北大邓宏魁课题组利用化学小分子成功实现体外肝细胞功能长期维持

　　导读

　　2019年4月26日，北京大学生命科学学院邓宏魁教授课题组、解放军总医院卢实春教授课题组和复旦大学袁正宏教授课题组合作，在《科学》（Science）杂志上发表了题为“原代人肝脏细胞在体外的长期功能性维持（Long-term functional maintenance of primary human hepatocytes in vitro）”的研究论文，首次证明利用化学小分子调控细胞信号通路，实现了功能细胞在体外的长期维持，这为大量制备功能成熟细胞及其应用提供了可能

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　　如何诱导获得功能成熟的细胞并在体外保持其功能性是再生医学的关键瓶颈。研究团队致力于在体外获得大量功能性细胞。在个体发育过程中，多种发育信号精确调控，分化产生功能各异的细胞并长期稳定地维持其生理功能。然而，这些功能细胞一旦离开体内微环境便会迅速去分化并失去功能。此外,由于缺乏适当的培养条件与微环境，体外源于干细胞诱导分化所获得的功能细胞，很难真正成熟并长期维持其功能，是再生医学研究和应用中长期面临的挑战。过去几十年里，人们尝试了改变培养材料、共培养及三维培养等多种方法，但始终未能建立一个简单高效且稳定的功能细胞体外培养体系。为解决这一问题，邓宏魁课题组组以体外培养过程中快速失去功能的人原代肝细胞为研究对象，筛选到五种化学小分子组合（5 compounds，5C）并利用它们在体外成功实现了肝细胞功能的长期维持。在超过一个月的培养过程中，5C组合抑制了肝细胞的去分化，细胞整体基因表达谱与体内肝细胞高度相似，并长期维持了白蛋白分泌、尿素合成、药物代谢等肝细胞功能。

　　人原代肝细胞在五个化学小分子的协同作用下，能够在体外长期维持功能。这些长期维持功能的人肝细胞在药物研发方面具有广泛的应用价值；另一方面，它们可以支持乙肝病毒（HBV）完整的病毒复制周期，包括持续的产生共价闭合环状DNA（cccDNA），这为抗乙肝病毒药物提供了理想的高通量筛选模型

　　肝细胞在体外药物代谢及药物研发方面具有重要的实用价值，然而长期以来功能维持条件的缺失极大限制了肝细胞的应用。在邓宏魁课题组新建立的5C培养体系中，体外培养的肝细胞能合成与体内水平相似的药物代谢酶，并具有长期维持药物代谢的能力，极大拓展了其在药物代谢、药物相互作用和药物毒性等方面的应用。与此同时，研究团队基于5C培养条件，成功建立了乙型肝炎病毒感染模型：持续高水平表达乙肝表面抗原、e抗原、合成乙肝病毒DNA等感染指标，尤其是能够长期稳定产生乙肝病毒复制必需的cccDNA。这一模型的建立，对于乙肝病毒的深入研究与药物研发具有重要意义。我国约有1.2亿人携带乙肝病毒，目前仍无有效的治愈方法。因为乙肝病毒侵入肝细胞后,形成了一种很难被清除的病毒复制模板cccDNA，目前还没有针对这个病毒复制关键靶点的药物。相形之下，丙型肝炎病毒的发现虽然晚于乙肝病毒，但基于有效的体外病毒感染模型已成功筛选并获得治愈丙肝的药物。5C培养条件下的肝细胞支持乙肝病毒的高效感染，并能够长期产生cccDNA，可作为理想的药物筛选模型，为治愈乙型肝炎带来希望。

　　相比于传统遗传学方法，化学小分子能够实现对多个信号通路靶点的精细调控。过去几年，邓宏魁课题组在化学小分子调控细胞命运方面取得一系列突破性进展：诱导体细胞重编程为多潜能干细胞(CiPS细胞）；诱导皮肤成纤维细胞为功能神经元细胞(CiN）；建立了具备全能性功能特征的多潜能干细胞(EPS细胞)。他们利用化学小分子实现了体外肝细胞功能的长期维持。这项工作表明化学小分子在精细调控细胞命运和功能上的优越性，这一方法也为其它类型细胞体外功能的长期维持提供了新途径。

　　邓宏魁、卢实春和袁正宏为该论文的共同通讯作者，向晨罡博士、杜媛媛博士与孟高帆博士为该论文的共同第一作者。该工作获得北大-清华生命科学联合中心、国家重点研发计划、国家自然科学基金等支持。

　　中国工程院院士闻玉梅认为该篇论文是我国学者研究乙肝、丙肝以及其他肝脏疾病的机理的一项重大突破。作者们通过用FSK, SB431542, DAPT, IWP2及LDN193189五种化合物，成功地实现了在体外将人肝细胞延长培养至4周。用此技术体外培养的肝细胞，不仅保持了肝细胞的生理功能，最有意义的是，这些在体外维持数周的肝细胞可成功地被乙肝病毒感染，表达HBsAg与HBeAg。通过对比，发现乙肝病毒与丙肝病毒感染过程有较大不同。这一研究最重要的价值是细胞被乙肝病毒感染后，可以完成整个病毒复制周期， 包括产生共价闭合环状DNA（cccDNA）；而 cccDNA正是目前乙肝病毒难以被清除，疾病难以被治愈的关键。通过这一平台，将可更深入提出解决cccDNA的策略。作者们还在这一平台上，对现有临床实用的抗乙肝病毒核苷类药物与干扰素进行了考核，证实了核苷类药物可抑制经细胞培养的乙肝病毒，经干扰素处理后细胞可上调干扰素激活的基因控制乙肝病毒。用此建立了较长期的人肝细胞体外培养平台，不仅将为研究乙肝治愈推进一大步，还提供了创新性研发抗肝炎病毒药物的重要工具。

　　https://science.sciencemag.org/content/364/6438/399

　　来源 | 北大新闻网、复旦新闻网 编辑 | 化学加

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