest)：测量感染侧和非感染侧的前肢运动不能(akinesia)，m)圆柱体试验(cylindertest)：测量饲养时身体同侧和对侧爪的偏好。移植的动物在至少三个试验中表现出显著改善(4.5-5月时p<0.01；各自n＝4-6)，n-p)th(绿色)和与dat(n)、girk2(o)和钙结合蛋白(p)共表达(红色)的免疫组织化学分析。显著性水平(小图d、k、l、m)为：**p<0.01；p<0.05。标尺在(e)中对应于200μm，在f中对应于50μm，在(h-j)中对应于20μm，在(n-p)中对应于40μm。q-t)将底板衍生的da神经元移植到1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(mptp)损伤的成年猕猴中，q)由人特异性细胞质标记物sc-121(绿色)的表达标记的移植后1月的代表性移植物位置的概观，r)具有围绕的th+纤维(箭头)晕环的移植物中的th表达，s)移植物核心中sc-121(红色)与th(绿色)的共表达分析，t)th+神经元(绿色)中foxa2(红色)的共表达分析。标尺对于(q)对应于2mm，对于(r)对应于500μm，对于(s)对应于200μm，对于(t)对应于50μm。u)移植物衍生的到宿主纹状体中的纤维突起生长(huncam+)，v)移植物衍生的细胞不分化成神经胶质细胞。但是，除th+细胞群体以外，移植物还含有一些5-羟色胺能纤维。

　　图5显示，示例性的chir99021暴露的定时决定了foxa2/lmx1a中脑底板前体的诱导。a)在指出的不同时间点开始的单独的lsb/s/f8处理或者其与chir组合处理之后分化第11天的foxa2(红色)/lmx1a(绿色)的免疫细胞化学分析，b)在(a)中所述的chir暴露的分化开始之后分化第11天foxa2+、lmx1a+和双标记细胞的百分比量化。各个标记物的显著性水平相比较于无chir的条件显示：anova；dunnett检验：***p<0.001；**p<0.01；p<0.05。标尺对应于50μm。

　　图6显示，示例性的fgf8暴露在foxa2/lmx1a中脑底板前体的诱导中不发挥主要作用。分化第11天通过免疫细胞化学得到的代表性的foxa2(红色)/lmx1a(绿色)表达图像。将细胞在存在或不存在shh(purmorphamine+shhc25ii)和fgf8的条件下暴露于lsb/chir。标尺对应于50μm。

　　图7显示，示例性的暴露于高剂量shh和/或smoothened小分子激动剂(purmorphamine)对于在chir99021的存在下有效的中脑底板诱导来说是必需的。代表性的分化第11天的foxa2(红色)/lmx1a(绿色)免疫细胞化学图像。细胞在各种浓度shh(shh-c25ii)和smoothened激动剂purmorphamine的存在下用lsb/f8/chir处理。标尺对应于50μm。

　　图8显示了在分化第11和25天用lsb/s/f8/chir处理的与用lsb和lsb/s/f8处理的培养物中差异表达的基因的示例性分析。a)在第0、1、3、5、7、11和13天自三种条件得到的全局基因表达数据的分级聚类(对于每种条件和每天样品评价一式三份)，b)使用david根据go分类进行的基因富集分析；http://david.abcc.ncifcrf.gov。在第11天的比较显示，在lsb/s/f8/chir条件下对于shh和wnt信号传导二者的富集符合chir99021介导的典型wnt信号传导的激活。另外可选的细胞命运例如“前脑发育”和“间脑”以及“同源盒”是在第11和25天高度富集的其他go项。c)对于在中脑da神经元条件下(lsb/s/f8/chir)富集的候选标记物使用allen基因人表达数据库(http://human.brain-map.org)进行的在线验证。ttf3、ebf1、ebf3和ttr基于可得的人脑区域特异性微阵列数据表达。ttr——foxa2的经典转录目标在成年黑质中仅有弱的表达，表明其主要作用可能是在发育过程中，或者表明shh处理可以在体外分化过程中人工导致高的ttr表达水平。

　　图9显示了在代表性的独立hesc和hipsc系中对于底板诱导和中脑da神经元发育的示例性分化方案。显示了来自hesc系h1和hipsc系2c6(来自散发性pd患者)和sev6(基于仙台(sendai)，无整合)的数据。使用图1d和图10中所述的基于底板的方案，然后在分化第11天对foxa2(红色)表达进行分析，在分化第25天对th(绿色)/foxa2(红色)进行分析。

　　图10显示了示例性的用于底板衍生的和菊形团衍生的da神经元培养物的分化条件的图示总结。两种方案均使用双-smad抑制来加速神经命运获得。在底板方案中ldn用于bmp抑制，而传统noggin诱导则用于菊形团培养物。缩写为：ldn：ldn-193189，sb：sb431542，shh(purmorphamine+shhc25ii)，fgf8：fgf8，bagct：bdnf+抗坏血酸+gdnf+dbcamp+tgfβ3。按照菊形团衍生的da神经元培养物图案化的初始推荐，菊形团方案中shh/fgf8在不存在purmorphamine的条件下使用单独的shhc25i。注意：菊形团阶段的purmorphamine处理在适合于底板细胞图案化的浓度下表现出毒性。basf：bdnf+抗坏血酸+shh/fgf8。

　　图11显示了示例性的底板衍生的da神经元培养物的体外成熟，a)用于dat表达(红色；第80天)的底板衍生th神经元(绿色)的免疫细胞化学分析。b)分化60天观察到大量tuj1+(红色)纤维束，其在>2mm的距离上延伸。c)在分化第80天，th+神经元(绿色)中girk2(红色)的共表达。标尺在(a)中对应于20μm，在(b)中对应于100μm，在(c)中对应于20μm。

　　图12显示了示例性的成年完整(未损伤)小鼠纹状体(nod-scidil2rgc空白株)中的短期(6周)体内存活研究的免疫组织化学分析。底板衍生移植物的分析(第25天细胞；150x103细胞/动物)，a)代表性的显示被th+宿主纤维围绕的th+细胞的移植物核心的图像。移植后6周移植物中存在有平均6,200个th+细胞(n＝3)，b)表达foxa2的细胞(红色)仅在移植物中发现，但在围绕的表明移植物来源和细胞中脑身份的宿主纹状体中并未发现。几乎所有的th+神经元(绿色)均共表达foxa2(红色)。但是，相当大部分的foxa2+细胞并未共表达th，这表明这些细胞尚未获得成熟的da表型，或者代表着另一种对于da神经元标记物为阴性的foxa2+神经元群体。标尺对应于50μm。

　　图13显示了示例性的长期(4.5月)移植的6-ohda损伤的小鼠(nod-scidil2rgc空白株)的组织学分析，其对底板与菊形团衍生的移植物的表现进行了比较。底板衍生的移植物的分析：a)最大的底板衍生移植物之一的例子。移植物保留着外接良好的hncam+(红色)细胞结构。b)在移植物外围处观察到坚固的hncam+纤维突起生长，c)移植物中的5-羟色胺能(5-ht+)纤维(绿色)对于hncam(红色)在很大程度上是阴性的，表明是宿主来源，d)移植物中的gaba能(gabaergic)神经元和纤维(绿色)。菊形团衍生移植物的分析：e)压缩宿主脑组织的神经过度生长。大多数细胞对于ncam(红色)和dcx(绿色)二者都是阳性的，表明了神经元命运，f)ncam+/dcx+纤维延伸至未移植的脑对侧，g)在移植物核心内观察到多个dcx+聚簇，h)在移植物外周处观察到极少的th+细胞(绿色)和纤维，几乎所有的菊形团衍生th+细胞在体内对于foxa2(蓝色)是阴性的。在第4.5月对底板衍生的与菊形团衍生的移植物的免疫组织化学分析。代表性的图像用于表示增殖标记物ki67(红色)和神经元前体标记物pax6(绿色)的表达(i)，foxa2/dcx(j)、foxg1/hncam(j，嵌入图)和星形胶质细胞标记物gfap(绿色)(k)的表达。标尺在(a)中对应于500μm，在(b-d)中对应于50μm，在(e)中对应于500μm，在(g-h)中对应于50μm，在(i)中对应于50μm，在(j)中对应于40μm，在(k)中对应于20μm。

　　图14显示了示例性的长期(5月)移植的6-ohda损伤的sd大鼠的组织学分析，a)绝大多数hna+(红色)细胞表达tuj1(绿色)，表明了神经元命运身份(identity)，b)移植物内的gfap+纤维(绿色)并未共表达hna(红色)，表明宿主来源，c)观察到少数人5-羟色胺能(5-ht+)细胞体(绿色)，而大多数5-羟色胺能纤维是宿主衍生的，与小鼠宿主中的数据类似(图13c)。d)移植物内th+神经元(绿色)的额外例子，其特征在于hncam(红色)的表达，以确认宿主脑中细胞的人身份。标尺在小图中对应于25μm。

　　图15显示了示例性的灵长类动物脑中的底板衍生移植物的组织学分析。将源自h9hesc和源自h9-gfphesc(第25天培养物；1.25x106细胞/束，3束/半球，共计6束)的底板衍生da神经元移植到mptp损伤的成年猕猴的纹状体中(＝2)。a)左上和右边的小图：代表性的移植位点(移植后1月)的高分辨图像重构。移植物细胞结构通过人特异性标记物sc-121(与非人哺乳动物组织没有交叉反应性)的免疫组织化学表示。左下小图：从移植物核心延伸的sc-121+纤维。右下小图：显示神经元前体形态的sc-121+细胞的较高分辨率的图像，b)对移植物核心中gfp表达的分析进一步证实了细胞的人身份，补充了sc-121数据。注意：对于两种动物，每一种一个半球移植未标记的h9衍生细胞，而另一半球接受衍生自h9-gfp细胞的细胞(在ef1a启动子控制下的gfp表达)，c)使用dab检测的gfp+移植物较高分辨率的图像，显示了移植物外周处表现出成神经细胞形态的大量gfp+细胞，d)移植物核心中对于gfp和sc-121为阴性的区域的免疫组织化学分析。这些区域含有大量的基于ibal表达(红色)的宿主小胶质细胞以及极少数ed1+巨噬细胞(蓝色)，这表明尽管有环孢霉素免疫抑制，仍有持续的炎症。标尺在(a，顶部小图)中对应于500μm，在(a，左下小图)中对应于50μm，在(a，右下小图)中对应于20μm，在(b)中对应于2mm，在(c，左边的小图)中对应于500μm，在(c，右上小图)中对应于50μm，在(c，右下小图)中对