NEP1-40 和 NT-3 基因共转染施万细胞来源外泌体对神经干细胞存活与分化

　　神经干细胞（neural stem cell，NSC）具有自我更新、多向分化和神经整合等特点，已成为一种治疗脊髓损伤的极具吸引力的移植材料。然而，由于局部微环境的变化，移植的 NSC 存活率不高，同时分化为神经元及轴突生长的效率低下[]。施万细胞来源外泌体（Schwann cell-derived exosome，SCDE）可参与神经保护、轴突发芽和髓鞘再生[]。Nogo 胞外肽端残基 1-40（Nogo extracellular peptide residues 1-40，NEP1-40）是 Nogo 蛋白受体的竞争性拮抗剂，可阻断 Nogo 蛋白和中枢髓鞘相关蛋白对轴突生长的抑制作用，但对于 NSC 移植后的分化无明显诱导作用，且对于轴突的生长缺乏必要的营养作用[]。神经营养因子 3（neurotrophin 3，NT-3）属于神经生长因子家族，可营养外周和中枢神经系统的神经细胞，促进 NSC 的存活和分化[]。SCDE 与治疗因子 NEP1-40 及 NT-3 的组合可能解决 NSC 移植后的治疗缺陷，但目前研究仅限 SCDE 对单一治疗因子的加载[]，能否同时加载 2 种目的因子还需进一步讨论。另外尽管研究已明确 NT-3 对 NSC 的作用[]，但与 NEP1-40 组合后是否也可促进 NSC 的存活与分化尚不清楚。本研究从基因工程角度出发，用 NEP1-40 和 NT-3 双基因修饰施万细胞后提取其外泌体并进行鉴定，体外观察 SCDE 对 NSC 存活与分化的影响，为后续的 SCDE 与 NSC 共移植治疗脊髓损伤的体内试验奠定基础。

　　主要材料包括：大鼠施万细胞（RSC96）细胞系（武汉普诺赛生命科技有限公司）；ExoQuick-TC 外泌体提取试剂盒（美国 Invitrogen 公司）；CCK-8（cell counting kit-8）试剂盒（日本同仁化学研究所）；CD63、flotillin-1、NEP1-40、NT-3 第一抗体（美国 Proteintech Group 公司）、神经元特异核蛋白（neuronal nuclei，NeuN）第一抗体（英国 Abcam 公司）、胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）第一抗体（英国 Abcam 公司）、半乳糖神经酰胺酶（galactosylceramidase，GALC）第一抗体（英国 Abcam 公司）、10%胎牛血清（美国 Gibco 公司）、营养混合液 F-12（美国 Sigma 公司）；NEP1-40 基因慢病毒表达载体及 NT-3 基因慢病毒表达载体为本实验室前期构建[]。NSC 采用改良培养法成功培养的 Sprague-Dawley 大鼠室管膜区脑源性 NSC，提取与鉴定为本实验室前期构建[-]。研究获得四川大学华西医院实验动物伦理委员会批准（伦理号为 2021493A）。

　　主要仪器包括：XDS-1A 光学显微镜（北京泰克汇光科技有限公司）、XDS-2 倒置生物显微镜（北京泰克汇光科技有限公司）、ABI QuantStudio 6 实时荧光定量聚合酶链反应仪（美国赛默飞世尔科技公司）、Thermo 酶标仪（美国赛默飞世尔科技公司）、Tecnai G2 生物型透射电子显微镜（电镜）（美国 FEI 公司）、ZetaView 纳米粒子追踪分析仪（德国 Particle Metrix 公司）、水平电泳仪（北京君意东方电泳设备有限公司）。

　　取对数生长期的施万细胞，首先使用感染复数为 10 的 NEP1-40 慢病毒载体转染 48 h，荧光显微镜观察转染后细胞内荧光表达情况；然后以同样的方法完成 NT-3 转染 48 h，根据荧光阳性率确定感染效率。慢病毒转染细胞的感染复数与转染时间由前期实验确定[]。其中 NEP1-40 带增强型绿色荧光蛋白标签，NT-3 带 mCherry（红色荧光蛋白）标签。再通过实时荧光定量聚合酶链反应（所用引物序列见）及蛋白质印迹法（以β-actin 为内参），检测并比较空载质粒转染施万细胞（空载质粒组）与 NEP1-40 和 NT-3 双基因转染施万细胞（双基因组）的信使 RNA 和蛋白质表达差异，结果以目标信使 RNA/内参和目标蛋白/内参表示信使 RNA 和蛋白质的相对表达水平。

　　① 双基因转染 SCDE 的提取和鉴定：培养转染成功的施万细胞，利用 ExoQuick-TC 试剂盒提取施万细胞培养基上清中的外泌体：培养基先经 3 000×g 离心 15 min，去除凋亡细胞和细胞碎片。每 10 mL 培养上层清液中加入 3.3 mL 外泌体沉淀溶液后冷藏过夜，然后将混合液体 10 000×g 离心 30min，弃上层清液；分离的外泌体重悬于磷酸缓冲盐溶液，储存于?80℃或直接使用。利用透射电镜观察外泌体形态，纳米粒子追踪分析技术分析外泌体直径分布。

　　② 检测 SCDE 中 NEP1-40 及 NT-3 的表达：采用蛋白质印迹法检测 SCDE 中 NEP1-40、NT-3 蛋白的含量，同时检测外泌体特异性标志物 CD63 蛋白的含量，以 flotillin-1 为内参，结果以目标蛋白/内参表示蛋白质的相对表达水平。

　　选取传代 3 次的 NSC，以每孔 1.5×105/mL 的密度接种到 24 孔板中，分为常规培养组、单纯外泌体培养组和双基因外泌体培养组。各组分化培养液为：常规培养组（10%胎牛血清+营养混合液 F-12）、单纯外泌体培养组（10%胎牛血清+营养混合液 F-12+200 μg 空载质粒修饰 SCDE）、双基因外泌体培养组（10%胎牛血清+营养混合液 F-12+200 μg NEP1-40 和 NT-3 修饰 SCDE）。取各组细胞悬液 100 μL 接种于 96 孔板中，向每孔中加入 10 μL CCK-8 试剂溶液；培养箱内孵育 4 h。采用酶标仪测定 OD450（450nm 波长的光密度），其值大小代表细胞活性。将各组细胞共培养 7 d 后，通过免疫荧光检测 NeuN、GFAP 和 GALC 阳性的细胞来评价细胞的存活与分化情况，其中 NeuN 用于判断 NSC 分化为神经元的情况，GFAP 用于判断 NSC 分化为星形胶质细胞的情况，GALC 用于判断 NSC 分化为少突胶质细胞。用 Image J 软件进行细胞计数。评价细胞存活时，以常规培养组为对照组，计算方法为观察组染色阳性细胞数/常规培养组染色阳性细胞数，计数结果以相对值表示。评价分化情况时，计算方法为各组染色阳性细胞数/各组细胞总数，计算结果以相对百分比表示。

　　采用 SPSS 22.0 统计软件进行分析。计量资料使用均数±标准差表示，满足正态分布且方差齐性时，两组之间的数据比较采用 t 检验，方差不齐时采用 t’检验；多组之间的数据比较采用单因素方差分析，多组比较差异有统计学意义时，两两比较采用 LSD 检验。双侧检验水准α=0.05。

　　NEP1-40 转染施万细胞 48 h 后，再进行 NT-3 转染 48 h。由可见，2 种基因的荧光强度均较高，同时细胞形态较好。双基因组 NEP1-40 和 NT-3 的信使 RNA 和蛋白相对表达水平均高于空载质粒组（P<0.05），见 和。

　　透射电镜观察可见 SCDE 是一种类圆形双层膜包裹的小囊泡，内部含低电子密度物质（）；纳米粒子追踪分析技术显示，大多数外泌体直径为 50～200 nm，其中浓度最高的外泌体直径是 117.4 nm。双基因组 SCDE 中 NEP1-40 和 NT-3 的蛋白相对表达水平均高于空载质粒组（P<0.05），两组的 SCDE 中 CD63 的蛋白相对表达水平差异无统计学意义（P>0.05），见 和。

　　细胞活性方面，双基因外泌体培养组细胞活性最强，单纯外泌体培养组次之，常规培养组最弱，组间两两比较差异有统计学意义（P<0.05）。细胞存活情况方面，双基因外泌体培养组的 NeuN 阳性细胞和 GALC 阳性细胞存活情况最佳，单纯外泌体培养组次之，常规培养组最差，组间两两比较差异有统计学意义（P<0.05）；常规培养组的 GFAP 阳性细胞存活情况最佳，单纯外泌体培养组次之，双基因外泌体培养组最差，组间两两比较差异有统计学意义（P<0.05）。细胞分化情况方面，双基因外泌体培养组的 NeuN 阳性细胞和 GALC 阳性细胞分化情况最佳，单纯外泌体培养组次之，常规培养组最差，组间两两比较差异有统计学意义（P<0.05）；常规培养组的 GFAP 阳性细胞分化情况最佳，单纯外泌体培养组次之，双基因外泌体培养组最差，组间两两比较差异有统计学意义（P<0.05）。见 和～。

　　NSC 移植修复脊髓损伤是一种可行、有效的方法[]。但随着相关研究工作的深入，近年来发现由于脊髓损伤处局部微环境的影响，单纯的 NSC 移植存在诸多缺陷[]，主要表现为移植细胞存活有限、神经元分化效率低下、轴突生长受抑。随着研究的进展，经过基因调控的 NSC 移植一度成为研究热点[]。通过转基因技术将特定的基因片段导入细胞中，可使其在移植部位表达，改善局部微环境，以维持细胞的生存和增殖。Nogo 蛋白是一种重要的轴突生长抑制蛋白，通过与其受体 Nogo 蛋白受体结合，激活下游信号 RhoA/ROCK 通路，从而抑制轴突再生[]。研究报道，在动物模型中，通过功能阻断抗体、使 Nogo 蛋白基因缺失或阻滞 Nogo 蛋白受体的中和作用，既能促进受损纤维束的再生，也能促进受损皮质脊髓束和其他神经纤维的代偿性萌发，而 NEP1-40 是 Nogo 蛋白受体的竞争性拮抗剂，可阻断 Nogo 蛋白或中枢髓鞘相关蛋白对轴突生长的抑制作用[-]。但 NEP1-40 对 NSC 移植后的分化无明显诱导作用，同时其对于轴突的生长缺乏必要的营养作用[]。NT-3 属于神经生长因子家族，是编码外周神经系统和中枢神经系统神经元的营养蛋白，在脊髓损伤动物模型中，NT-3 已被发现能够促进 NSC 的长期存活和增殖，并具有较高的 NSC 向神经元分化的分化率[]。我们前期成功构建了 NEP1-40 和 NT-3 双基因修饰的 NSC，并用于脊髓损伤的修复，虽然取得了一定成果，但同时也发现该方法存在一些问题，如致瘤风险增加、细胞活性下降、慢病毒本身的危险性、脊髓损伤局部缺乏有效的微环境的支持和引导等[]。以上不足大大限制了 NSC 在脊髓损伤修复上的应用，使得我们不得不进一步探索新的 NSC 调控方法。

　　外泌体在调控 NSC 方面具有重要作用，一方面外泌体具有定向分化的作用，张姣飞等[]将不同浓度的人羊膜上皮干细胞来源外泌体与小鼠 NSC 共培养。结果显示，与对照组相比，人羊膜上皮干细胞来源外泌体处理后的 NSC 中有更多的神经元分化，推测可能是由于外泌体中所含活性物质，如神经营养因子、生长因子、微 RNA 等，可能参与 NSC 的分化调控。另一方面，外泌体对 NSC 具有促增殖作用，Zhang等[]发现人脐静脉内皮细胞可分泌外泌体，当与 NSC 共培养时，NSC 的增殖增加，而凋亡减少，同时保持了其多向分化的潜能。同样地，周少婷等[]的研究也有类似的结果，其发现微血管内皮细胞外泌体能够提高 NSC 活性，促进其增殖。

　　施万细胞是外周神经系统的髓鞘胶质细胞，可引导周围神经损伤后的轴突再生，施万细胞与 NSC 联合移植治疗脊髓损伤可引起明显的神经发生和功能恢复[-]。近期越来越多的研究发现施万细胞参与修复神经损伤主要是分泌外泌体的结果，外泌体中含有利于神经细胞存活和轴突生长的物质[, -]。外泌体是一种直径为 30～200 nm 的细胞外小泡，由磷脂双层膜构成，包裹并保护其所携带的核酸、蛋白质和脂质，它们通过细胞的胞吐作用来调节靶向受体细胞[]。外泌体被广泛应用于组织再生、药物、基因传递以及疾病诊断等方面的研究。对于脊髓损伤，SCDE 可能是一种新的治疗策略。通过 SCDE 的蛋白质组学分析，Wei 等[]鉴定出 10 种与中枢神经系统修复密切相关的蛋白和 2 种与炎症抑制相关的蛋白；同时，通过基因组学分析，他们指出外泌体主要参与信号转导和细胞间通讯，在中枢神经系统修复中发挥重要作用。Lopez-Leal 等[]对 SCDE 进行了基因测序，观察到促再生基因在外泌体中高度富集，同时外泌体中含有控制神经生长的微 RNA。由此，他们推测 SCDE 可能参与轴突再生的过程，促进神经损伤修复。但直接使用 SCDE 观察到其对 NSC 分化能力的改善程度较低，直接将施万细胞与 NSC 共移植的修复效率不高[-]，这可能因为参与修复神经损伤的的因子所占比例太低且量太少，因此直接应用 SCDE 修复脊髓损伤的效率可能不高。而利用基于亲代细胞的工程方法设计外泌体，利用基因工程技术将治疗性分子加载到外泌体，可能是解决这一问题的有效的生物技术治疗策略[]。

　　本研究通过将含有 NEP1-40 和 NT-3 基因的慢病毒转染入施万细胞，分别在核酸水平和蛋白表达水平进行了实验。实时荧光定量聚合酶链反应结果表明，NEP1-40 和 NT-3 两种目的基因均成功转染入施万细胞，同时通过蛋白质印迹法检测蛋白质表达情况的结果显示，施万细胞能表达两种目的基因编码的蛋白。通过外泌体提取与鉴定，说明外泌体能够有效地运载目的基因 NEP1-40 与 NT-3 的蛋白产物。

　　NeuN 主要表达于成熟的神经元细胞核，是神经元成熟的标志。本研究结果显示，双基因外泌体培养组 NeuN 阳性染色细胞较常规培养组、单纯外泌体培养组明显增多，提示神经元的分化增殖受到促进，这为神经修复提供了根本基础。GALC 主要存在于中枢神经系统的少突胶质细胞中，是少突胶质细胞的特异性标志物，少突胶质细胞是中枢神经系统的髓鞘形成细胞，维持神经元正常的电生理传导功能，促进少突胶质细胞的存活，还可促进髓鞘再生及脊髓损伤后的神经恢复[]。本研究结果显示，双基因外泌体培养组 GALC 阳性染色细胞较常规培养组、单纯外泌体培养组明显增多，提示少突胶质细胞的分化增殖受到促进。GFAP 主要存在于中枢神经系统的星形胶质细胞中，是星形胶质细胞的特异性标志物，脊髓损伤后星形胶质细胞活化并分泌多种细胞外基质，共同组成胶质瘢痕，是阻碍神经轴突再生的重要因素[]。本研究结果显示，双基因外泌体培养组 GFAP 阳性染色细胞较常规培养组、单纯外泌体培养组明显减少，提示星形胶质细胞的分化增殖受到抑制，这有利于轴突再生及神经功能恢复。此外，本研究对常规培养组、单纯外泌体培养组、双基因外泌体培养组中 NeuN 与 GFAP 阳性细胞百分比进行了比较，差异均具有统计学意义，说明 NEP1-40 和 NT-3 基因共转导 SCDE 可促进 NSC 的定向分化。

　　综上，本实验针对单纯 NSC 移植的不足，从基因工程角度进行了新方法的探索和研究，结果提示 NEP1-40 和 NT-3 基因共转染 SCDE 在体外能有效促进 NSC 的定向分化与存活。但本研究未验证 NEP1-40 对轴突生长的促进作用，后续我们将在大鼠脊髓损伤模型中讨论轴突的再生及其对大鼠脊髓损伤后行为学恢复的影响。

　　利益冲突：所有作者声明不存在利益冲突。